用于治疗CEA阳性表达肿瘤的双特异纳米抗体的制作方法

本发明涉及双特异抗体药物，特别涉及抗人肿瘤相关抗原CEA和抗人自然杀伤细胞的特异性抗原CD16的双特异抗体药物。
背景技术：
：肿瘤免疫治疗中，双特异抗体（bispecificantibody,bsAb）在其中起到了非常重要的作用。双特异抗体是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，通过结合位点，可同时结合效应细胞与靶细胞表面的特异性抗原，激活静止状态的效应细胞并募集到靶细胞周围，介导靶细胞的凋亡或裂解。已开发出多种靶向不同免疫效应细胞和肿瘤细胞的bsAb，其中在肿瘤免疫治疗中的主要免疫效应细胞为T细胞、NK细胞和巨噬细胞等。NK细胞和T细胞是目前研究较多的效应细胞。在T细胞表面具有引发作用的分子，包括CD2、CD3、CD28等，因此在构建用于肿瘤治疗的双特异抗体时，通常都包括识别这些分子的特异性，其中基于CD3和CD28的双特异抗体研究较多。BiTE（（bispecificTcellengager，双特异T细胞募集者）是一种双特异抗体的形式，能通过抗CD3的单链抗体片段最大程度的介导T细胞靠近肿瘤细胞，进而发挥裂解肿瘤的作用。当前，有几种靶向BiTE正在研发之中，比如CD19（针对B细胞癌）、上皮细胞粘附分子（EpCAM，CD326），前列腺特异膜抗原（PSMA），以及CEA。自然杀伤细胞（naturalkillercell,NK）是体内免疫中的重要组成部分，在天然免疫中识别外界抗原，进而直接清除。其杀伤作用具有MHC非限制性，多种肿瘤细胞对NK细胞介导的杀伤作用敏感。其表面特异性分子CD16，是一种分布于NK细胞，中性粒细胞和单核细胞、巨噬细胞等表面的低亲和力Fc受体。CD16通过结合IgG的Fc区域，可以激活NK细胞产生抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用（antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity,ADCC）。bsAb分子上的抗CD16抗体结合位点，可以在两个方面增加NK细胞基础上的免疫治疗作用，1.作为肿瘤部位的锚定分子，募集NK细胞，使得局部NK细胞数量增加，延长肿瘤细胞与NK的接触时间，增强NK细胞的杀伤作用，2.在肿瘤部位激活NK细胞，进而杀伤肿瘤细胞。目前已有多种结合CD16与肿瘤相关抗原的双特异抗体在研究之中，比如靶向Her2、CD33、CD20等。其中靶向CD30和CD16的双特异抗体AFM13，用于治疗顽固性和/或再发性霍奇金淋巴瘤已经进入临床试验（clinicaltrials.govidentifier:NCT01221571）。CEA是一种分子量约180-200kd的高度糖基化的癌胚蛋白，参与细胞粘附，在正常的胎儿胃肠组织表达。也存在于95%的结肠癌、乳腺癌、肺癌等多种肿瘤细胞表面。目前，常作为一种广泛使用的肿瘤相关抗原，其血清CEA水平被用于疾病发生发展、监测和某些肿瘤的预后指标。同时，肿瘤CEA在免疫诊断和免疫治疗上也是一种很有用的靶标。FDA已经同意了几个放射标记的抗CEA抗体或抗体片段用于体内影像，比如由Immunomedics公司开发的99mTc标记的CEA抗体Artitumomab。MEDI-565，又名MT111或AMG211，是一种BiTE抗体，能介导T细胞杀伤表达CEA的肿瘤细胞，且与肿瘤细胞系的突变状态无关。现在该药物正处于临床I期实验（ClinicalTrails.gov,NCT02291614）中，用于治疗晚期结肠腺癌。技术实现要素：本发明的一个目的在于提供一种抗CEA-CD16的双特异抗体，其能够特异性地与这两者结合，引导NK细胞靠近CEA表达阳性细胞，进而通过ADCC效应，杀伤或抑制肿瘤的生长。