一种3‑甲硫基丙酸的制备方法与流程

一种3-甲硫基丙酸的制备方法技术领域本发明属微生物来源的化合物分离鉴定领域，具体涉及一种3-甲硫基丙酸的制备方法。

背景技术：
微生物具有分布广、种类多、易变异、次级代谢产物丰富且结构新颖等特点，因此筛选微生物来源的化合物获得先导化合物以用于新药开发有着不可估量的潜力。利用微生物制备的丰富多样的化合物资源库，一些原本只能通过化学合成方法才能得到的化合物如苯甲酰甲酸甲酯（公开号：CN102719497A）、（S）-环氧氯丙烷（公开号：CN102533921A）、邻苯二甲酸二丁酯（公开号：CN102703534A）等均可利用微生物发酵或转化获得，并且微生物发酵及代谢产物分离纯化过程与化学合成的方法相比，具有条件温和、环境友好、成本低、可在人工控制的条件下实现大规模生产等优点。3-甲硫基丙酸的分子式如式1所示：式1据报道，3-甲硫基丙酸具有植物毒性作用（PerreauxD,etal.PhysiolPlantPath.1982,20（3）：313-319）。

技术实现要素：
因此，本发明解决的技术问题是针对目前3-甲硫基丙酸的微生物制备方法较为缺乏的问题，提供一种利用蜡状芽孢杆菌（Bacilluscereus）制备3-甲硫基丙酸的方法。为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一为：一种3-甲硫基丙酸的制备方法，包括以下步骤：（1）发酵培养蜡状芽孢杆菌（Bacilluscereus），将所得发酵液固液分离后收集菌体，用有机溶剂浸泡菌体，所述有机溶剂选自丙酮，甲醇或乙醇中的一种或几种，破碎菌体，离心取上清液，将上清液浓缩后利用乙酸乙酯萃取，将所得萃取液浓缩至干；（2）将步骤（1）所得产物用无水乙醇溶解，采用反相硅胶柱层析，利用甲醇-水混合液或甲醇-氯仿混合液进行梯度洗脱，所述混合液中甲醇的浓度为0～100%，所述百分比为体积百分比，收集甲醇浓度为30～70%的洗脱液浓缩至干；（3）将步骤（2）所得产物利用无水乙醇溶解，加入硅胶搅拌，采用硅胶柱层析，利用石油醚-丙酮混合液洗脱，所述混合液中石油醚:丙酮的体积比为10:1～1:10，收集洗脱液浓缩干燥即得。步骤（1）为：发酵培养蜡状芽孢杆菌（Bacilluscereus），将所得发酵液固液分离后收集菌体，用有机溶剂浸泡菌体，所述有机溶剂选自丙酮，甲醇或乙醇中的一种或几种，破碎菌体，离心取上清液，将上清液浓缩后利用乙酸乙酯萃取，将所得萃取液浓缩至干。其中所述的蜡状芽孢杆菌（Bacilluscereus）为常规蜡状芽孢杆菌，所述菌株较佳地为蜡状芽孢杆菌（BacillusCereus）CGMCCNO.1.126。其中所述发酵为常规发酵技术。所述发酵的培养基配方较佳地为：玉米淀粉3%，花生饼粉1.5%，麦芽糖0.6%，玉米浆0.4%，蛋氨酸0.1%，氯化钴0.6×10-3%，微量元素溶液0.1×10-3%，实验用水，pH7.2。其中所述微量元素溶液的配方较佳地为：FeCl3.6H2O0.27g/L、ZnSO4.7H2O0.08g/L、CoCl2.6H2O0.07g/L、Na2MO4.2H2O0.07g/L、CuSO4.5H2O0.08g/L、H3BO30.02g/L、MnSO4.H2O0.05g/L，实验用水，pH7.4。其中所述发酵培养的条件为常规培养条件，较佳地为：培养温度25～35℃，震荡速度150～250r/min，培养时间48～72h。其中所述固液分离为常规技术，较佳地为采用离心方法。所述固液分离的离心条件较佳地为：3000～5000rpm，离心1～2小时。