本发明提供一种十八烷基聚乙烯醚的制备方法，用于从螺旋藻破壁液中双水相萃取藻蓝蛋白。属于海产品加工分离工程技术领域。
背景技术：
螺旋藻藻蓝蛋白存在于螺旋藻的藻胆体中。藻胆体是红藻和蓝藻所特有的一种超分子捕光色素复合体。藻蓝蛋白色泽呈明亮的蓝色，颜色鲜艳，是食品、高级眼影、唇膏的首选纯天然色素。藻蓝蛋白还可以调节和合成人体代谢所需要的多种重要酶，具有明显的抗氧化、抗炎症作用，调节人体免疫系统，增强免疫系统功能。高纯度的藻蓝蛋白带有很强的荧光，制成的纯天然荧光试剂，用于临床医学诊断，免疫化学及生物医学工程等研究领域。
在我国，每年的螺旋藻全国总产量已达到7000吨。螺旋藻产量的三分之一用于直接出口，其它螺旋藻多以藻粉、微藻藻片和灌注胶囊的形式当作保健品使用。螺旋藻的规模化开发和利用处于初级加工阶段，还没有深加工产品。螺旋藻中藻蓝蛋白的提取还处于实验室研究阶段，没有适合于工业化生产的好的工艺方法。目前，市场上销售的高纯度的藻蓝蛋白商品都是从国外进口，价格昂贵，在应用上受到限制。
因此，开发简便、快速的螺旋藻藻蓝蛋白的提取过程，提高螺旋藻藻蓝蛋白产品纯度是目前螺旋藻藻蓝蛋白的规模化开发利用中亟待解决的关键问题。聚合物双水相分离蛋白质具有生物相容性高，操作条件温和，易于进行连续化操作等优点。已报道的有关制备藻类藻蓝蛋白的双水相萃取分离藻蓝蛋白的专利技术，例如中国专利CN103880950A采用价格昂贵的离子液体组成聚合物-水相，增加生产成本，CN102993297A、CN101891809A等采用市售的PEG组成聚合物-水相，分离藻蓝蛋白的选择性差，需要与盐析等其它提取手段联合使用才能得到高纯度产品，过程繁琐。
本发明提供一种对藻蓝蛋白具有特异性萃取能力的十八烷基聚乙烯醚，可通过双水相萃取方式从螺旋藻破壁液中直接分离纯化藻蓝蛋白，无需与盐析等其它提取手段联合使用，就能得到高纯度藻蓝蛋白。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种十八烷基聚乙烯醚的制备方法，用于双水相萃取分离螺旋藻藻蓝蛋白，获得高纯度的藻蓝蛋白，应用于天然色素、保健食品和新药的研究开发。
本发明所要解决的技术问题是提供一种十八烷基聚乙烯醚的制备方法，用于从螺旋藻破壁液中萃取分离藻蓝蛋白。其方法简单，快捷，成本低，分离藻蓝蛋白具有较高的纯度，原料既可采用新鲜螺旋藻也可采用螺旋藻干粉，从而提供了一种解决螺旋藻藻蓝蛋白资源规模化利用的方法。
本发明的技术方案：一种十八烷基聚乙烯醚双水相萃取螺旋藻藻蓝蛋白的分离技术，步骤为：
(1)十八烷基聚乙烯醚的制备；(2)从螺旋藻破壁清液两相萃取藻蓝蛋白；(3)藻蓝蛋白水溶液经浓缩和冷冻干燥后获得藻蓝蛋白粉。
所述的方案，步骤1中，在圆底烧瓶中放入重量百分比为2％～8％的叔丁醇钾苯溶液，在氮气保护下逐滴加入重量百分比为25％～50％的聚乙二醇苯溶液，叔丁醇钾与聚乙二醇的重量比为0.04～0.1:1，在室温下搅拌1～3小时，然后加入重量百分比为15％～30％的十八烷基溴苯溶液，十八烷基溴与聚乙二醇的重量比为0.22～0.5:1，在室温下搅拌反应72～108小时，过滤后将滤液在真空下蒸馏1～3小时获得十八烷基聚乙烯醚。