为实现上述目的，本发明的一个方面提供一种双特异纳米抗体，其包含：（a）与人CEA特异性结合的第一结合结构域，所述第一结合结构域包含抗人CEAVHH，以及（b）与人CD16特异性结合的第二结合结构域，所述第二结合结构域包含抗人CD16VHH。在一个实施方式中，所述抗人CEAVHH位于所述抗人CD16VHH的N末端。在另一个实施方式中，所述抗人CEAVHH位于所述抗人CD16VHH的C末端。在一个实施方式中，所述抗人CEAVHH的氨基酸序列如SEQIDNo:1所示。在另一个实施方式中，所述抗人CD16VHH的氨基酸序列如SEQIDNo:2所示在一个实施方式中，所述第一结合结构域通过连接肽与所述第二结合结构域连接。在优选的实施方式中，所述连接肽的氨基酸序列如SEQIDNo:3所示。本发明的另一个方面提供一种治疗患有CEA阳性表达肿瘤的患者的药物组合物，所述药物组合物包含所述双特异纳米抗体以及药用辅料。在另一个实施方式中，所述药物组合物包含所述双特异纳米抗体以及第二种抗癌剂。在一个实施方式中，所述CEA阳性表达肿瘤为结直肠癌、胰腺癌、食道癌、胃腺癌、乳腺癌或肺癌。在另一个实施方式中，所述肿瘤为进行性肿瘤、晚期肿瘤、或迁移肿瘤。在另一个实施方式中，所述患者具有超过100ng/ml的CEA血清浓度。本发明的另一个方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包含核酸序列，所述核酸序列编码本发明所述的双特异纳米抗体。本发明的另一个方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包含载体，所述载体包含上述核酸序列。本发明的另一个方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包含宿主，所述宿主使用上述核酸序列或载体转化或转染。本发明运用基因工程等技术手段，将识别CD16和识别CEA的纳米抗体片段构建在同一抗体分子中，能够特异性地与这两者结合，引导NK细胞靠近CEA表达阳性细胞，进而通过ADCC效应，杀伤或抑制肿瘤的生长。该抗体分子能在原核表达系统中可溶性表达，有利于后续的分离纯化，并且具有较好的热稳定性和高度可溶性。此外，本发明使用的抗体片段为来自骆驼重链抗体的可变区序列，与抗原具有高结合亲和性，同时与人免疫球蛋白的重链可变区序列具有较高的同源性，抗原性弱。附图说明图1示意性地显示本发明双特异抗体的一个实施方式的结构示意图。（A）结构域示意图；（B）模块化示意图。图2显示本发明的双特异抗体的表达与纯化过程中的电泳图。（A）Ni-NTA纯化过程分析电泳图；（B）Q-sepharoseHP纯化的SDS-PAGE电泳分析图。图3显示流式细胞术分析双特异抗体与CEA的结合。图4显示WesternBlot分析双特异抗体对CEA的结合，其中Lane1：HT29，Lane2：LS174T，Lane3：SKOV3，Lane4：SKOV3/CEA。图5显示体外细胞毒性试验的结果。图6显示体外EC50实验的结果，其中HT29的EC50值为0.16nM，LS174T的EC50值为0.01nM。结果代表至少3次试验的平均值。图7为CEA表达阴性细胞系SKOV3的anti-CEAVHH（A）及anti-CD16VHH（B）对双特异抗体介导的细胞毒性干扰试验结果。图8为CEA表达阳性细胞系LS174T的anti-CEAVHH（A）及anti-CD16VHH（B）对双特异抗体介导的细胞毒性干扰试验结果。图9为可溶性CEA对双特异抗体介导的细胞毒性干扰（LS174T）试验结果。图10显示双特异抗体对人结肠癌LS174NOD/SCID小鼠移植瘤生长的抑制作用。具体实施方式纳米抗体Hamers等在1993年偶然发现骆驼体内存在天然缺失整个轻链和重链恒定区CH1的重链抗体（heavychainantibody,hcAb）。