一种新型非洲爪蟾胰高血糖素样肽‑1（GLP‑1）缀合肽及其应用的制作方法

本发明涉及一种新型非洲爪蟾胰高血糖素样肽-1(GLP-1)缀合肽及其应用。

背景技术：

糖尿病(Diabetes Mellitus)是一种与遗传因素有关，又与多种环境因素相关的慢性全身性疾病，是由于体内胰岛素分泌的绝对或相对不足而引起的糖、脂肪、蛋白质的代谢紊乱，可分为胰岛素依赖型糖尿病(1型)和非胰岛素依赖型糖尿病(2型)，其中2型患者占糖尿病病例的80％以上。糖尿病是一种全球性的高发病，据世界卫生组织预测，到2025年全世界糖尿病患者将达到3亿。中国近期一项流行病学调查报告表明，中国糖尿病患病率高达9.7％，远高于全球平均患病率6.4％，按此患病率估算，我国糖尿病患病人数已超过9000万，并且还有约1.5亿潜在的糖尿病危险人群。目前对于1型糖尿病的治疗，研究方向是开发给药方便、有效的胰岛素制剂及代用品。而对于2型糖尿病的治疗，临床治疗手段主要是使用口服降糖药物，传统的磺酰脲类和双胍类口服降糖药疗效有限，口服糖尿病药物在治疗2型糖尿病症中最大的不足是无法逆转糖尿病的病因，即“治标不知本”，对于胰岛β细胞的生长、分化、增殖无明显作用。

胰高血糖素样肽-1(glucagon like peptide-1,GLP-1)是小肠L细胞分泌的一种多肽类肠促胰岛素。自1987年Mojsov发现GLP-1具有强的促胰岛素释放作用以来，有关的生物学和化学研究不断深入。GLP-1可通过多种机制控制2型糖尿病患者的血糖，当血糖浓度升高时，通过与GLP-1受体高度特异性地结合，刺激胰岛素分泌，抑制胰高血糖素的产生，使餐后血糖降低并维持在恒定水平。在生理条件下，GLP-1刺激胰岛素分泌的作用依赖于血糖浓度，不会因持续分泌而发生低血糖。除了调节血糖，GLP-1最显著的功能是促进β细胞的再生和修复，增加胰岛β细胞数量。此外GLP-1还具有调节神经功能、延迟胃排空和降低食欲等作用。然而内源性或外源性的GLP-1在体内会迅速被二肽基肽酶IV(DPP-IV)和中性内切酶(NEP 24.11)降解而失去生物活性，其体内半衰期只有两分钟左右，故天然GLP-1难以获得临床使用。

虽然GLP-1在2型糖尿病治疗中的显著效果已被人们所公认，但是其体内过短的半衰期限制了其直接成药的可能。DPP-IV是使天然GLP-1失活的主要蛋白酶，其作用位点是Ala⁸-Glu⁹之间的肽键。天然GLP-1的另一个主要代谢酶是NEP 24.11，约50％的GLP-1在体内会被NEP24.11降解，GLP-1肽链上有多个NEP 24.11的酶切位点，主要是Thr¹¹-Phe¹²、Asp¹⁵-Val¹⁶、Ser¹⁸-Tyr¹⁹、Glu²⁷-Phe²⁸和Trp³¹-Leu³²位点。因此，仅置换个别氨基酸无法抗NEP 24.11降解，而多个氨基酸置换可能会使化合物的降糖活性下降。目前大部分长效GLP-1受体激动剂的研究都是针对GLP-1的结构进行修饰，这限制了新型GLP-1受体激动剂的研发。同时，由于天然GLP-1上存在较多NEP 24.11酶切位点，很难通过氨基酸修饰的手段抵抗NEP 24.11的降解。

哺乳动物体内的GLP-1作用效果与人GLP-1类似，所以针对哺乳动物GLP-1进行结构修饰，有望发现新型GLP-1类似物。目前延长多肽、蛋白药物半衰期的方法主要基于三种原理:1、增大蛋白药物的分子量，减少肾小球滤过率；2、利用游离型药物和结合型药物在血浆内形成平衡的特点，缓慢释放游离型蛋白药物，使结合型药物和游离型药物的平衡向游离型药物方向移动；3、减少异源蛋白的免疫原性，从而减少其体内清除率。

根据以上提示，我们推测如果能够在肽链上引入大分子基团，增加多肽分子量的同时降低多肽的免疫源性，可以显著的延长多肽的半衰期。所以，我们首先在非洲爪蟾GLP-1的C端引入促螺旋序列，已增加其降糖活性，进一步设计大分子PEG化合物，通过马来酰亚胺与半胱氨酸改构的非洲爪蟾GLP-1类似物相连接，从而延长类似物的体内生物活性作用时间和增加其降糖、减肥活性。

