本文所公开的实施方案涉及用于减少含有所需待纯化的蛋白质的制剂中的病毒和病毒多核苷酸的方法。
已知一些病毒物种通过借助于暴露于极端条件如高酸性pH而被灭活。这些物种包括大多数脂质包膜病毒物种。已知一些病毒物种对此类灭活具有抗性。这些物种包括许多非脂质包膜病毒物种，也被称为蛋白质衣壳病毒。
阴离子交换色谱通常用于纯化蛋白质，包括去除污染病毒物种。用于此类应用的阴离子交换剂通常是季胺离子交换剂。这些应用在中性到微碱性pH下进行，因为它们通常在那些条件下支持最强的病毒结合(C.Curtis等，Biotechnol.Bioeng.84(2003)179-185)，并且需要此类条件以在去除病毒的同时去除污染宿主细胞蛋白质(P.Gagnon，J.Chromatogr.A 1221(2012)57-70)。基于伯胺的阴离子交换剂也已被描述用于在中性到碱性操作pH下去除病毒和宿主细胞蛋白质(W.Riordan等，Biotechnol.Prog.25(2009)1695-1702)。
技术实现要素：
在一些实施方案中，本文公开了用于降低所需蛋白质的酸性制剂中的病毒和病毒DNA水平的方法，所述方法包括使所需蛋白质的酸性制剂与负载伯胺、仲胺或两者的表面接触。
具体实施方式
提供了用于在低pH处理期间或之后通过使低pH制剂与负载伯胺和/或仲胺的固体表面接触来增强从含有所需蛋白质的制剂中去除病毒和病毒DNA的方法。如本文所用，“低pH”处理是指作为病毒灭活处理的一部分的足够低的pH，即使至少一种病毒灭活的足够低的pH。因此，pH范围的上限通常不大于约4.0。因此，在一些实施方案中，低pH可以在例如约1.0到约4.0，在一些实施方案中，或约2.0到约4.0、或约2.0到约3.8的范围内。本领域技术人员将了解，可以选择pH以符合调节标准。在典型的情况下，上端调节极限pH可以是约3.8。在一些实施方案中，提供了用于降低所需蛋白质的酸性制剂中的病毒和病毒DNA水平的方法，所述方法包括使所需蛋白质的酸性制剂与负载伯胺、仲胺或两者的表面接触。
在一些实施方案中，接触步骤期间的操作pH在选自由以下所组成的组的范围内：(a)约2.0到约4.0、(b)约2.25到约3.75、(c)约2.5到约3.5、(d)约2.75到约3.25、(e)约3.5到约3.75、和(f)约3.25到约3.5，以及其间的中间范围或中间单个值。
在一些实施方案中，接触步骤期间的盐浓度在选自由以下所组成的组的范围内：(a)约0.0或非零值到高达约0.5M、(b)0.05M到约0.3M、和(c)约0.1M到约0.2M。盐浓度可以是这些列举的范围之间的任何中间范围或中间单个值。
在一些实施方案中，接触步骤的持续时间在选自由以下所组成的组的范围内：(a)约15到约120分钟、(b)约30至约60分钟、(c)小于约30分钟的非零量、(d)小于约15分钟的非零量、(e)小于约10分钟的非零量、(f)小于约5分钟的非零量、(g)小于约2分钟的非零量、(h)小于约1分钟的非零量、和(i)使制剂通过容纳负载伯胺的表面的装置所需的时间。
在一些实施方案中，所述表面包含选自由以下所组成的组的一种或多种部分：乙二胺、三(2-氨乙基)胺、二乙基胺三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、聚烷基胺。在一些实施方案中，所述表面可以包含任何伯胺、仲胺或其组合。所述表面可以衍生自附着在衬底的表面的任何直链或支链的伯单胺片段或表现为附着在衬底的表面的任何直链或支链的伯单胺片段的形式。示例性的伯胺部分包括但不限于基于以下的片段：甲胺、乙胺、丙胺、异丙胺、丁胺、仲丁胺、异丁胺、己胺的任何异构构型、庚胺的任何异构构型、辛胺、壬胺的任何异构构型、癸胺的任何异构构型、或其混合物或组合。