重链抗体的可变区（variabledomainsoftheHcAb,VHH）是迄今为止发现的具有抗原结合功能的最小分子量抗体片段，分子量为15kD，仅为常规抗体的1/10，其分子高度约4.8nm，直径约2.2nm，故又被称为纳米抗体（nanobody）或单域抗体（singledomainantibody,sdAb）。纳米抗体的抗原结合区仅由VHH的3个超变区（H1-H3）组成，在空间上形成了与常规抗体典型结构不同的抗原结合域。其中H3的平均长度比常规抗体长，在空间上可呈突出的指状结构，因而可以结合一些常规抗体无法接近的抗原表位。双特异纳米抗体在本发明中，“双特异纳米抗体”、“抗CD16-CEA双特异纳米抗体”、“bsAb”或“双特异抗体”是指包含两个结合结构域的单个多肽链，其中每个“结合结构域”包含一个纳米抗体VHH，其中第一结合结构域的VHH特异性地结合第一分子CEA，第二结合结构域的VHH特异性地结合第二分子CD16。两个结合结构域任选地通过短的间隔多肽（连接肽）彼此连接。在一个实施方式中，所述抗人CEAVHH位于所述抗人CD16VHH的N末端。在另一个实施方式中，所述抗人CEAVHH位于所述抗人CD16VHH的C末端。在本发明中，“在N末端”或在“C末端”是相对而言的，并非双特异抗体的绝对N末端或C末端。作为一个非限制性的例子，“位于第二结合结构域的N末端”的第一结合结构域仅表示第一结合结构域是位于双特异抗体内第二结合结构域的氨基端，并且不排除额外序列（例如如上所述的标签、或另一蛋白质或费蛋白质类的化合物，例如放射性同位素）位于双特异抗体的最终N末端的可能。双特异抗体的第一和/或第二结合结构域可以是非人源性的，例如可以衍生自鼠单克隆抗体。但是，当将其施用于人患者时，衍生自鼠抗体的双特异性单链抗体可能被人体识别为异物。因此，优选地，双特异性单链抗体的第一和/或第二结合结构域为人源性的，即衍生自人的序列。例如，可通过基于噬菌体展示的技术来鉴定特异性结合人CEA或人CD16的结合结构域。或者，其中一个结合结构域是人源性的，另一个是非人源性的，从而产生嵌合的双特异纳米抗体。在本发明的一个实施方式中，所述双特异抗体通过人工合成方法得到核酸序列，通过原核细胞表达和纯化而制得。可以预期到的是，本发明的双特异抗体的结合结构域可带有用于例如蛋白质表达、纯化、检测或富集的“标签”，例如Flag-标签、c-myc-标签、GST-标签或His-标签。例如，对于Flag-标签，目前应用最广泛的是亲水性八肽DYKDDDDK。这些标签可以位于双特异抗体的N末端或C末端。还可以预期到的是，本发明的双特异抗体的结合结构域可带有信号肽，其通常位于分泌蛋白的N端，一般由15～30个氨基酸组成。当信号肽序列合成后，被信号识别颗粒(SRP)所识别，蛋白质合成暂停或减缓，信号识别颗粒将核糖体携带至内质网上，蛋白质合成重新开始。在信号肽的引导下，新合成的蛋白质进入内质网腔，而信号肽序列则在信号肽酶的作用下被切除。如终止转运序列存在于新生肽链的C端，也可以不被信号肽酶切除，如卵清蛋白含有内部信号肽。它的前体与成熟形式都没有被信号肽酶切除的过程。一个示例性的信号肽序列为MGKKIWLALAGLVLAFSASA。术语“特异性地结合”或“与…特异地结合”是指所述双特异抗体的第一和/或第二结合结构域分辨各自第一和/或第二分子至某种程度的能力，从而在来自可能作为结合配体的多种不同分子的库中，仅所述各自的第一和/或第二分子能够被结合或被显著的结合。可以在例如Biacore仪器上，通过ELISA、FACS分析等常规的方法来测定这种结合。具体而言，本发明的双特异抗体的第一结合结构域结合于人CEA（癌胚抗原、癌胚抗原相关的细胞粘附分子5、CEACAM5、CD66e），而第二结合结构域结合于人CD16。“特异性结合”是指本发明的双特异抗体能够特异性地与各人靶标分子的至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多氨基酸相互作用。