其中所述有机溶剂为常规有机溶剂，较佳地为选自丙酮，甲醇或乙醇中的一种或几种；优选地为丙酮。其中所述破碎菌体的方法为常规破碎菌体方法，较佳地为超声处理法或高压匀浆破壁法，优选为超声处理法。所述超声处理法的条件较佳地为：50～70kHz超声处理4～6小时。其中所述离心技术为常规技术，所述离心的条件较佳地为：3000～5000rpm，离心20～40分钟。步骤（2）为：将步骤（1）所得产物用无水乙醇溶解，采用反相硅胶柱层析，利用甲醇-水混合液或甲醇-氯仿混合液进行梯度洗脱，所述混合液中甲醇的浓度为0～100%，所述百分比为体积百分比，收集甲醇浓度为30～70%的洗脱液浓缩至干。其中所述反相硅胶层析柱为常规反相硅胶层析柱，较佳地为AQ-C18反相层析柱，所述反向硅胶层析柱的填充量较佳地为50～80g，更佳地为80g。其中所述甲醇-水混合液或甲醇-氯仿混合液为常规洗脱液，较佳地是甲醇-氯仿混合液，更佳地为甲醇-水混合液，所述混合液中甲醇的浓度较佳地为0～100%，更佳地为0%、30%、50%、70%以及100%甲醇-水混合液，优选地为30%甲醇-水混合液，所述百分比为体积百分比。所述甲醇混合液的用量较佳地为1～2L，优选地为2L。所述洗脱的流速较佳地为20～40ml/min，更佳地为20ml/min。其中所述浓缩为常规浓缩技术，较佳地为减压浓缩。步骤（3）将步骤（2）所得产物利用无水乙醇溶解，加入硅胶搅拌，采用硅胶柱层析，利用石油醚-丙酮混合液洗脱，所述混合液中石油醚:丙酮的体积比为10:1～1:10，收集洗脱液浓缩干燥即得。其中所述硅胶为常规硅胶，较佳地为200～300目硅胶。所述的硅胶层析柱较为常规硅胶层析柱，较佳地为正相硅胶层析柱或反相硅胶层析柱，更佳地为正相硅胶层析柱，所述正相硅胶层析柱较佳地为200～300目硅胶层析柱，更佳地为300目硅胶层析柱，所述正相硅胶层析柱的装填量较佳地为5～10g，更佳地为10g。其中所述洗脱所使用的洗脱液较佳地为：石油醚-乙酸乙酯混合液、氯仿-甲醇洗脱液或石油醚-丙酮混合液，更佳地为石油醚-丙酮混合液，所述石油醚-丙酮混合液中石油醚与丙酮的体积比较佳地为10:1～1:10，更佳地为10:1，所述洗脱的速度较佳地为5～15ml/min。其中所述浓缩为常规浓缩技术，较佳地为减压浓缩，所述减压浓缩的条件较佳地为：40～45℃，真空度700～800mmHg。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明所用试剂和原料均市售可得。本发明的积极进步效果在于：本发明所述3-甲硫基丙酸的制备方法具有材料来源方便、制备周期短、更加绿色环保和工艺简单的优势。附图说明图1为蜡状芽孢杆菌发酵液预处理流程图。图2为3-甲硫基丙酸分离纯化的流程图。具体实施方式下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，所述试剂为常规试剂，或按照商品说明书选择。实施例1蜡状芽孢杆菌的发酵：将保藏在甘油管（50%的甘油）中的蜡状芽孢杆菌（Bacilluscereus）菌种(CGMCCNO.1.126)接种至含30ml种子培养基的250ml三角摇瓶中，30℃，200r/min振荡培养24h，作为种子液。种子培养基：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，NaCl0.5%，实验用水，pH7.2。接种1ml的种子液至750ml的三角摇瓶（含100ml发酵培养基）中，30℃，200r/min的条件下培养72h。共富集8L菌株蜡状芽孢杆菌发酵液。