在一些实施方案中，可以采用二胺片段。合适的二胺包括但不限于以下通式的二胺
H2N—R—NH2
其中R是具有约1到约20个碳原子的直链或支链烷基或烯基、具有约1到约20个碳原子的环烯基、具有约1到约20个碳原子的烷基环烯基、具有约1到约20个碳原子的烷芳烯基(alkarenyl)、具有约1到约20个碳原子的芳烯基(aralkenyl)等、或其混合物或组合。R基团还可以包含除碳和氢之外的原子，如氧、氮、氟和/或氯。
合适的表面胺部分可以基于二胺和三胺，包括但不限于烷基二胺、环烷基二胺、烷基环烷基二胺、芳烷基二胺、芳基二胺、烷芳基二胺等和其类似物，并且其中一个或多个碳原子可以被氮原子、氧原子或其混合物替代，其中所述氧原子形成羧基、羟基和或醚部分，并且所述氮原子形成叔胺和/或酰胺部分，和/或一个或多个氢原子可以被氟原子、氯原子或其混合物替代，并且包括2到约20个碳原子，包括约3到约15个碳原子，并且包括约4到约10个碳原子。示例性的烷基二胺包括但不限于1,2-二氨基乙烷(1,2-乙二胺)、1,2-二氨基丙烷、1,3-二氨基丙烷、1,2-二氨基丁烷、1,3-二氨基丁烷、1,4-二氨基丁烷、1,2-二氨基戊烷、1,3-二氨基戊烷、1,4-二氨基戊烷、1,5-二氨基戊烷和类似的高级二氨基烷烃、六亚甲基二胺、氨基甲基环戊胺、1,2-环戊烷二胺、1,6-己二胺、1,2-苯二胺、赖氨酸(或其它二胺氨基酸)、1,2-苯二胺、1,4-苯二胺、1,2-二苯基-1,2-乙烷二胺、苯二胺、2-羟基丙二胺、乙内酰脲、N,N-双(二羟乙基)乙二胺、六氢三嗪、氨乙基哌嗪(AEP)等、或其混合物或组合。可以令人满意地用于制备主题组合物的其它脂族胺和三胺的示例包括1,4-环己二胺和双-六亚甲基三胺。在所有上述实施方案中，胺在衬底表面上的呈现可以通过与任何片段的任何原子(包括氮自身)的连接来实现。在一些实施方案中，还可以采用仲胺。此类仲胺可以包含另外的直链或支链的C1到C20片段。
在一些实施方案中，所述表面为选自由以下所组成的组中的一种的形式：颗粒、膜、整体柱(monolith)、水凝胶涂覆的骨架和其组合。
在一些实施方案中，接触步骤通过选自由以下所组成的组的操作进行：(a)将负载伯胺和/或仲胺的颗粒分散在所述制剂中，(b)使所述制剂通过与所述表面流体接触的装置，(c)使所述制剂再循环通过提供与所述表面流体接触的装置，和(d)其组合。
已意外地发现，病毒结合到固体表面的伯胺和/或仲胺违反了阴离子交换色谱的公认规则。通过从负载伯胺的表面洗脱结合的病毒或病毒多核苷酸所需的盐浓度测量的结合强度随着pH降低而增加，在一些情况下，与在pH 8在同一表面上的结合相比，结合强度增加了超过2倍，与在pH 8在季胺交换剂(quaternary exchanger)上的结合相比，结合强度增加了超过5倍，并且与在pH 6在季胺交换剂上的结合相比，结合强度增加了接近10倍。在更低的pH值下，结合变得逐渐更强，使得在pH 3需要高达5M的胍以从负载伯胺和/或仲胺的表面去除DNA。同时，实验数据显示，与pH8相比，未增强具有低于约150kDa的质量的肽和蛋白质的保留，从而产生一个窗口，其中在增强病毒和病毒DNA的保留的条件下，大部分制剂中的所需蛋白质未结合到负载伯胺和/或仲胺的表面。