抗体的“特异性结合”主要由两个参数来表征：定性参数（结合表位或抗体结合位置）和定量参数（结合亲和力或结合强度）。抗体结合表位可通过FACS法、肽点表位作图法、质谱法或肽ELISA法测定。Biacore法和/或ELISA法可测定抗体与特定表位的结合强度。通常将信噪比作结合特异性的代表性测定计算方法。在这样的信噪比中，信号代表抗体结合至目标表位的强度，而噪声代表抗体与其他非目标表位结合的强度。优选地，对于目标表位的信噪比为约50时可以认为所评估的抗体以特异性方式结合至目标表位，即“特异性结合”。CEA阳性表达肿瘤“CEA阳性表达肿瘤”或“CEA阳性肿瘤”是指在细胞表面表达CEA的肿瘤细胞。在本发明中，要治疗的CEA阳性肿瘤可以为胃肠道腺癌、乳腺癌或肺癌。胃肠道腺癌可以选自结直肠癌、胰腺癌、食道癌或胃腺癌。如前所述，本发明的双特异抗体尤其适合治疗具有进行性肿瘤、转移性肿瘤、复发性肿瘤、晚期上皮肿瘤、高上皮肿瘤负荷的患者，或具有CEA血清浓度高于100ng/mL（例如通过ELISA测定）的患者。在某些这些肿瘤患者中，血浆中具有高水平的可溶性CEA抗原。或者，这些肿瘤细胞的周围存在高水平的可溶性CEA。应当意识到的是，在许多基于抗体的治疗方法中，血清CEA抑制抗体与肿瘤细胞膜上的CEA的结合，并且阻断抗体的活性，从而阻碍抗肿瘤治疗的成功。然而，得益于本发明双特异抗体的特殊结构，本发明的双特异抗体不再受限于此。药物组合物“药物组合物”是指用于人的药物制剂。该药物组合物包含本发明的双特异抗体以及载体、稳定剂和/或赋形剂的合适制剂。所述药物组合物可通过适当的方式施用给患者，包括但不限于，灌注、注射、经皮、经鼻、肠胃外、动脉内、静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内、局部施用。本发明的药物组合物还可包含药学上可接受的载体。合适的载体是本领域众所周知的，包括例如磷酸盐缓冲液、水或脂质体等。可以通过本领域的常规方法配制包含这类载体的组合物。本发明的药物组合物可与其他蛋白质或非蛋白质类抗癌药联合使用，例如本发明的药物组合物包含所述其他蛋白质或非蛋白质类抗癌药。在另外的实施方式中，所述其他抗癌药可与本发明的双特异抗体同时施用，或单独地在所述双特异性抗体的施用之前或之后以确定的时间间隔和剂量施用。临床医务人员可根据具体情况确定合理的给药方案。临床的剂量依赖于多种因素，包括患者的体重、年龄、性别、给药途径、总体健康状况等。例如，所述抗癌药为5-氟尿嘧啶、卡培他滨、奥沙利铂、伊立替康、吉西他滨、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、顺铂、卡铂、紫衫烷类（如多西他赛、紫杉醇）。此外，本发明的组合物可以包括蛋白质载体，例如血清白蛋白或免疫球蛋白，优选是人源性的。还可以预期到，所述药物组合物还可以包含更多的生物活性物质，例如抑制免疫反应的药物（如皮质类固醇）、调节炎性反应的药物、细胞生长抑制剂、防止高尿酸血症的药物等。作为优选的方案，所述双特异抗体是以缓冲液、稳定剂和表面活性剂配制。该缓冲液可以是磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐或醋酸盐缓冲液。稳定剂可以是氨基酸和/或糖。表面活性剂可以是增溶剂、PEG等。接头序列或连接肽本发明的双特异抗体还包括位于第一结合结构域和第二结合结构域之间的接头序列，通常为4-20个氨基酸构成的短肽。这些接头序列使得各组分之间被合理地定位而实现各组分的功能活性。优选地，接头序列包括2至20个氨基酸序列，更优选为5至20个氨基酸。接头序列优选为柔性接头序列，因而其不会限制效应分子或多肽在单个不期望的构象中。接头序列优选主要由具有小侧链的氨基酸构成，例如甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸，从而提供所述柔性。