技术实现要素：

本发明涉及一类非洲爪蟾胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物。其特征在于其结构为以下形式：

His-Xaa1-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser

(SEQ.ID NO:1)

其中：

Xaa1:Ala，Leu，Val，Met，Ile，Tyr，Phe，Arg，Asn，Lys，Thr，Asp，His，Trp，Gln，Glu，Ser或Gly；

Xaa2:Cys(S-PEG anolog)，或Thr；

Xaa3:Cys(S-PEG anolog)，或Glu；

Xaa4:Cys(S-PEG anolog)，或Tyr；

Xaa5:Cys(S-PEG anolog)，或Leu；

Xaa6:Cys(S-PEG anolog)，或Glu；

Xaa7:Cys(S-PEG anolog)，或Glu；

Xaa8:Cys(S-PEG anolog)，或Lys；

Xaa9:Cys(S-PEG anolog)，或Ala；

Xaa10:Cys(S-PEG anolog)，或Ala；

Xaa11:Cys(S-PEG anolog)，或Lys；

Xaa12:Cys(S-PEG anolog)，或Glu；

Xaa13:Cys(S-PEG anolog)，或Phe；

Xaa14:Cys(S-PEG anolog)，或Ile；

Xaa15:Cys(S-PEG anolog)，或Glu；

Xaa16:Cys(S-PEG anolog)，或Trp；

Xaa17:Cys(S-PEG anolog)，或Leu；

Xaa18:Cys(S-PEG anolog)，或Ile；

Xaa19:Cys(S-PEG anolog)，或Lys；

Xaa20:Cys(S-PEG anolog)，或Gly；

Xaa21:Cys(S-PEG anolog)，或Lys；

前提是所述序列不是His-Xaa1-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Glu-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Lys-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH₂

其中Cys(S-PEG anolog)选自

这里，n选自30～80。

优选，S-PEG anolog的分子量为～2000。

在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的非洲爪蟾GLP-1类似物：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Cys(S-PEG anolog)-Glu-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Lys-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH₂

(SEQ.ID NO:2)

在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的非洲爪蟾GLP-1类似物：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Cys(S-PEG anolog)-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Lys-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH₂

(SEQ.ID NO:3)

在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的非洲爪蟾GLP-1类似物：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Glu-Cys(S-PEG anolog)-Leu-Glu-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Lys-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH₂

(SEQ.ID NO:4)

在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的非洲爪蟾GLP-1类似物：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Glu-Tyr-Cys(S-PEG anolog)-Glu-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Lys-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH₂

(SEQ.ID NO:5)

在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的非洲爪蟾GLP-1类似物：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Glu-Tyr-Leu-Glu-Glu-Cys(S-PEG anolog)-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Lys-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH₂

(SEQ.ID NO:6)

在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的非洲爪蟾GLP-1类似物：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Glu-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys-Cys(S-PEG anolog)-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Lys-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH₂

(SEQ.ID NO:7)

在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的非洲爪蟾GLP-1类似物：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Glu-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys-Ala-Cys(S-PEG anolog)-Lys-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Lys-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH₂

(SEQ.ID NO:8)

在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的非洲爪蟾GLP-1类似物：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Glu-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Cys(S-PEG anolog)-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Lys-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH₂

(SEQ.ID NO:9)

在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的非洲爪蟾GLP-1类似物：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Glu-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Cys(S-PEG anolog)-Ile-Lys-Gly-Lys-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH₂

(SEQ.ID NO:10)

在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的非洲爪蟾GLP-1类似物：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Glu-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Cys(S-PEG anolog)-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH₂

(SEQ.ID NO:11)

本发明还提供了一种药物组合物，包括治疗有效量至少一种上述化合物或者其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体或稀释剂。

本发明进一步提供了上述化合物或者其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体或稀释剂在制备用于糖尿病和肥胖的药物中的运用。

本发明还提供了上述化合物的制备方法，包括生物表达、液相合成和固相合成制备方法。

一种非洲爪蟾胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物的合成方法，其特征是将mPEG2000-MAL用甲醇/水(v/v＝1:1，pH 7.0)溶解，加入等摩尔的半胱氨酸改构的非洲爪蟾胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，室温下搅拌反应，反应结束后，反应液直接进制备液相色谱纯化，冻干得纯品。

本发明提供的上述化合物化学性质稳定，不易被体内的二肽基肽酶Ⅳ(DPP-Ⅳ)和中性内切酶降解，化合物的免疫原性降低，并且不易被肾小球滤过，所有的化合物的体内降糖作用时间显著延长，克服了天然GLP-1必须持续静脉滴注或持续皮下注射才能产生疗效的缺陷。另外，本发明提供的上述化合物或化合物作为有效成分制备的药物组合物用于降低血糖和减肥治疗时，既有显著的长效降糖效果，还有明显的减肥作用。