实验数据显示，这转化为非脂质包膜病毒如甲型肝炎病毒和小鼠细小病毒的超过700倍的减少，所述病毒通过用低pH处理未被显著灭活。这是意外的，因为溶质如病毒、DNA和蛋白质在季胺盐阴离子交换剂(quaternary anion exchanger)上的保留随着pH降低而减少，这是由于所述溶质变得正电性更高(和/或负电性更低)。这通常被理解为使得阴离子交换色谱对于在酸性pH，尤其是在强酸性pH值，如通常用于病毒灭活的条件下的病毒去除是无用的。不归于任何特定理论，病毒和病毒DNA在负载伯胺和/或仲胺的表面上的相反行为可能通过氢键合被介导。这是意外的，因为已知氢键合涉及倾向于显示其作用应当与离子交换行为相似的静电组分。然而，来自使用选择性氢供体-受体如山梨醇的竞争实验的数据显示氢键合。该行为是更意外的，因为它在多个方面与本领域中已知的结果不同并且相反，表明对于大小范围在18至78kDa的蛋白质，与pH 8相比，在pH 6保留显著增加；表明增加的结合与降低的pH没有大小相关性；并且表明保留在约pH 6下变得最强，在更低的pH下减弱，在pH 4-5下丧失(美国专利6,090,288)。支持本文所公开的方法，实验数据表明，对于约66kDa的蛋白质，基本上没有增强保留，同时存在大小和增强之间的强相关性，而对于大小接近约1MDa以及更大的溶质，在低于6的pH值下，特别是在小于4的pH值下，保留继续变得更强，所有这些都是必要的促成因素。
在一些实施方案中，操作pH可以小于6，如pH 5或更小、或4或更小、或3.9或更小、或3.8或更小、或3.7或更小、或3.6或更小、或3.5或更小、或3.4或更小、或3.3或更小、或3.3或更小、或3.2或更小、或3.1或更小、或3.0或更小，低到所需蛋白质可以耐受的且不产生可能影响其临床功效或安全性的持续永久性损害最低pH。在一些实施方案中，可耐受的pH可以是2.5或更小、或2.0或更小、或约1.0。最低可耐受的pH应被理解为对于每种所需产物是独特的并且不可能在广泛的一般基础上表示。在一些实施方案中，最大pH将不大于约4，因为甚至脂质包膜的病毒物种的灭活也需要低于4的pH。在一些实施方案中，pH将为3.25到3.75之间。
在一些实施方案中，所述制剂可以不含盐。在一些实施方案中，所述制剂可以含有一种或多种盐种类，其中此类盐的浓度是高达0.01M、高达0.05M、高达0.1M、高达0.2M、高达0.3M、高达0.4M、高达0.5M、或更高、潜在高达1.0M的非零量。在一些此类实施方案中，盐种类可以是氯化钠(NaCl)。在一些实施方案中，盐的存在可能对通过负载伯胺的表面的病毒去除具有可忽略的影响，而在一些实施方案中，盐的存在可能降低通过负载伯胺的表面所实现的病毒去除的程度。在一些实施方案中，盐的存在可以增强病毒灭活，或改善所需蛋白质的稳定性，或降低所需蛋白质的溶解度。对于每种所需蛋白质种类，此类效应都可以确定。在一些实施方案中，在所示范围内增加盐浓度可以限制该程度于通过负载伯胺的表面增强病毒去除且超过仅仅通过在低pH下处理所实现的灭活程度，但去除程度将保持显著。
在一些实施方案中，所述制剂可以含有意在增强病毒灭活的成分，如依沙吖啶、亚甲蓝、道诺霉素、亚德里亚霉素、氯己定、阿立西定、苯扎氯铵、三(2-氨乙基)胺、磷酸三(正丁基)酯、表面活性剂、螯合剂或此类成分的组合。
