针对肿瘤标志物建立的抗体组合及其ELISA方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及针对肿瘤标志物建立的抗体组合及其ELISA方法。

背景技术：

恶性肿瘤最重要的特点是局部浸润和远处转移，且是致死的主要原因。它由一个细胞转化不断增生繁衍形成，可发展浸润到局部组织，并转移远处部位，这种扩散到其他部位的肿瘤已经属于高度恶性级，其治愈的可能性已经是微乎其微了。目前，发达国家肿瘤的诊断与治疗多在早期，相应的一些肿瘤标志物作为必检项目，所以肿瘤特异标记物是肿瘤早期诊断、个体化医疗和肿瘤预测及预防的关键。但是目前世界上很少有特异的标记物，不能单纯依据肿瘤标志物确诊肿瘤。因此，充分利用本地丰富的临床资源进行生物标记物（尤其是对广东危害严重的恶性肿瘤）的研发和应用，既顺应市场的实际需求，也符合国家的战略需要。在癌症的早期阶段，只有很微量的特异肿瘤标志物被分泌并释放到血液中，直接检测方法难以检测到这些生物标志物的变化。然而，即使是微量的这些生物标志物作为自身抗原时，可以刺激免疫系统，产出大量的针对性抗体，利用这个信号放大的结果更有利于肿瘤的检测。

抗体是迄今为止被人类研究的最深入的一组生物结合分子。它们被广泛地应用于生物和医学领域，起到了非常重要的作用。但是，受体积、低稳定性等影响，它们在诊断领域的应用受到限制。抗体类似物的开发解决了这个难题，它体积小但具有抗原决定簇，能够绑定在靶蛋白上，因此具备作为分子生物学工具的潜能。此外，通过与新的医疗保健产品结合，它们能够被用作治疗剂和用于探测病人样本中的蛋白质并使之成像的工具。他们还可以被用于鉴定细胞系和组织样本上的新生物标志物。

由于抗体芯片中的关键材料——检测抗体受体积、低稳定性、高生产成本及批次间的差异和自身分子量大而导致的空间位阻的影响，抗体在包括抗体芯片在内的诊断领域的应用往往有限。为了解决这些问题，科学家们开发了体积小且活性强的重组抗体类似物，以用于分子识别。抗体类似物与抗体相比具有良好的溶解性、组织渗透性、热稳定性、酶稳定性、生产成本低等优点，因此，筛选出稳定的抗体类似物，能够广泛取代抗体用于高通量技术（抗体芯片）筛分多种不同抗体类似物库进行抗体类似物结合试剂的开发。

技术实现要素：

本发明公开肿瘤标志物S100B的5个比较好的抗体类似物为S100B-A10、S100B-A12、S100B-B11、S100B-D10和S100B-D12；肿瘤标志物GP73的抗体类似物为GP73-A5、GP73-B4、GP73-F6和GP73-G4；肿瘤标志物CK8的抗体类似物为CK8-F5和CK8-12。但是这些抗体类似物的应用还没有进行研究。尤其是将这些抗体类似物经过活性及抗体对检测后，把最好的靶标抗体对应用于抗体芯片的制备，为开发性能稳定、诊断灵敏度高和特异性强的新型肿瘤标志物免疫检测试剂盒奠定基础。这将为肿瘤的早期肿瘤早期诊断、个体化医疗和肿瘤预测提供一种可靠的途径。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的。

针对肿瘤标志物建立的ELISA抗体组合，以肿瘤标志物的抗体类似物与其常规抗体配对。

优选地，所述肿瘤标志物为S100B、GP73或CK8。

针对肿瘤标志物S100B建立的ELISA抗体组合，S100B标志物的抗体组合为以抗S100B的常规抗体为包被抗体，以S100B的抗体类似物S100B-A10、S100B-A12、S100B-B11、S100B-D10或S100B-D12为检测抗体。

针对肿瘤标志物GP73建立的ELISA抗体组合，GP73标志物的抗体组合为以抗GP73的常规抗体为包被抗体，以GP73的抗体类似物GP73-A5、GP73-B4、GP73-F6或GP73-G4为检测抗体。

针对肿瘤标志物CK8建立的ELISA抗体组合，CK8标志物的抗体由抗CK8的抗体类似物F5和抗CK8的常规抗体组成。

优选地，S100B标志物的抗体组合为以抗S100B的常规抗体为包被抗体，以S100B的抗体类似物S100B-D10为检测抗体。

优选地，GP73标志物的抗体组合为以抗GP73的常规抗体为包被抗体，以GP73的抗体类似物GP73-G4为检测抗体。

优选地，CK8标志物的抗体组合为以CK8抗体类似物F5作为捕获抗体，相应的常规抗体237或260做检测抗体；

或以CK8抗体类似物F5作为检测抗体，相应的常规抗体260或251做捕获抗体。

本发明已分别筛选出针对3种肿瘤标志物的抗体类似物，包括S100B、GP73和CK8，用于鉴定人工结合蛋白。

本发明采用一种亲和选择和基因表达产物相结合的技术，以改造的噬菌体为载体，将编码外源多肽或蛋白质的外源DNA片段克隆入噬菌体外壳蛋白的结构基因的适当位置，在不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，外源多肽或者蛋白质与噬菌体外壳蛋白融合表达，随着子代噬菌体的重新组装，融合蛋白将展示在病毒颗粒的表面，而编码该融合子的DNA则位于该噬菌体内，通过测序可以得知表达外源多肽或者蛋白的DNA片段。