优选地，接头序列的约80%以上或更多比例的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基，特别是甘氨酸和丝氨酸残基。合适的接头序列的例子有GGGGS（G4S），即GlyGlyGlyGlySer；或G4SG4SG4S，例如用于连接本发明中的抗人CEAVHH和抗人CD16VHH。也可以使用其他不同的接头序列，包括已被成功地用于连接不同抗体可变区的多种柔性接头设计。接头序列的大小和序列组成可通过常规的电脑建模及技术来确定。在本发明中，“多肽”是指基本上由20种天然氨基酸中的任何几个所组成的任何长度的聚合物。虽然“蛋白质”或“蛋白”通常是指氨基酸长度较大的聚合物，而“肽”通常是指氨基酸长度较小的聚合物，但是这两个术语之间通常没有明显的界限，而且经常范围上有重叠。在本发明中，“载体”为能够在宿主细胞中自主复制且可接受外源DNA的核酸分子。载体带有其自身的复制起始位点，可用于插入外源DNA的限制性内切酶识别位点，以及通常的选择性标记（如编码抗生素抗性的基因），常常还包括用于表达插入的DNA的识别序列（如启动子和增强子）。常见的载体包括质粒载体和噬菌体载体。抗CD16-CEA双特异纳米抗体核苷酸序列的设计和合成1.结构设计根据该双特异抗体的序列和连接形式，重新设计和优化核苷酸序列，并在该序列的5’端加入NcoI酶切位点，在其3’端加入HindIII酶切位点。直接合成DsbA-anti-CEAVHH-(GGGGS)3-anti-CD16VHH-6His，并通过双酶切连接到载体pETDuet中，形成pETDuet-bsAb表达质粒。双特异纳米抗体的结构示意图见图1，其中DsbA代表二硫键形成蛋白A（DisulfidebondformationproteinA），是存在于大肠杆菌周质胞腔内的一种参与新生蛋白质折叠过程中催化二硫键形成的折叠酶。2.载体转化BL21（DE3）将该质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞株，选取阳性克隆，在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基（3mL）中37℃过夜培养，菌液5000rpm常温离心弃上清，所得的大肠杆菌用Qiagen公司的质粒提取试剂盒裂解并提取质粒，获得表达载体。3.抗CEA-抗CD16的表达与纯化纯化后的pETDuet-bsAb表达载体，转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株，选取阳性克隆，在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基（3mL）中37℃过夜培养，转移到含有100μg/mL氨苄青霉素的300mLLB中，37℃培养至OD600在0.6-0.8，加入终浓度为0.05mM的IPTG，16℃诱导16小时。4000rpm，离心弃上清，沉淀按照1:4的重量体积比加入20mMTris-HCl,pH8.0,25%蔗糖，1mMEDTA溶液，重悬后冰浴30min，8500g，4℃离心20分钟，保留上清。沉淀按照1：5的重量体积比加入5mMMgCl2，1mg/mL的溶菌酶溶液重悬，冰浴20min，8500g，4℃离心20分钟，取上清。结合：合并两次上清，过2mLNi-NTA（Qiagen公司）重力沉降柱。除杂：依次以20mL20mMTris-HClpH8.0，15mM咪唑，1MNaCl和20mL20mMTris-HClpH8.0，25mM咪唑，1MNaCl进行除杂。洗脱：依次以10mL20mMTris-HClpH8.0，50mM咪唑，0.15MNaCl、10mL20mMTris-HClpH8.0，100mM咪唑，0.15MNaCl、10mL20mMTris-HClpH8.0，200mM咪唑，0.15MNaCl、10mL20mMTris-HClpH8.0，500mM咪唑，0.15MNaCl进行洗脱。