在一些实施方案中，负载伯胺的表面可以另外包含其它种类的正电性化学部分，如仲胺基。在其它实施方案中，负载伯胺的表面可以另外包含其它种类的正电性化学，如叔胺基或季胺基。在一些实施方案中，负载伯胺的表面可以另外包含一种以上种类的正电性化学部分。在一些实施方案中，负载伯胺的表面可以另外包含正电性化学部分的组合，所述组合由仲胺和叔胺，仲胺和季胺，叔胺和季胺，仲胺、叔胺和季胺，以任意相对比例组成。
在一些实施方案中，含有伯胺的化学物种可以是三(2-氨乙基)胺(TREN)。在其它实施方案中，含有伯胺的化学物种可以是乙二胺。在其它实施方案中，含有伯胺的化学物种可以是聚烯丙胺或另一种聚合的伯胺。
在一些实施方案中，负载伯胺的表面可以包含允许所述表面作为整体参与静电相互作用、氢键、疏水相互作用、π-π键合和金属配位相互作用的化学成分。
在一些实施方案中，负载伯胺的表面可以包含与伯胺具有相反电荷的成分。在一些实施方案中，负载伯胺的表面可以包含由于不带电荷或由于含有平衡比例的负电荷和正电荷、或者两者而为电中性的成分。
在其中存在多个表面的一些实施方案中，各个表面可以负载相同的含伯胺的物种。在其中存在多个表面的一些实施方案中，各个表面可以负载不同的含伯胺的物种。在其中存在多个表面的一些实施方案中，各个表面中的一些可以负载除伯胺以外的物种。
在一些实施方案中，负载伯胺的固体表面可以呈颗粒、膜、整体柱、大网状骨架上的水凝胶的物理形式。在一些此类实施方案中，可以存在一个以上物理单元，如多个颗粒、或多个膜、或多个其它物理形式、或不同物理形式的组合。在一些此类实施方案中，多个颗粒可以被填充在柱中。
在一些实施方案中，多个伯胺表面可以悬浮在含有所需蛋白质的制剂内。在一些此类实施方案中，悬浮表面可以在处理之后通过沉降、或过滤、或浮选、或在磁场中捕集、或在带相反电荷的表面上捕集、或任何其它便利的手段而被去除。在一些实施方案中，在用于病毒灭活的低pH处理已经名义上完成之后，可以使含有所需蛋白质的制剂流动通过含有一个或多个负载伯胺的流体接触表面的装置。在一些实施方案中，可以使所需蛋白质制剂连续再循环通过含有一个或多个伯胺流体接触表面的装置一段时间，直到低pH处理的整个持续时间。在一些实施方案中，通过前述接触模式的任何组合可以使所需蛋白质制剂与一个或多个结合伯胺的表面接触。
在说明所公开的方法的关键要素的一个实施方案中，将含有部分纯化的所需蛋白质如IgG单克隆抗体的制剂滴定到pH为3.5，并在该pH下保持60分钟。将具有经改性负载乙二胺的表面的整体柱平衡到与抗体制剂名义上相同的pH和盐条件。然后使制剂流动通过整体柱。可以任选地用pH 3.5的清洁缓冲液冲洗整体柱，以使所需蛋白质的回收最大化。然后可以任选地丢弃或再生整体柱。
在说明所公开的方法的关键要素的另一实施方案中，将含有部分纯化的抗体的制剂滴定至pH为3.5，将具有经改性负载乙二胺的表面的整体柱平衡到与抗体制剂名义上相同的pH和盐条件。然后使制剂再循环通过整体柱，直到所需蛋白质已暴露于pH 3.5达60分钟，或另指定某一时间间隔。
在说明所公开的方法的关键要素的另一实施方案中，将含有部分纯化的抗体的制剂滴定至pH为3.5，将具有经改性负载聚烯丙胺的表面的膜吸附器平衡到与抗体制剂名义上相同的pH和盐条件。然后使制剂再循环通过所述膜为60分钟的一段时间。在密切相关的实施方案中，将抗体制剂在pH 3.5温育60分钟，然后单次流动通过膜吸附器。