所述的方案，步骤2中，螺旋藻破壁清液的制备：采用水或磷酸缓冲液作提取剂，磷酸缓冲液的浓度为25～100mmol/L，藻粉或鲜藻与提取液的固液比为1:50～1:150，搅拌均匀后，置于-10℃～-20℃下冷冻一定时间后，37℃溶解，如此反复冻融4-6次，融化后离心获得的破壁清液，破壁清液中蛋白质浓度为1.0～5.6mg/ml，藻蓝蛋白纯度为0.5～0.72。
所述的方案，步骤2中，在螺旋藻破壁清液中加入十八烷基聚乙烯醚和无机盐，十八烷基聚乙烯醚:无机盐:破壁清液的重量比为0.05～0.35:0.25～0.4:1，震荡混合2分钟，静置分相，藻蓝蛋白富集于上相；将含藻蓝蛋白的上相经截留分子量为30000道尔顿的超滤膜过滤，去除十八烷基聚乙烯醚和无机盐，获得藻蓝蛋白水溶液，纯度为2.4～4.2，蛋白浓度为4.15～6.6mg/ml。
所述的方案，步骤3中，将藻蓝蛋白水溶液在60℃下真空浓缩至原体积三分之一，冷冻干燥后得到藻蓝蛋白粉末。
本发明的有益效果：本发明与现有技术相比，主要具有以下优点：1.十八烷基聚乙烯醚对藻蓝蛋白的选择性高，适合不同规模和场地的工业化生产要求；2.十八烷基聚乙烯醚可直接从螺旋藻破壁清液中萃取获得高纯度的藻蓝蛋白，无需其它提取手段配合，生产成本低；3.制备藻蓝蛋白的原料可以是螺旋藻鲜藻或者干藻粉，有效地解决螺旋藻资料的利用和高值化问题。
具体实施方式
实施实例1
(1)螺旋藻破壁清液的制备
取产于江苏东台市赐百年生物工程有限公司的钝顶螺旋藻干粉，用去离子水作提取剂，藻粉与去离子水的固液比为1:55，置于-20℃下冷冻3小时后，37℃融解，如此反复冻融4次，融化后的蓝藻破壁液用离心机在6000转/min下离心10分钟，取上清液为破壁清液，清液中蛋白质浓度为1.2mg/ml，藻蓝蛋白纯度A620/A280为0.75mg/ml。
(2)十八烷基聚乙烯醚的制备
在1000ml的圆底烧瓶中放入100ml重量百分比为2％的叔丁醇钾(购自常州市启迪化工有限公司)苯(购自上海泰正化工有限公司)溶液，在氮气(购自无锡市圣马气体有限公司)保护下逐滴加入重量百分比为25％的聚乙二醇PEG-1000(购自海安石油化工厂)苯溶液，PEG-1000的平均分子量为1000，PEG-1000的用量为50g，在室温下搅拌1小时，然后加入重量百分比为15％的十八烷基溴苯溶液，十八烷基溴的用量为11g，在室温下搅拌反应72小时，过滤后将滤液在真空下蒸馏1小时获得十八烷基聚乙烯醚。
(3)两相萃取
在10g螺旋藻破壁清液中加入1.2g十八烷基聚乙烯醚和2.5g无水硫酸钠(购自南京大唐化工有限责任公司)，震荡混合2分钟，静置分相，藻蓝蛋白富集于上相，上相经截留分子量为30000道尔顿的超滤膜(颇尔过滤器有限公司)过滤，去除十八烷基聚乙烯醚和硫酸钠，获得藻蓝蛋白水溶液，纯度为2.5，蛋白浓度为4.15mg/ml。
(4)冷冻干燥获得藻蓝蛋白粉
将前述步骤(3)中获得的藻蓝蛋白水溶液在60℃下真空浓缩至原体积三分之一，冷冻干燥后得到藻蓝蛋白粉产品。产品中藻蓝蛋白纯度A620/A280为2.5，蛋白回收率为80％。
实施例2
(1)螺旋藻破壁液的制备
