一种伽氏疏螺旋体多克隆抗体及应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种伽氏疏螺旋体多克隆抗体，以及该抗体在制备莱姆病螺旋体的检测试剂中的应用。

背景技术：

莱姆病(LD)是20世纪70年代发现的一种以蜱作为传播媒介的自然疫源性疾病，该病能引发多器官多系统感染，其临床症状可分为三期，第一期典型症状为慢性游走红斑；第二期通常表现为神经系统症状或心脏受累；第三期主要症状表现为关节疼痛、神经系统损害或是慢性萎缩性肢皮炎，少数患者可转变为慢性病(宝福凯,柳爱华.2007.伯氏疏螺旋体与莱姆病研究进展.热带医学杂志.11.1125-1127.；Nau R.,Christen H.,Eiffert H..2009.Lyme Disease-Current State of Knowledge.Dtsch Arztebl Int.106.72-82.；Bhate C.,Schwatrz R.A..2011.Lyme disease:Part I.Advances and perspectives.J Am Acad Dermatol.64.619-636.)。莱姆病病原体是广义伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi sensu lato)，包括3个致病基因型狭义伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi sensu stricto)、伽氏疏螺旋体(B.garinii)和阿氏疏螺旋体(B.afzelii)。研究表明，不同基因型莱姆病螺旋体所引起的临床症状相差较大，B.burgdorferi s.s.主要引起莱姆关节炎，B.garinii主要引起神经功能紊乱，而B.afzelii主要侵犯皮肤组织(Busch U.,Hizo-Teufel C.,Boehmer R.,Fingerle V.,Nitschko H.,Wilske B.,and Preac-Mursic V..1996.Three species of Borrelia burgdorferi sensu lato(Borrelia burgdorferi sensu stricto,B.afzelii,and B.garinii)identified from cerebrospinal fluid isolates by pulsed-field gel electrophoresis and PCR.J.Clin.Microbiol.34,1072-1078.；Steere A.C..2001.Lyme disease.N.Engl.J.Med.345,115-125.；Steere A.C.,Coburn J.,and Glickstein L..2004.The emergence of Lyme disease.J.Clin.Invest.113,1093-1101.)。我国存在B.garinii、B.afzelii等多种基因型莱姆病螺旋体，其自然疫源地分布广泛，20多个省、自治区、直辖市都有报道(万康林，张哲夫，张金声，窦桂兰，王宏英，侯学霞，朱桂凤.1998.中国20个省、区、市动物莱姆病的初步调查研究.中国媒介生物学及控制杂志.9,366-370.)。由于莱姆病临床症状复杂多样、易于误诊，已经成为我国一种重要的虫媒传播疾病。

目前莱姆病诊断主要依赖于流行病学史、临床症状以及实验室检查结果的综合分析。在实验室诊断方面，由于莱姆病螺旋体分离困难、培养周期长，目前已很少使用；PCR技术虽然具有特异性高，操作简单，耗时短等优点，但其在实验中容易交叉污染，且目前尚未建立标准的DNA提取方法，也尚未对各种PCR方法的有效性进行横向比对。目前血清学方法在莱姆病的实验室诊断中应用的最为广泛，主要有免疫荧光法，酶联免疫吸附试验，免疫印迹等。这些血清学检测方法都建立在抗原抗体特异性结合的基础上，利用荧光、酶标等显色技术达到检测的目的。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种伽氏疏螺旋体多克隆抗体及应用。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种伽氏疏螺旋体多克隆抗体，通过以下方法制备得到：

(1)抗原制备：将伽氏疏螺旋体菌株接种至BSK-II培养基，在33-37℃、体积浓度为5％的CO₂恒温培养箱培养至菌体浓度1-2×108cfu/ml，获得培养液；然后将培养液在4℃，3200rcf离心25min，收集沉淀并用NaCl水溶液重悬清洗两次；接着用含甲醛的NaCl水溶液重悬菌体后于60℃水浴中温育1h，并不时摇动；4℃、3200rcf离心25min，收集菌体沉淀，再用NaCl水溶液洗涤三次，获得伽氏疏螺旋体菌体抗原；所述NaCl水溶液中，NaCl的质量浓度为0.9％；所述含甲醛的NaCl水溶液中，甲醛的质量浓度为0.3％-0.5％；