在说明所公开的方法的关键要素的另一实施方案中，将含有部分纯化的抗体的制剂滴定至pH为3.5。将具有经改性负载乙二胺或聚烯丙胺或其它含伯胺的配体的表面的颗粒平衡到与抗体制剂名义上相同的pH和盐条件。通过搅拌60分钟的一段时间使颗粒维持悬浮状态，然后通过沉降或过滤或任何其它适当的方法将它们去除。可以任选地用pH 3.5的清洁缓冲液冲洗颗粒，以使所需蛋白质的回收最大化。在密切相关的实施方案中，抗体制剂在pH 3.5温育60分钟，然后通过填充有颗粒的柱，所述颗粒负载乙二胺、聚烯丙胺、三(2-氨乙基)胺或其它含伯胺的配体。
对下面的术语进行了定义，使得可以更容易地理解本文的实施方案。另外的定义陈述于整个详细描述中。
“胺”定义为通过用有机基团(通常用烃如甲基或乙基)替代一个或多个氢原子而衍生自氨的有机化合物。在“伯胺”上，一个氢原子被有机基团替代。在“仲胺”上，两个氢被有机基团替代。在“叔胺”上，三个氢被有机基团替代。在“季胺”上，三个氢被有机基团替代并且第四有机基团替代存在于较少取代的胺上的电子对。含伯胺的化合物还可以含有其它类型的胺或非胺物种。
“氢键”定义为两个分子之间的弱键，其部分地由一个分子中的质子与另一分子中的负电性原子之间的静电吸引引起，并且部分地由共价相互作用引起。
“病毒”或“病毒粒子”是指仅在主要为细菌、植物和动物的活宿主的细胞内复制的超显微的(直径大约为20nm到300nm)、代谢惰性的感染原：其由RNA或DNA核、蛋白质外壳和在更复杂的类型中含有一层或两层脂质的包膜构成。示例包括但不限于dsDNA病毒、ssDNA病毒、dsRNA病毒、(+)ssRNA病毒、(-)ssRNA病毒、ssRNA RT病毒和dsDNA-RT病毒；腺病毒、疱疹病毒、痘病毒、细小病毒、呼肠孤病毒、诺如病毒、小核糖核酸病毒、披膜病毒、正粘病毒、棒状病毒、逆转录病毒、嗜肝性DNA病毒、乳头瘤病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒、西尼罗河病毒和噬菌体。术语病毒理解为包括用于用作基因疗法的载体、用作疫苗和用作抗生素的替代物的病毒颗粒。它还理解为包括所谓的假病毒粒子，其可以描述为已经过重组修饰而保留它们产生保护性免疫的能力同时消除它们引起感染的能力的病毒颗粒，并且还可以描述为在感染有两种病毒物种的宿主内不同的病毒物种自发地将基因从一个转移到另一个的异嗜性病毒物种。
“病毒灭活”是指以使病毒复制能力暂停的方式破坏该病毒的过程。热通常用于该目的，以及暴露于化学试剂或极端化学环境，如高酸性或高碱性条件，或暴露于有机溶剂等。
“病毒去除”是指从制剂中去除病毒的过程。此类去除可以由物理方法如过滤(其中过滤装置的孔隙度阻止病毒通过)或尺寸排阻色谱(其中病毒的大小使其与更小的蛋白质分级分离)而引起。去除还可以由如在离子交换、亲和性、疏水性相互作用或羟基磷灰石色谱法或其它色谱方法中病毒与互补表面如色谱表面的化学结合而引起。
“病毒减少”是指通过灭活和去除实现的来自制剂的病毒负载的总减少。
“病毒多核苷酸”是指病毒的遗传物质，在一些情况下是DNA，在一些情况下是RNA。