发酵培养基：玉米淀粉3%，花生饼粉1.5%，麦芽糖0.6%，玉米浆0.4%，蛋氨酸0.1%，氯化钴0.6×10-3%，微量元素溶液0.1×10-3%，水，pH7.2。微量元素溶液的配制如下：FeCl3.6H2O0.27g/L、ZnSO4.7H2O0.08g/L、CoCl2.6H2O0.07g/L、Na2MO4.2H2O0.07g/L、CuSO4.5H2O0.08g/L、H3BO30.02g/L、MnSO4.H2O0.05g/L，水，pH7.4。实施例2制备3-甲硫基丙酸1.发酵液预处理：富集得到8L蜡状芽孢杆菌发酵液后，4000r/min离心60min，弃去上清，加入2L丙酮浸泡菌体，辅以超声(42KHZ)处理6h，4000r/min离心30min，取上清，旋转蒸发(40-45℃，真空度758mmHg)至最小体积，用1L乙酸乙酯萃取，萃取液减压浓缩至干，得到蜡状芽孢杆菌菌体的乙酸乙酯萃取组分，将其命名为BS02-E，共3g，蜡状芽孢杆菌发酵液的预处理过程如图1所示。2.产物分离纯化：将所得的BS02-E组分用5ml无水乙醇溶解，采用反相硅胶柱层析（80g，AQ-C18)（YMC公司，批号：9955），依次用水、30%、50%、70%、100%甲醇-水混合液洗脱，流速20ml/min，每个梯度用2L洗脱液洗脱，将30%甲醇洗脱液减压浓缩至干，低温（-4℃）保存，备用，所述分离纯化过程如图2所示。产物的HPLC的色谱分析条件如下：色谱柱：UltimateAQ-C18(5μm)(4.6×150mm)，检测波长：254nm，流动相：A)甲醇B)水，流速：1ml/min，柱温：40℃，进样：20μl，洗脱浓度：30%甲醇。所得产物的出峰时间：6.99min。3.BS02-E30%甲醇洗脱组分的分离纯化将所得BS02-E30%洗脱组分用3-5ml无水乙醇溶解，600mg硅胶（200-300目，国药集团化学试剂有限公司）拌样，采用正相硅胶柱层析（国药集团化学试剂有限公司，批号：F20110913）（200～300目，10g），用40ml石油醚：丙酮=10:1(体积比)的洗脱液洗脱。试管收集，每管收集5ml，TLC（薄层色谱法）检测合并，合并液减压浓缩至干得单一化合物BS02-C-1（200mg），其理化性质及核磁共振波谱数据如下：浅黄色油状液体，可溶于二甲基亚砜、氯仿、乙醇等有机溶剂。ESI-MSm/z:119.02[M-H]-。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ:10.40(1H，brs，-COOH)，2.74(2H，m，-CH2-S-)，2.64(2H，m，-CH2-COOH)，2.10(3H，s，-S-CH3)；13C-NMR(100MHz，CDCl3)δ:178.0(-COOH)，34.2(-CH2-COOH)，28.7(-CH2-S-)，15.3(-S-CH3)。通过查阅文献，其质谱和核磁数据与文献（NicholasP,etal.Tetrahedron.1997,53(20):6993-7010）中的3-甲硫基丙酸对比基本一致，故化合物BS02-C-1鉴定为3-甲硫基丙酸。实施例3取实施例2制得的BS02-E组分（3g）用5ml无水乙醇溶解，采用反相硅胶柱层析（80g，AQ-C18)（YMC公司，批号：9955），依次用水、30%、50%、70%、100%甲醇-水混合液洗脱，流速20ml/min，每个梯度用2L洗脱液洗脱，将30%甲醇洗脱组分（358mg）浓缩至干，用3～5ml无水乙醇溶解，600mg硅胶（200-300目，国药集团化学试剂有限公司）拌样，采用正相硅胶柱层析（国药集团化学试剂有限公司，批号：F20110913）（200～300目，10g），用40ml石油醚：丙酮=10:1(体积比)的洗脱液洗脱。