一种高效生产γ-聚谷氨酸的方法技术领域本发明属于生物发酵生产高分子材料技术领域，具体是一种高效生产γ-聚谷氨酸的方法。
背景技术：
γ-聚谷氨酸是由D-谷氨酸和L-谷氨酸通过α-氨基和γ-羧基间的酰胺键结合而成的一种多功能生物可降解高分子材料。由于γ-聚谷氨酸及其衍生物具有优良的水溶性和吸附性，能彻底被生物降解，对人和动物安全无毒，可以食用等优点，因而可作为保水剂、增稠剂、絮凝剂、重金属吸附剂、药物、肥料缓释剂及药物载体等，在农业、食品、医药、化妆品、环保、合成纤维和涂膜等领域具有广阔的应用前景。随着化工合成材料造成的环境污染日益严重，开发生物可降解材料在一定程度上替代化学材料已成为整个国际社会的迫切需求。聚谷氨酸的制备方法有化学合成、提取和微生物发酵三种方法。微生物发酵法比前两种方法的生产成本低，生产过程对环境的污染小，所以现在主要采用微生物发酵法生产γ-聚谷氨酸。国内外对γ-聚谷氨酸的发酵工艺进行了广泛的研究，主要以液体深层发酵的培养基配方和培养工艺为主。南京工业大学筛选得一株γ-聚谷氨酸高产菌株BcilliussubtilisNX-2，对液体发酵生产γ-聚谷氨酸做了比较全面的研究，并申请了专利，专利公开号为CN1346891。华中农业大学也进行了γ-聚谷氨酸产生菌的筛选和工艺开发的工作，其菌种和液体生产工艺也已经申请了专利,专利公开号为CN1536071。韩国研究人员在2.5升发酵罐中对BacilluslicheniformisATCC9945a采用流加高密度培养的方法，发酵35小时后可达到35g/L的终产量（YoonSH，DOJH，LeeSY.Biotechnol.Lett，2000，22:585-588）。Kubota在OsakaCityUniversity土壤中分离得到的一株BacillussubtilisF201，该菌株在最佳发酵生产条件下可达到50g/L的最高产量，这是文献报道的最高产量（KubotaH.BiosciBiotecBiochem，1993:1212-1213）。目前发现的γ-PGA生产菌株主要是芽孢杆菌属。根据培养基中是否提供L－谷氨酸，可以将菌株分为两大类：一类为需要在培养基中添加L-谷氨酸前体的L-谷氨酸依赖型，另一类为不需要在培养基中添加L-谷氨酸前体的L-谷氨酸非依赖型。L-谷氨酸非依赖型生产效率较低，所以工业发酵生产基本都选用L－谷氨酸依赖型菌株，L－谷氨酸作为重要前体被添加在培养基中，但是其50%左右的转化率并不适合经济型规模化生产，探求一种高效、低成本的γ-聚谷氨酸生产方法仍是一种需要。
技术实现要素：
本发明所解决的技术问题是以高产γ-聚谷氨酸的地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）CGMCCNO.3336为出发菌株，向发酵培养基中添加硝酸钠并通过调控发酵过程中pH值与通风量以减少发酵液中谷氨酸的剩余，提高谷氨酸的转化率，以降低成本，提高γ-聚谷氨酸的产量。本发明提供的生产高分子量γ-聚谷氨酸的菌株具体为地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）CGMCCNO.3336。该菌株已于2009年10月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101），保藏号为CGMCCNO.3336，分类命名为：地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）。一种高效生产γ-聚谷氨酸的方法，包括如下步骤：（1）菌种活化：将地衣芽孢杆菌CGMCCNO.3336原始菌株接种在斜面培养基上，于37℃培养16小时，如此活化2-3次，制备成熟的斜面种子；所述斜面培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L，琼脂20g/L，pH7.2，不足部分纯净水补足；（2）种子液的制备：将一环活化后的斜面种子接种于装有50ml液体培养基的500ml三角瓶中，37℃，220rpm培养16小时至对数生长期；所述种子培养基组成为：葡萄糖30g/L，酵母膏7g/L，胰蛋白胨10g/L，K2HPO40.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，pH7.2，不足部分纯净水补足；（3）发酵罐发酵：将步骤（2）中的种子液以10%的接种量接种于发酵罐，30L发酵罐发酵培养基装液量为15L，初始发酵温度37℃，罐压0.01-0.05Mpa，通风量0.5-1.0vvm，转速400-600rpm；当发酵至24h后调节转速至200-400rpm，通风量1.0-1.5vvm，并开始补加流加培养基，通过pH值的反馈调节流加培养基的流加速度，控制pH值在7.4-7.9至发酵结束前2-6小时,总发酵时间为72h。所述发酵培养基组成为：葡萄糖80g/L，酵母膏20g/L，NH4NO34.5g/L，MgSO4·6H2O0.5g/L，NaCl10g/L，CaCl2·6H2O0.5g/L，FeSO40.01g/L,谷氨酸钠40g/L,NaNO320-40g/L,MnSO4·H2O0.15g/L,pH值7.2-7.5,不足部分纯净水补足；所述流加培养基组成为：葡萄糖650-850g/L，NaCl30.0-60.0g/L，CaCl2·6H2O10-15.0g/L，MnSO4·H2O5-10g/L，MgSO4·6H2O5-20g/L，pH值7.4-7.9,不足部分纯净水补足；发酵结束后离心去菌体，取上清液用蒸馏水稀释100倍，通过SBA-40E生物传感仪对剩余谷氨酸进行检测，谷氨酸含量为5-15g/L,γ-聚谷氨酸产量45-55g/L。