在某些实施方案中，可以在不偏离上述一般实施例的情况下应用所公开的方法以增强病毒减少。在不考虑负载伯胺的固体材料的情况下灭活溶液的pH应当选择为实现最高可能程度的病毒灭活。在已知使病毒灭活而不永久破坏目标产物的有效pH值范围(其可以是低于pH 4的值到约pH 3的值)内，可以预期所述固体材料显著增强净病毒减少。暴露时间也可以独立于负载伯胺的固体材料被选择。暴露温度也可以独立于负载伯胺的固体材料被选择。可以考虑添加抗病毒组分，然而，应当审慎地检查某些变量以评估它们的单个影响和共同影响。可以预期非离子型添加剂、两性离子型添加剂或带正电荷的添加剂是可耐受的，且不显著干扰负载伯胺的固体材料保留病毒或病毒DNA的能力。负电性添加剂可能具有干扰病毒与负载伯胺的固体材料结合的倾向。导电添加剂如盐可以限制负载伯胺的固体材料结合病毒的能力，虽然产生大致生理电导率或更低电导率的盐浓度通常是耐受良好的，并且在一些实施方案中，盐浓度是生理电导率的两倍或三倍将仍然允许负载伯胺的固体材料对总体病毒减少提供有价值的增强。可以在各种水平的添加剂下进行简单实验，以确定它们可能降低负载伯胺的固体材料减少病毒的能力的程度。用于使获得统计学上有效的数据体以确定给定变量集的最佳条件所需的测试数量最小化的称为实验设计(DoE)的技术在本领域中是众所周知的。作为一般情况，支持最有效的病毒灭活的条件(独立于负载伯胺的固体材料)与负载伯胺的固体材料组合将支持病毒的最大总体减少。
在一些实施方案中，所公开的方法将在增强病毒减少的同时增强DNA和/或污染蛋白质的去除。实验数据表明，这通过与病毒减少相同的化学机制而发生；意外地随着pH降低而增加。在一些此类实施方案中，例如在所需产物确实结合到负载伯胺的表面的情况下，可能有利的是采用最低实际盐浓度以有利于病毒的最高减少。在其它实施方案中，例如在所需蛋白质对负载伯胺的表面具有吸引力的情况下，出于防止所需产物损失和防止被结合的所需蛋白质干扰病毒结合能力的双重目的，可能需要增加盐浓度。在一些此类实施方案中，盐浓度的增加通常不应大于防止所需蛋白质损失和/或防止所需蛋白质干扰病毒结合所必需的盐浓度。由于每种所需蛋白质呈现不同的性质，因此应当理解，可能需要实验来确定是否需要盐，并确定它们的最低有效浓度。通过简单的实验确定有效浓度在本领域技术人员的能力范围内。
在一些实施方案中，评价负载伯胺的表面和各种形式和组成的装置以确定哪种提供了对于病毒减少最有效的接触和最高的能力将是有益的。作为一般情况，膜提供比整体柱更小的流动阻力，但整体柱提供更高的病毒结合能力。悬浮在所需蛋白质制剂中的多孔颗粒通常由于病毒和带电颗粒之间的大的分子距离而具有差的能力和迟滞的病毒结合动力学。填充有多孔颗粒的柱提供比悬浮颗粒更快的动力学，虽然它们与膜和整体柱相比仍然缓慢并且仍然具有低能力，但多孔颗粒仍然可以实现有价值地增强病毒减少。
实施例
实施例1.负载乙二胺的整体柱(CIME DA，BIA Separations)上随pH而变化的DNA结合。来自鲑鱼精子的基因组DNA用作病毒DNA的替代物。在单独的实验中用pH范围为8.0到3.5的缓冲液平衡EDA整体柱。将悬浮在50mM Tris(pH 8)中的DNA注射到整体柱中。在置换未结合的样品组分的洗涤步骤之后，以NaCl或胍的线性梯度洗脱DNA。在两种情况下，结果均表明从pH 4开始保留强度不成比例地增加。实验结果提供在表1中：
表1
实施例2.负载伯胺的表面上的DNA保留的增强相对于负载季胺的表面上的减弱的保留。来自鲑鱼精子的基因组DNA用作病毒DNA的替代物。评价了相对于负载季胺的整体柱(CIM QA，BIA Separations)在负载伯胺的整体柱(CIM EDA，BIA Separations)上在pH 8、pH7和pH6DNA的保留。在pH 8.0以0.6M NaCl将DNA从QA中洗脱出来，在pH 7.0减弱到0.55M NaCl，并且在pH 6.0进一步减弱到0.47M NaCl。在pH 8.0下以0.83M NaCl将DNA从EDA中洗脱出来、在pH 7.0以1.11M NaCl将DNA从EDA中洗脱出来并且在pH 6.0以1.8M NaCl将DNA从EDA中洗脱出来。这些结果突出了以下事实，即负载伯胺的表面上的保留与该趋势相反，并且与使用负载季胺的表面所观察到的相比具有显著更大的量值。