本发明采用一个抗体序列库，使大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使得各种靶分子的多肽配体通过一种被称为淘选的体外选择程序得以快速鉴定。

噬菌体淘选与扩增利用抗原-抗体的特异性亲和力，首先，将生物素标记的靶蛋白包被到链霉亲和素标记的磁珠酶标板上，再加入噬菌体（库容量3×10¹⁰），反应1h后，不能结合的噬菌体仍在溶液中，可以通过洗涤去除，再将特异结合的噬菌体洗脱下来，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，如此 经过3轮～5轮的“吸附-洗脱-扩增”，即可将有用的基因从多达百万以上的噬菌体克隆中分离出来。

此实验经过重复淘选3轮，应用噬菌体ELISA进行阳性验证。先将抗原包被在酶标板上，封闭后加入含噬菌体抗体的培养上清，然后加入HRP标记的抗噬菌体抗体；最后通过TMB显色，如淘选出的噬菌体为目标噬菌体，则阳性反应显蓝色，而对照不显色。

优选地，将反应为阳性的克隆进行测序后，导入载体，转入大肠杆菌进行蛋白表达。

将阳性较强的噬菌体的基因进行PCR扩增提取后，用双酶切法将其连接到pET11A载体，转化到BL21进行诱导表达目标蛋白，然后用过柱层析法对目标蛋白进行提取和纯化。获得的相应蛋白，即为抗体类似物。

优选地，在获得抗体类似物后，研究团队对抗体类似物的活性及相应的抗体对进行筛选测试，拟为抗体类似物芯片免疫试剂的进一步开发提供最佳的抗体对。

通常筛选抗体对的方法是夹心ELISA，本发明采用的夹心ELISA方案是：

（1）将抗体类似物包被于NUNC微孔板，孵育、封闭后，加入靶标抗原孵育1h；随后操作如噬菌体ELISA，加入噬菌体中分离的抗体类似物，然后加入HRP标记的抗噬菌体抗体，最后通过TMB显色，能配成对的抗体类似物反应显蓝色，而未能配对的类似物和对照组不显色。

（2）采用针对相应靶标的单抗作为包被抗体，包被于酶标板，4℃温育过夜；室温用封闭液封闭2h后，加入梯度稀释的对应靶标物（抗原），室温温育2h；洗涤完成后加入上述生物素标记的抗体类似物，室温温育1.5～2h；洗涤完成后加入链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶，室温温育45 min；最后加入显色液显色，显色完全加入终止液终止到显黄色并用酶标仪进行OD₄₅₀的测定读数；根据所得数据（OD值）观测是否是与抗原浓度成正比关系，如果是表示：可以成抗体对，如果没有，则没有成抗体对，即不能测定其靶标，梯度越明显越有利于靶标的测定。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

用于配对的抗体类似物，具有体积小且活性强的特性，与抗体相比具有良好的溶解性、组织渗透性、热稳定性、酶稳定性、生产成本低等优点。

附图说明

图1为GP73的噬菌体-ELISA特异反应结果。

图2为S100B的噬菌体-ELISA特异反应结果。

图3为 CK8的噬菌体-ELISA特异反应结果。

图4为S100B抗体类似物活性测定结果。

图5为GP73抗体类似物活性测定结果。

图6为S100B抗体类似物抗体对筛选结果。

图7为GP73抗体类似物抗体对筛选结果。

具体实施方式

下面通过说明书附图和具体实施例对本发明进一步具体描述，下述所使用的实验方法若无特殊说明，均为本技术领域现有常规的方法，所使用的配料或材料，如无特殊说明，均为通过商业途径可得到的配料或材料。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

实施例1

本发明公开肿瘤标志物S100B的5个比较好的抗体类似物为S100B-A10、S100B-A12、S100B-B11、S100B-D10和S100B-D12；肿瘤标志物GP73的抗体类似物为GP73-A5、GP73-B4、GP73-F6和GP73-G4；肿瘤标志物CK8的抗体类似物为CK8-F5和CK8-12。