合并50mM咪唑、100mM咪唑以及200mM咪唑洗脱组分，以20mMPB，pH7.6，10%甘油4℃透析过夜。1mLQ-HP纯化：透析过夜后含目标组分溶液，20000g，4℃离心20min后上样，上样流速1mL/min，收集流穿组分进行超滤浓缩。实验结果见图2。双特异抗体体外结合CEA测试1.流式细胞术检测双特异抗体对CEA的结合体外培养LS174T和SKOV3细胞；0.25%胰蛋白酶消化成单细胞，1000rpm离心10min后，收集细胞沉淀，以冰冷PBS+0.2%BSA重悬。离心，4℃，1000rpm，5分钟，弃上清。以冰冷PBS+0.2%BSA重悬，配置成浓度为2*106/mL的细胞悬液。按下表1分别加入一抗：mouseanti-CEA/CD66emAb（1:200）；bsAb（10ug/mL）后4℃孵育1小时。加入5mL冰冷PBS+0.2%BSA。1000rpm，离心5分钟，4℃；细胞沉淀以冰冷1mLPBS+0.2%BSA重悬；1000rpm，离心5分钟，4℃；细胞沉淀以0.5mL冰冷PBS+0.2%BSA重悬；依表1，对应加入二抗，4℃孵育1小时；1000rpm，离心5分钟，4℃；细胞沉淀以冰冷1mLPBS+0.2%BSA重悬；1000rpm，离心5分钟，4℃；细胞沉淀以1mL冰冷PBS+0.2%BSA重悬；1000rpm，离心5分钟，4℃；细胞沉淀以1mL冰冷PBS+0.2%BSA重悬，上机测试。实验结果见图3，显示bsAb可结合肿瘤细胞表面的CEA。表1各管一抗和二抗组分管号一抗二抗A无Goat-Anti-mouseIgG-FITC（1:500）BAnti-CEA（1:200）Goat-Anti-mouseIgG-FITC（1:500）C无Anti-His-FITC（1:500）DbsAb（10ug/mL）Anti-His-FITC（1:500）2.Westernblot检测双特异抗体对CEA的结合体外培养LS174T，HT29以及SKOV3和SKOV3-CEA细胞，RIPA裂解后用BCA法测定蛋白质含量。SDS-PAGE电泳：分离胶浓度8%。每种细胞系裂解物上样量为30μg，120V，恒压45分钟后转膜。转膜：取SDS-PAGE电泳后的分离胶，放在负极，PVDF膜放在正极，进行湿转，100V，90分钟。封闭：取转膜后的PVDF膜，置于含5%脱脂奶粉TBST中，封闭1小时；一抗孵育：双特异抗体（1mg/mL）以1:1000比例稀释于含5%脱脂奶粉TBST中，室温孵育1小时；阳性对照用商品化抗CEA兔单克隆抗体（Abcam公司，货号：），稀释比例1:1000，孵育1小时。内参用兔抗GAPDH单克隆抗体（Abcam公司，货号：）洗膜：TBST洗涤三次，每次10分钟；二抗孵育：抗HisIgG-HRP以1：3000比例稀释于TBST中，室温孵育1小时；阳性对照二抗用抗兔IgGHRP，稀释比例为1:5000，孵育1小时。洗膜：TBST洗涤三次，每次10分钟；显色：将膜置于伯乐的化学发光成像系统中，均匀滴加millipore显色剂，避光进行显影拍照。结果见图4，显示双特异抗体可特异结合LS174T、HT29以及SKOV3-CEA等细胞表达的CEA，而与SKOV3中总蛋白无结合；阳性对照具有相同的实验结果。说明双特异抗体与抗原的结合能力与商品化抗CEA抗体均可结合CEA。体外细胞毒性实验1.体外细胞毒性试验将SKOV3、HT29以及LS174T肿瘤细胞，加0.25%胰蛋白酶消化成单个细胞后，铺96孔板，每孔5000个细胞。37℃，5%二氧化碳培养6个小时。每孔加入5*104个NK细胞，分别加入0，0.28μg/mL，2.8μg/mL的bsAb。37℃，5%二氧化碳培养48个小时。