有益效果：本发明以高产γ-聚谷氨酸的地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）CGMCCNO.3336为出发菌株，向发酵培养基中添加硝酸钠并通过调控发酵过程中pH值与通风量，在硝酸盐呼吸条件下影响聚谷氨酸合成酶的活性，从而减少发酵液中谷氨酸的剩余，提高谷氨酸的转化率，发酵结束后发酵液中谷氨酸含量为5-15g/L,γ-聚谷氨酸产量45-55g/L。为γ-聚谷氨酸工业化生产提供一种经济可行的生产方法。具体实施方式下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。实施例1一种高效生产γ-聚谷氨酸的方法，包括如下步骤：（1）菌种活化：将地衣芽孢杆菌CGMCCNO.3336原始菌株接种在斜面培养基上，于37℃培养16小时，如此活化2次，制备成熟的斜面种子；所述斜面培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L，琼脂20g/L，pH7.2，不足部分纯净水补足；（2）种子液的制备：将一环活化后的斜面种子接种于装有50ml液体培养基的500ml三角瓶中，37℃，220rpm培养16小时至对数生长期；所述种子培养基组成为：葡萄糖30g/L，酵母膏7g/L，胰蛋白胨10g/L，K2HPO40.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，pH7.2，不足部分纯净水补足；（3）发酵罐发酵：将步骤（2）中的种子液以10%的接种量接种于发酵罐，30L发酵罐发酵培养基装液量为15L，初始发酵温度37℃，罐压0.03Mpa通风量0.8vvm，转速500rpm；当发酵至24h后调节转速至300rpm，通风量1.2vvm，并开始补加流加培养基，通过pH值的反馈调节流加培养基的流加速度，控制pH值在7.7至发酵结束前4小时,总发酵时间为72h。所述发酵培养基组成为：葡萄糖80g/L，酵母膏20g/L，NH4NO34.5g/L，MgSO4·6H2O0.5g/L，NaCl10g/L，CaCl2·6H2O0.5g/L，FeSO40.01g/L,谷氨酸钠40g/L,NaNO330g/L，MnSO4·H2O0.15g/L,pH值7.2,不足部分纯净水补足；所述流加培养基组成为：葡萄糖750g/L，NaCl40g/L，CaCl2·6H2O12g/L，MnSO4·H2O8g/L，MgSO4·6H2O12g/L，pH值7.7,不足部分纯净水补足；发酵结束后经检测，发酵液中谷氨酸含量为10g/L,γ-聚谷氨酸产量50g/L。实施例2菌种活化和种子液制备同实施例1（3）发酵罐发酵：将步骤（2）中的种子液以10%的接种量接种于发酵罐，30L发酵罐发酵培养基装液量为15L，初始发酵温度37℃，罐压0.01Mpa通风量0.5vvm，转速400rpm；当发酵至24h后调节转速至200rpm，通风量1.0vvm，并开始补加流加培养基，通过pH值的反馈调节流加培养基的流加速度，控制pH值在7.4至发酵结束前2小时,总发酵时间为72h。所述发酵培养基组成为：葡萄糖80g/L，酵母膏20g/L，NH4NO34.5g/L，MgSO4·6H2O0.5g/L，NaCl10g/L，CaCl2·6H2O0.5g/L，FeSO40.01g/L,谷氨酸钠40g/L,NaNO320g/L,MnSO4·H2O0.15g/L,pH值7.4,不足部分纯净水补足；所述流加培养基组成为：葡萄糖650g/L，NaCl30.0g/L，CaCl2·6H2O10g/L，MnSO4·H2O5g/L，MgSO4·6H2O5g/L，pH值7.4,不足部分纯净水补足；发酵结束后经检测，发酵液中谷氨酸含量为15g/L,γ-聚谷氨酸产量45g/L。实施例3（3）发酵罐发酵：将步骤（2）中的种子液以10%的接种量接种于发酵罐，30L发酵罐发酵培养基装液量为15L，初始发酵温度37℃，罐压0.05Mpa通风量1.0vvm，转速600rpm；当发酵至24h后调节转速至400rpm，通风量1.5vvm，并开始补加流加培养基，通过pH值的反馈调节流加培养基的流加速度，控制pH值在7.9至发酵结束前6小时,总发酵时间为72h。所述发酵培养基组成为：葡萄糖80g/L，酵母膏20g/L，NH4NO34.5g/L，MgSO4·6H2O0.5g/L，NaCl10g/L，CaCl2·6H2O0.5g/L，FeSO40.01g/L,谷氨酸钠40g/L,NaNO340g/L,MnSO4·H2O0.15g/L,pH值7.5,不足部分纯净水补足；所述流加培养基组成为：葡萄糖850g/L，氯化钠60.0g/L，CaCl2·6H2O15.0g/L，MnSO4·H2O10g/L，MgSO4·6H2O20g/L，pH值7.9,不足部分纯净水补足；发酵结束后经检测，发酵液中谷氨酸含量为5g/L,γ-聚谷氨酸产量55g/L。