试管收集，每管收集5ml，TLC（薄层色谱法）检测合并，合并液减压浓缩至干。产物最终纯度为90.2%，收率为44%。实施例4取实施例2制得的BS02-E组分（3g）用5ml无水乙醇溶解，采用反相硅胶柱层析（80g，AQ-C18)（YMC公司，批号：9955），依次用水、30%、50%、70%、100%甲醇-水混合液洗脱，流速20ml/min，每个梯度用2L洗脱液洗脱，将50%洗脱组分（500mg）浓缩至干，用3～5ml无水乙醇溶解，600mg硅胶（200～300目，国药集团化学试剂有限公司）拌样，采用正相硅胶柱层析（国药集团化学试剂有限公司，批号：F20110913）（200～300目，10g），用40ml石油醚：丙酮=10:1(体积比)的洗脱液洗脱。试管收集，每管收集5ml，TLC（薄层色谱法）检测合并，合并液减压浓缩至干。产物最终纯度为93%，收率为5%。实施例3和4说明，洗脱时甲醇含量越高，越有利于最终纯度的提高，但是甲醇含量过高，则产物收率也相应降低。实施例5取实施例2制得的BS02-E的30%洗脱组分（358mg）浓缩至干，用3ml无水乙醇溶解，600mg硅胶（200～300目，国药集团化学试剂有限公司）拌样，采用正相硅胶柱层析（国药集团化学试剂有限公司，批号：F20110913）（200～300目，10g），用40ml石油醚：丙酮=10:1(体积比)混合液洗脱。试管收集，每管收集5ml，TLC（薄层色谱法）检测合并，合并液减压浓缩至干。产物最终纯度为90.2%，收率为55%。实施例6取实施例2制得的BS02-E的30%洗脱组分(358mg)浓缩至干，用4ml无水乙醇溶解，600mg硅胶（200～300目，国药集团化学试剂有限公司）拌样，采用正相硅胶柱层析（国药集团化学试剂有限公司，批号：F20110913）（200～300目，10g），用40ml石油醚：丙酮=10:2(体积比)混合液洗脱。试管收集，每管收集5ml，TLC（薄层色谱法）检测合并，合并液减压浓缩至干。产物最终纯度为86%，收率为59%。实施例5和6说明，洗脱时丙酮所占的比例越高，3-甲硫基丙酸洗脱下来的收率也越大，但是纯度会相应的下降。应选择纯度及收率均适中的洗脱方式洗脱。实施例7取实施例2制得的BS02-E的30%洗脱组分(358mg)浓缩至干，用5ml无水乙醇溶解，600mg硅胶（200～300目，国药集团化学试剂有限公司）拌样，采用正相硅胶柱层析（国药集团化学试剂有限公司，批号：F20110913）（200～300目，5g），用40ml石油醚：丙酮=10:2(体积比)的混合液洗脱。试管收集，每管收集5ml，TLC（薄层色谱法）检测合并，合并液减压浓缩至干。产物最终纯度为88%，收率为59%。实施例8取实施例2制得的BS02-E的30%洗脱组分(358mg)浓缩至干，用5ml无水乙醇溶解，600mg硅胶（200～300目，国药集团化学试剂有限公司）拌样，采用正相硅胶柱层析（国药集团化学试剂有限公司，批号：F20110913）（200～300目，5g），用40ml合适比例的的氯仿-甲醇混合液（48:1，体积比）洗脱。试管收集，每管收集5ml，TLC（薄层色谱法）检测合并，合并液减压浓缩至干。产物最终纯度为88%，收率为38.9%。应选择纯度及收率均适中的洗脱方式洗脱。应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。