(2)动物免疫：获得的伽氏疏螺旋体菌体抗原用质量浓度为0.9％的NaCl水溶液重悬，免疫注射用菌体抗原悬浮液浓度5×10⁸-10×10⁸cfu/ml；首次免疫，取500μl悬浮液与等量弗氏完全佐剂乳化混合，于新西兰大白兔背部多点皮内注射；第二次免疫、第三次免疫、第四次免疫均取500μl悬浮液与等量弗氏不完全佐剂乳化混合，于新西兰大白兔背部多点皮内注射；首次免疫、第二次免疫、第三次免疫、第四次免疫注射时间间隔分别为21天、14天、7天；

(3)血清获取：第四次免疫完成后7天，用质量浓度为5％-15％的水合氯醛的水溶液，按照5-10ml/kg的剂量麻醉新西兰大白兔，用采血针进行颈动脉采集全血；全血室温凝固后，4℃放置过夜，3000rcf离心10min，吸取上清，得伽氏疏螺旋体多克隆抗体，-80℃保存备用。

上述伽氏疏螺旋体多克隆抗体可用于制备莱姆病螺旋体的检测试剂。

本发明的有益效果是，本发明提供了一种伽氏疏螺旋体多克隆抗体及该抗体在制备莱姆病螺旋体的检测试剂中的应用。本发明制备的多克隆抗体特异性好，效价高，能有效检出莱姆病螺旋体，具有很强的应用前景。

附图说明

图1为莱姆病螺旋体的免疫荧光检测结果图，图中，A.为本发明伽氏疏螺旋体多克隆抗体检测莱姆病螺旋体效果图，B.为对照组；

图2为幼蜱中肠莱姆病螺旋体的免疫荧光检测结果图，图中，A为本发明伽氏疏螺旋体多克隆抗体检测到蜱携带菌效果图；B为本发明伽氏疏螺旋体多克隆抗体检测无菌的蜱的中肠效果图。

具体实施方式

本发明提供了一种伽氏疏螺旋体多克隆抗体，它通过以下方法制备得到：

1、抗原制备：将伽氏疏螺旋体菌株接种至BSK-II培养基，在33-37℃、体积浓度为5％的CO₂恒温培养箱培养至菌体浓度1-2×108cfu/ml，获得培养液；然后将培养液在4℃，3200rcf离心25min，收集沉淀并用NaCl水溶液重悬清洗两次；接着用含甲醛的NaCl水溶液重悬菌体后于60℃水浴中温育1h，并不时摇动；4℃、3200rcf离心25min，收集菌体沉淀，再用NaCl水溶液洗涤三次，获得伽氏疏螺旋体菌体抗原；所述NaCl水溶液中，NaCl的质量浓度为0.9％；所述含甲醛的NaCl水溶液中，甲醛的质量浓度为0.3％-0.5％；

2、动物免疫：获得的伽氏疏螺旋体菌体抗原用质量浓度为0.9％的NaCl水溶液重悬，免疫注射用菌体抗原悬浮液浓度5×10⁸-10×10⁸cfu/ml；首次免疫，取500μl悬浮液与等量弗氏完全佐剂乳化混合，于新西兰大白兔背部多点皮内注射；第二次免疫、第三次免疫、第四次免疫均取500μl悬浮液与等量弗氏不完全佐剂乳化混合，于新西兰大白兔背部多点皮内注射；首次免疫、第二次免疫、第三次免疫、第四次免疫注射时间间隔分别为21天、14天、7天；

3、血清获取：第四次免疫完成后7天，用质量浓度为5％-15％的水合氯醛的水溶液，按照5-10ml/kg的剂量麻醉新西兰大白兔，用采血针进行颈动脉采集全血；全血室温凝固后，4℃放置过夜，3000rcf离心10min，吸取上清，得伽氏疏螺旋体多克隆抗体，-80℃保存备用。

效价测定方法如下：采用间接ELISA法对伽氏疏螺旋体多克隆抗体效价进行测定。酶标板用伽氏疏螺旋体菌体抗原包被，阳性血清和阴性血清按1:1000，1:4000，1:8000，1:16000，1:32000，1:64000，1:128000稀释，以阳性血清浓度OD值大于阴性血清OD值2倍作为阳性判定标准。所用酶标二抗为羊抗兔IgG(H+L)-HRP，阳性血清为伽氏疏螺旋体多克隆抗体，阴性血清为新西兰大白兔免疫前血清。

上述步骤(1)中所述伽氏疏螺旋体菌株来源广泛，本发明中优选为B.garinii NMJW1菌株(Chu C.Y.,Jiang B.G.,He J.,Gao Y.,Zhang P.H.,Wu X.M.,Zhang W.Y.,Shi H.,Gaowa H.S.,Wang J.B.,Foley J.E.,Liu W.,and Cao W.C..2010.Genetic diversity of Borrelia burgdorferi sensu lato isolates from Northeastern China.Vector Borne And Zoonotic Dis.11,877-882.)。