抗体类似物的制备，流程如下：

首先，将生物素标记的靶蛋白包被到链霉亲和素标记的磁珠酶标板上，再加入噬菌体（库容量3×10¹⁰）；

反应1h后，不能结合的噬菌体仍在溶液中，可以通过洗涤去除，再将特异结合的噬菌体洗脱下来；

洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱；

如此 经过3～5轮的“吸附-洗脱-扩增”，即可将有用的基因从多达百万以上的噬菌体克隆中分离出来。

此实验经过重复淘选3轮，应用噬菌体ELISA进行阳性验证。

先将抗原包被在酶标板上，封闭后加入含噬菌体抗体的培养上清；

然后加入HRP标记的抗噬菌体抗体；

最后通过TMB显色，如淘选出的噬菌体为目标噬菌体，则阳性反应显蓝色，而对照不显色；对于靶标CK8，则在特定波长下检测实验组和对照组的光密度值（OD值），对阳性克隆进行筛选，如图3所示，其中实验组OD值比对照组明显增大（>100），只有个别的克隆与蛋白靶标没有特异性结合。

完成了抗体类似物的筛选，将反应为阳性的克隆进行测序后，导入载体，转入大肠杆菌进行蛋白表达。

首先，将阳性较强的噬菌体的基因进行PCR扩增提取后，用双酶切法将其连接到pET11A载体，转化到BL21进行诱导表达目标蛋白；

然后用过柱层析法对目标蛋白进行提取和纯化；

获得的相应蛋白，即为抗体类似物。

实施例2

针对已报道的抗体类似物，本发明首先研究了其活性，以鉴定其是否针对相应的抗原有较好的结合原性。

采用直接ELISA方法，而进行直接ELISA测定前，需要对抗体类似物进行生物素标记。然后将对应的抗原梯度包被于酶联板，4℃温育过夜后室温进行封闭1.5 h；待封闭后加入生物素标记好的抗体类似物，室温温育2h；之后加入链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶（streptavidin-HRP），室温温育45 min；最后加入TMB显色，显色完成后加入终止液终止到显黄色，并用酶标仪进行OD₄₅₀的测定读数；根据所得数据观测是否随着抗原浓度的降低，呈现相应的梯度降低，如果是，表示有结合原性，否则则没有结合原性或者结合原性不好。

目前，针对相应的靶标物，本发明研究团队已经完成对S100B（含5个类似物）、GP73（含4个类似物）的结合原性的测定，结果如图4（S100B）、图5（GP73）所示。从两个图中可以看出，各个抗体类似物对其相应的靶标均表现出了结合原性，结合原性也较强。

实施例3

夹心ELISA方法筛选相应靶标的抗体对，筛选抗体对的方法是夹心ELISA：

方案1：将抗体类似物包被于NUNC微孔板，孵育、封闭后，加入靶标抗原孵育1h；

随后操作如噬菌体ELISA，加入噬菌体中分离的抗体类似物，然后加入HRP标记的抗噬菌体抗体，最后通过TMB显色，能配成对的抗体类似物反应显蓝色，而未能配对的类似物和对照组不显色。

方案2：采用自有的针对相应靶标的单抗作为包被抗体，包被于酶标板，4℃温育过夜；

室温用封闭液封闭2h后，加入梯度稀释的对应靶标物（抗原），室温温育2h；洗涤完成后加入上述生物素标记的抗体类似物，室温温育1.5～2h；洗涤完成后加入链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶，室温温育45 min；最后加入显色液显色，显色完全加入终止液终止到显黄色并用酶标仪进行OD₄₅₀的测定读数；

根据所得数据（OD值）观测是否是与抗原浓度成正比关系，如果表示：可以成抗体对，如果没有，则没有成抗体对，即不能测定其靶标，梯度越明显越有利于靶标的测定。

针对相应的靶标物，本发明已经完成对S100B和GP73抗体类似物的抗体对的测定，采用夹心ELISA方案2进行，结果如图6（S100B）和图7（GP73）所示，并且成功的获得了相应抗体对。

S100B的抗体对中，最好的是常规抗体（抗S100B抗体）和抗体类似物（S100B-D10）的抗体对最好；图7中可得出，其常规抗体（抗GP73抗体）做为包被抗体，相应的抗体类似物（GP73-A5、GP73-B4、GP73-F6和GP73-G4）做检测抗体时，均可以成为较好的抗体对，其中GP73-G4与之成的抗体对是最好的。

实施例4

按照实施例2中方案2的方法，对CK8抗体类似物的配对情况进行鉴定，如表1。

表1

由表1中可得出，以CK8抗体类似物F5做为捕获抗体，相应的常规抗体（237，260）做检测抗体时，均可以成为较好的抗体对，而与另一CK8抗体类似物12配对时并没有优势，相应的常规抗体（251，259）配对结果差。

另外，以CK8抗体类似物F5做为检测抗体，相应的常规抗体（260，251）做检测抗体时，均可以成为较好的抗体对，而与常规抗体（237，259）配对结果差（见表2）。

表2

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