实施例3.负载伯胺的表面上的病毒保留的增强相对于负载季胺的表面上的减弱的保留。噬菌体M13用作测试病毒。评价了相对于负载季胺的整体柱(CIM QA，BIA Separations)在负载伯胺的整体柱(CIM EDA，BIA Separations)上在pH 8、pH 7和pH 6DNA的保留。在pH 8.0以0.7M NaCl将DNA从QA中洗脱出来，在pH 7.0减弱到0.61M NaCl，并且在pH 6.0进一步减弱到0.53M NaCl。在pH 8.0以1.02M NaCl将DNA从EDA中洗脱出来，在pH 7.0以1.47M NaCl将DNA从EDA中洗脱出来并且在pH 6.0以2.5M NaCl将DNA从EDA中洗脱出来。这些结果突出了以下事实，即负载伯胺的表面上的保留与该趋势相反，并且显著更大使用负载季胺的表面所观察到的。
实施例4.用负载伯胺的整体柱增强小鼠细小病毒(MVM)的减少。将含有MVM的病毒细胞培养物暴露于pH 3.5达60分钟。已知MVM不会被这些条件灭活。通过过滤去除固体，并且使滤液通过平衡到pH 3.5的EDA整体柱。MVM含量降低了log10 2.85个因数。这表示约700倍增强病毒的减少，并且特别突出了所公开的方法增强非包膜病毒物种(特别包括逆转录病毒物种如MVM)的去除的能力。
实施例5.用负载伯胺的整体柱增强甲型肝炎病毒(HAV)的减少。将含有HAV的病毒细胞培养物暴露于pH 3.5达60分钟。已知HAV不会被这些条件灭活。通过过滤去除固体，并且使滤液通过平衡到pH 3.5的EDA整体柱。MVM含量降低了log10 2.85个因数。这表示约700倍增强病毒的减少，并且进一步突出了所公开的方法增强非包膜病毒物种的去除的能力。
对于本领域技术人员显而易见的是，所公开的方法还可以用于纯化病毒、尤其是非脂质包膜病毒，其中低pH的结合连同纯化可以提供使脂质包膜病毒灭活的次要益处。出于相同的原因，同样显而易见的是，所公开的方法还可以用于从可能被脂质包膜病毒污染的制剂中分离DNA。在两种情况下，所公开的方法根据目标产物的大小不成比例地增强它们的保留的能力还将有利于去除更小的污染物如蛋白质。
本文所引用的所有参考文献均以引用方式整体并入且用于所有目的，其并入程度就如同每个单独的出版物或专利或专利申请被明确地且个别地指明出于所有目的以引用方式整体并入一样。当以引用方式并入的出版物和专利或专利申请与本说明书中所含的公开内容相冲突时，本说明书意在替代和/或优先于任何此类相冲突的材料。
用于本说明书和权利要求中的所有表示成分的量、色谱条件等的数字均应当理解为在所有情况下被术语“约”修饰。因此，除非另有相反指明，否则本说明书和所附权利要求书中陈述的数字参数为近似值，其可根据本发明实施方案试图获得的所需性能而改变。
如对本领域技术人员显而易见的，在不脱离其精神和范围的情况下可以对本文的实施方案进行许多更改和变化。本文所述的具体实施方案仅以举例方式提供，而不意在以任何方式进行限制。这意味着本说明书和实施例仅仅被视为示例性的，所述实施方案的真正范围和精神由所附权利要求书指明。