上述步骤(2)中免疫的方法多种多样，如：皮下注射法、肌肉注射法、腹腔注射法等。用于免疫的动物可以是鼠、兔、羊、马、猪、驴等可用于免疫的动物，所用免疫原的计量视具体免疫动物而定。

效价测定方法如下：采用间接ELISA法对伽氏疏螺旋体多克隆抗体效价进行测定。酶标板用伽氏疏螺旋体菌体抗原包被，阳性血清和阴性血清按1:1000，1:4000，1:8000，1:16000，1:32000，1:64000，1:128000稀释，以阳性血清浓度OD值大于阴性血清OD值2倍作为阳性判定标准。所用酶标二抗为羊抗兔IgG(H+L)-HRP，阳性血清为伽氏疏螺旋体多克隆抗体，阴性血清为新西兰大白兔免疫前血清。

用本发明的伽氏疏螺旋体多克隆抗体检测莱姆病螺旋体的方法为：(1)将莱姆病螺旋体或疑似携带莱姆病螺旋体的饱血蜱虫组织在免疫组化玻片上自然干燥10-30min；(2)60-65℃固定30min；(3)将免疫组化玻片置于丙酮中固定5min，室温干燥10-20min；(4)加100μl PST封闭液于样品上，将免疫组化玻片置于密封黑盒中并保持潮湿，37℃孵育30min；所述PST封闭液为每100ml中含有5g牛血清蛋白，50μl Tween-20的PBS溶液；(5)移除PST封闭液，加入100μl一抗工作液，37℃孵育45-60min，所述一抗工作液为伽氏疏螺旋体多克隆抗体用PST封闭液作1：100稀释；(6)移除一抗工作液，用PBS清洗样品3次，每次5min；(7)加入100μl二抗工作液，37℃孵育45-60min，所述二抗工作液为羊抗兔IgG(H+L)荧光抗体用PST封闭液做1:200稀释；(8)移除二抗工作液，用PBS清洗样品3次，每次5min(9)封片后置于荧光显微镜下观察。

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1.伽氏疏螺旋体多克隆抗体制备

(1)抗原制备：将伽氏疏螺旋体B.garinii NMJW1菌株接种至50ml BSK-II培养基(美国Sigma-Aldrich公司)中，在33℃、5％CO2恒温培养箱培养至菌体浓度2×108cfu/ml，获得培养液；然后将培养液在4℃，3200rcf离心25min，收集沉淀并用质量浓度0.9％NaCl水溶液重悬清洗两次；接着用含0.3％-0.5％甲醛的0.9％NaCl水溶液重悬菌体后于60℃水浴中温育1h，并不时摇动；4℃，3200rcf离心25min，收集菌体沉淀，用0.9％NaCl水溶液洗涤三次，获得伽氏疏螺旋体菌体抗原；

(2)动物免疫：将获得的伽氏疏螺旋体用10ml 0.9％NaCl水溶液重悬，免疫注射用全菌抗原悬浮液浓度10×108cfu/ml；首次免疫，取500μl悬浮液与等量弗氏完全佐剂乳化混合，与新西兰大白兔背部多点皮内注射；第二次免疫、第三次免疫、第四次免疫均取500μl悬浮液与等量弗氏不完全佐剂乳化混合，与新西兰大白兔背部多点皮内注射；首次免疫、第二次免疫、第三次免疫、第四次免疫注射时间间隔分别为21天、14天、7天；

(3)血清获取：第四次免疫完成后7天，用10％水合氯醛，按照10ml/kg的剂量麻醉新西兰大白兔，用采血针进行颈动脉采集全血；全血室温凝固后，4℃放置过夜，3000rcf离心10min，吸取上清，至此获得伽氏疏螺旋体多克隆抗体，-80℃保存备用；

效价测定：采用间接ELISA法对伽氏疏螺旋体多克隆抗体效价进行测定。酶标板用伽氏疏螺旋体菌体抗原包被，阳性血清和阴性血清按1:1000，1:4000，1:8000，1:16000，1:32000，1:64000，1:128000稀释，以阳性血清浓度OD值大于阴性血清OD值2倍作为阳性判定标准。所用酶标二抗为羊抗兔IgG(H+L)-HRP(美国Jackson ImmunoResearch公司)，阳性血清为伽氏疏螺旋体多克隆抗体，阴性血清为新西兰大白兔免疫前血清。ELISA结果显示，所获得的伽氏疏螺旋体多克隆抗体效价大于1:64000。