取产于江苏大丰赐百年生物科技有限公司的新鲜螺旋藻，用100mmol/L磷酸缓冲液作提取剂，螺旋藻与去离子水的固液比为1:80，置于-10℃下冷冻4小时后，37℃融解，如此反复冻融5次。融化后的蓝藻破壁液用离心机在6000转/min下离心10分钟，取上清液为破壁清液，清液中蛋白质浓度为3.1mg/ml，藻蓝蛋白纯度A620/A280为0.55。
(2)十八烷基聚乙烯醚的制备
在1500ml的圆底烧瓶中放入100ml重量百分比为4％的叔丁醇钾(购自常州市启迪化工有限公司)苯(购自上海泰正化工有限公司)溶液，在氮气(购自无锡市圣马气体有限公司)保护下逐滴加入重量百分比为40％的聚乙二醇PEG-3000(购自海安石油化工厂)苯溶液，PEG-3000的平均分子量为3000，PEG-3000的用量为40g，在室温下搅拌2小时，然后加入重量百分比为25％的十八烷基溴苯溶液，十八烷基溴的用量为14g，在室温下搅拌反应96小时，过滤后将滤液在真空下蒸馏2小时获得十八烷基聚乙烯醚。
(3)两相萃取
在10g螺旋藻破壁清液中加入2g十八烷基聚乙烯醚和2.5g无水硫酸镁(购自南京大唐化工有限责任公司)，震荡混合2分钟，静置分相，藻蓝蛋白富集于上相，将上相经截留分子量为30000道尔顿的超滤膜(颇尔过滤器有限公司)过滤，去除十八烷基聚乙烯醚和硫酸镁，获得藻蓝蛋白水溶液，纯度为4.1，蛋白浓度为5.8mg/ml。
(5)冷冻干燥获得藻蓝蛋白粉
将前述步骤(3)中获得的藻蓝蛋白水溶液在60℃下真空浓缩至原体积三分之一，冷冻干燥后得到藻蓝蛋白粉产品。产品中藻蓝蛋白纯度A620/A280为4.2，蛋白回收率75％。
实施例3
(1)螺旋藻破壁液的制备
取产于云南丽江程海源螺旋藻基地的螺旋藻粉，用50mmol/L磷酸缓冲液作提取剂，螺旋藻与去离子水的固液比为1:100，置于-20℃下冷冻5小时后，37℃融解，如此反复冻融5次。融化后的蓝藻破壁液用离心机在6000转/min下离心10分钟，取上清液为破壁清液，清液中的藻蓝蛋白纯度A620/A280为0.72，破壁液蛋白质浓度为4.6mg/ml mg/ml。
(2)十八烷基聚乙烯醚的制备
在1000ml的圆底烧瓶中放入100ml重量百分比为8％的叔丁醇钾(购自常州市启迪化工有限公司)苯(购自上海泰正化工有限公司)溶液，在氮气(购自无锡市圣马气体有限公司)保护下逐滴加入重量百分比为50％的聚乙二醇PEG-4000(购自海安石油化工厂)苯溶液，PEG-4000的平均分子量为4000，PEG-4000的用量为80g，在室温下搅拌3小时，然后加入重量百分比为30％的十八烷基溴苯溶液，十八烷基溴的用量为40g，在室温下搅拌反应108小时，过滤后将滤液在真空下蒸馏3小时获得十八烷基聚乙烯醚。
(3)双水相萃取
在10g螺旋藻破壁清液中加入3.5g十八烷基聚乙烯醚和4g无水硫酸铵(购自南京大唐化工有限责任公司)，震荡混合2分钟，静置分相，藻蓝蛋白富集于上相，将上相经截留分子量为30000道尔顿的超滤膜(颇尔过滤器有限公司)过滤，去除十八烷基聚乙烯醚和硫酸铵，获得藻蓝蛋白水溶液，纯度为3.5，蛋白浓度为6.6mg/ml。
(4)冷冻干燥获得藻蓝蛋白粉
将前述步骤(3)中获得的藻蓝蛋白水溶液在60℃下真空浓缩至原体积三分之一，冷冻干燥后得到藻蓝蛋白粉产品。产品中藻蓝蛋白纯度A620/A280为3.5，蛋白回收率85％。