吸取培养基，以PBS轻轻清洗两次。加入CCK8试剂，孵育2小时。用酶标仪以620nm为参比，测定OD450的读数。裂解率用如下公式进行计算：裂解率=1-（As-Ab）/（A0-Ab），其中Ab为空白对照吸收值，As为实验组吸收值，A0为未加药孔吸收值。实验结果见图5。2.EC50测试将HT29以及LS174T肿瘤细胞，加0.25%胰蛋白酶消化成单个细胞后，铺96孔板，每孔5000个细胞。37℃，5%二氧化碳培养6个小时。每孔加入5*104个NK细胞，分别加入0，0.28μg/mL，2.8μg/mL的bsAb。37℃，5%二氧化碳培养48个小时。吸取培养基，以PBS轻轻清洗两次。加入CCK8试剂，孵育2小时。用酶标仪以620nm为参比，测定OD450的读数。裂解率用如下公式进行计算：裂解率=1-（As-Ab）/（A0-Ab），其中Ab为空白对照吸收值，As为实验组吸收值，A0为未加药孔吸收值。实验结果见图6。Anti-CD16VHH以及anti-CEAVHH体外干扰试验将SKOV3以及LS174T肿瘤细胞，加0.25%胰蛋白酶消化成单个细胞后，铺96孔板，每孔5000个细胞。37℃，5%二氧化碳培养6个小时。每孔加入5*104个PBMC，分别加入0.1nMbsAb和0、0.5nM、5nM的anti-CD16VHH或者anti-CEAVHH，置于37℃，5%二氧化碳培养48个小时。吸取培养基，以PBS轻轻清洗两次。按每孔90μL培养基和10μLCCK8，加入CCK8试剂，孵育2小时。用酶标仪以620nm为参比，测定OD450的读数。裂解率用如下公式进行计算：裂解率=1-（As-Ab）/（A0-Ab），其中Ab为空白对照吸收值，As为实验组吸收值，A0为未加药孔吸收值。实验结果见图7、8，其中CEA表达阴性SKOV3细胞系中，bsAb介导的NK细胞对其不产生杀伤效应，且anti-CEAVHH以及anti-CD16VHH也无干扰效应。在CEA阳性细胞系LS174T中，0.1nM的bsAb可明显介导NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。且对bsAb介导的杀伤作用无干扰。可溶性CEA干扰试验将SKOV3以及LS174T肿瘤细胞，加0.25%胰蛋白酶消化成单个细胞后，铺96孔板，每孔5000个细胞。37℃，5%二氧化碳培养6个小时。每孔加入5*104个PBMC，分别加入0.1nMbsAb和0、0.028nM、0.28nM的anti-CD16VHH或者anti-CEAVHH，置于37℃，5%二氧化碳培养48个小时。吸取培养基，以PBS轻轻清洗两次。按每孔90μL培养基和10μLCCK8，加入CCK8试剂，孵育2小时。用酶标仪以620nm为参比，测定OD450的读数。裂解率用如下公式进行计算：裂解率=1-（As-Ab）/（A0-Ab），其中Ab为空白对照吸收值，As为实验组吸收值，A0为未加药孔吸收值。实验结果见图9：可溶性CEA对bsAb介导的NK细胞杀伤作用，无干扰作用。体内抗肿瘤活性实验培养LS174T细胞至对数生长期LS174T，加0.25%胰蛋白酶消化成单细胞，200g离心5分钟，收集细胞沉淀，以PBS重悬后计数，配置成107个/mL的细胞悬液。背部皮下注射NOD/SCID小鼠0.1mL。收集健康志愿者全血，采用Ficoll法分离PBMC，以PBS重悬计数，配置成106个/mL的细胞悬液。于种植肿瘤细胞24小时后，每只小鼠腹腔注射0.1mL。对照组给予PBS单独注射，实验组为20ug/kg剂量的bsAb。小鼠肿瘤用游标卡尺测量直径。使用测量瘤径的方法，动态观察被试动物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为2-3天1次，每次测量同时还需称重体重。实验组采用腹腔注射0.1mL抗CEA-抗CD16双特异抗体，每天1次，连续7天，阴性组同时给予等量生理盐水。