实施例2.莱姆病螺旋体的免疫荧光检测

(1)将伽氏疏螺旋体B.garinii NMJW1菌株接种至15ml BSK-II培养基(美国Sigma-Aldrich公司)中，在33℃、5％CO2恒温培养箱培养至菌体浓度5×107cfu/ml，获得菌体培养液；

(2)将步骤(1)的菌体培养液在4℃，3200rcf离心25min，收集沉淀并用15ml质量浓度0.9％NaCl水溶液重悬清洗，重复两次，最终离心获得菌体；

(3)将步骤(2)获得的菌体用10ml 0.9％NaCl水溶液重悬，取10μl悬浮液均匀涂布在免疫组化玻片上，自然干燥10min；

(4)将步骤(3)获得的免疫组化玻片在60℃固定30min；

(5)将步骤(4)获得的免疫组化玻片置于丙酮中固定5min，室温干燥20min；

(6)加100μl PST封闭液于样品上，将免疫组化玻片置于密封黑盒中并保持潮湿，37℃孵育30min；所述PST封闭液为每100ml中含有5g牛血清蛋白，50μl Tween-20的PBS溶液；

(7)移除PST封闭液，加入100μl一抗工作液，37℃孵育60min，所述一抗工作液为伽氏疏螺旋体多克隆抗体用PST封闭液作1：100稀释；

(8)移除一抗工作液，用PBS清洗免疫组化玻片3次，每次5min；

(9)加入100μl二抗工作液，37℃孵育60min，所述二抗工作液为羊抗兔IgG(H+L)-Alexa Fluor 488(美国Jackson ImmunoResearch公司)用PST封闭液做1:200稀释；

(10)移除二抗工作液，用PBS清洗免疫组化玻片3次，每次5min；

(11)封片后置于荧光显微镜下观察，具体如图1所示。图1的A显示，本发明的伽氏疏螺旋体多克隆抗体与实验室培养的伽氏疏螺旋体菌的温育后，再与绿色荧光标记的二抗反应，成功检测出了螺旋体菌(绿色荧光)；B显示，伽氏疏螺旋体菌直接与绿色荧光标记的二抗温育，无绿色荧光杂交结果，作为对照组。

实施例3.幼蜱中肠莱姆病螺旋体的免疫荧光检测

(1)收集饱血后掉落的幼蜱，随机取10只解剖中肠组织；

(2)将中肠组织用PBS溶液清洗3次后，置于免疫组化玻片上自然干燥20min；

(3)将步骤(2)获得的免疫组化玻片60℃固定30min；

(4)将免疫组化玻片置于丙酮中固定5min，室温干燥20min；

(5)加100μl PST封闭液于中肠组织上，将免疫组化玻片置于密封黑盒中并保持潮湿，37℃孵育30min；所述PST封闭液为每100ml中含有5g牛血清蛋白，50μl Tween-20的PBS溶液；

(6)移除PST封闭液，加入100μl一抗工作液，37℃孵育60min，所述一抗工作液为伽氏疏螺旋体多克隆抗体用PST封闭液作1：100稀释；

(7)移除一抗工作液，用PBS清洗中肠组织3次，每次5min；

(8)加入100μl二抗工作液，37℃孵育60min，所述二抗工作液为羊抗兔IgG(H+L)-Alexa Fluor 488(美国Jackson ImmunoResearch公司)用PST封闭液做1:200稀释；

(9)移除二抗工作液，用PBS清洗中肠组织3次，每次5min；

(10)封片后置于荧光显微镜下观察，具体如图2所示。图2的A显示，解剖带菌蜱的中肠，然后伽氏疏螺旋体多克隆抗体与蜱中肠温育，再与绿色荧光标记的二抗反应，绿色荧光显示的是螺旋体菌，说明可成功检测到蜱携带菌；B显示，解剖无菌的蜱的中肠，然后抗体与蜱中肠温育，再与绿色荧光标记的二抗反应，无绿色杂交反应，说明制备的抗体具有特异性。

本实施例中，饱血蜱虫通过以下步骤获得：用高剂量莱姆病螺旋体B.garinii NMJW1(1×107cfu/鼠)人工接种3只C3H/HeN小鼠，在10天和21天后取小鼠耳朵组织于含有1×Antibiotic Mmixture for Borrelia的BSK-H培养基中培养，33℃的5％CO2恒温培养箱培养一周左右，于暗视野显微镜下确认小鼠成功感染莱姆螺旋体。之后，每只阳性带菌鼠上放置200只左右无菌幼蜱，使其充分吸血至掉落。

以上描述对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、同等替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。