肿瘤体积计算公式：V=长*宽2/2。实验结果见图10。阴性对照组与模型组的试验末期，肿瘤体积相差不大。而给药组体积与对照组与模型组相比，仅为其肿瘤体积的10%。此外，在观察期内，小鼠体重持续增长，说明药物毒性较小，副作用低。本领域技术人员会容易意识到，本发明可容易改造而获得本文所述的那些目的和优点以及隐含在本文中的那些目的和优点。在本文中以当前优选实施方式的代表的形式描述的方法、变体和组合物是示例性的，并不意在限制本发明的范围。对于本领域技术人员来说，可对它们做出改变或将其用于其他用途，但这都包括在如所附权利要求定义的本发明的范围内。虽然本发明已通过优选实施方式和任选的特征具体公开，但本领域技术人员可对本文公开的想法做出修改和变化，而这些修改和变化仍属于所附权利要求定义出的本发明的范围之内。<110>中山大学<120>用于治疗CEA阳性表达肿瘤的双特异纳米抗体<130>14196CN<160>4<170>PatentInversion3.5<210>1<211>121<212>PRT<213>人工序列<400>1LeuGluGluValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnPro151015GlyGluSerLeuThrLeuSerCysValValAlaGlySerIlePheSer202530PheAlaMetSerTrpTyrArgGlnAlaProGlyLysGluArgGluLeu354045ValAlaArgIleGlySerAspAspArgValThrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnIleLysArgThrAlaGly65707580LeuGlnMetAsnSerLeuLysProGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AsnAlaGlnThrAspLeuArgAspTrpThrValArgGluTyrTrpGly100105110GlnGlyThrGlnValThrValSerSer115120<210>2<211>120<212>PRT<213>人工序列<400>2GluValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlyPheValGlnAlaGlyGlu151015SerLeuThrLeuSerCysThrSerSerThrLeuThrPheThrProTyr202530ArgMetAlaTrpTyrArgGlnAlaProGlyLysGlnArgAspLeuVal354045AlaAspIleSerSerGlyAspGlyArgThrThrAsnTyrAlaAspPhe505560AlaLysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnIleLysAsnThrVal65707580PheLeuArgMetThrAsnLeuLysProGluAspThrAlaValTyrTyr859095CysAsnThrPheValSerPheValGlyIleAlaArgSerTrpGlyGln100105110GlyThrGlnValThrValSerSer115120<210>3<211>15<212>PRT<213>人工序列<400>3GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer151015<210>4<211>20<212>PRT<213>人工序列<400>4MetGlyLysLysIleTrpLeuAlaLeuAlaGlyLeuValLeuAlaPhe151015SerAlaSerAla20当前第1页1 2 3