本发明的优点在于：

1、提出的一种PEG-非洲爪蟾胰高血糖素样肽-1(GLP-1)缀合肽，是一类具有全新结构的GLP-1类似物，其生物半衰期较天然GLP-1显著延长，其降糖活性也明显优于天然GLP-1，此外，其还具有很好的减肥效果，可用于糖尿病和肥胖的治疗。

2、本发明所涉及的非洲爪蟾GLP-1类似物合成过程简单，成本低，多肽粗品纯度大于80％，较常规固相合成方法大大提高，并且易于实现自动化、大规模化，这使其更适合工业化生产。

因此本发明提供的非洲爪蟾GLP-1类似物，合成周期短、收率高、粗品纯化容易，生产成本低、易于工业自动化生产。制备得到的非洲爪蟾GLP-1类似物，比天然GLP-1更加稳定，降血糖作用时间和降糖活性都优于天然GLP-1，并且还具有很好的减肥效果，适合作为治疗糖尿病和减肥药物的活性成分。

附图说明

上文对本发明做了一般性描述，下面附图用于说明本发明的具体实施方案。其中：

图1显示的是Exenatide与非洲爪蟾GLP-1类似物在大鼠血浆中的温敷降解图；

图2显示的是Exenatide与非洲爪蟾GLP-1类似物在db/db模型小鼠体内的腹腔糖耐量实验血糖图；

图3显示的是Exenatide与非洲爪蟾GLP-1类似物在db/db模型小鼠体内的不禁食降糖实验血糖图；

图4显示的是Exenatide与非洲爪蟾GLP-1类似物在降低体重实验中小鼠的体重增加量；

具体实施方式

在本说明书全文中采用以下缩写：

DMF：二甲基甲酰胺；DCM：二氯甲烷；Fmoc：N-9-芴甲氧羰基；DIC：N,N’-二异丙基碳二亚胺；HOBT：1-羟基-苯并三氮唑；TFA：三氟乙酸；EDT：二巯基乙烷；HPLC：高效液相色谱；ESI-MS：电喷雾质谱；LC-MS：液质联用质谱；Gly：甘氨酸；Ser：丝氨酸；Ala：丙氨酸；Thr：苏氨酸；Val：缬氨酸；Ile：异亮氨酸；Leu：亮氨酸；Tyr：酪氨酸；Phe：苯丙氨酸；His：组氨酸；Pro：脯氨酸；Asp：天门冬氨酸；Met：蛋氨酸；Glu：谷氨酸；Trp：色氨酸；Lys：赖氨酸；Arg：精氨酸；Asn：天冬酰胺；Gln：谷氨酰胺；Cys：半胱氨酸。

本发明是通过下列实施例来进行说明的，但这些实施例不做任何限制本发明的解释。

实施例1

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Cys(S-PEG anolog)-Glu-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Lys-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH₂

(SEQ.ID NO:2)的固相合成(0.1mmol)

(1)树脂的溶胀

称取Fmoc-Rink amide-MBHA Resin 0.262g(取代量0.382mmol/g)，经7mL DCM溶胀2min，抽滤去DCM，再用10mL DCM溶胀30min，最后分别用DCM，DMF 7mL冲洗干净。

(3)Fmoc保护基的脱除

将溶胀好的树脂放入反应器中，加入7mL 20％哌啶/DMF(V/V)溶液，在反应器中180度往返振摇反应5min，反应温度25℃，反应结束后滤去溶液；再加入7mL20％哌啶/DMF(V/V)溶液在反应器中180度往返振摇反应15min，反应温度25℃。反应结束后滤去溶液，用DMF洗涤干净。得到脱去初始连接的Fmoc保护基的树脂。

(4)Ser-Rink amide-MBHAResin的合成

将Ser(0.4mmol)，DIC(0.4mmol)，HOBT(0.4mmol)溶于5mLDMF中，再将此溶液加入上面的树脂中，在反应器中180度往返振摇反应90min，反应温度25℃。反应结束后滤除反应液，用7mLDMF洗涤树脂3次。

(5)偶合效率的检测

用茚三酮法检测树脂的偶合效率，显色反应为阴性即可进入下一个偶合循环。

茚三酮法：取少量树脂颗粒用乙醇洗涤，放入透明小瓶中加入5％茚三酮乙醇、KCN吡啶溶液(2ml 0.001M KCN稀释于98ml吡啶中)、80％苯酚乙醇溶液各2滴，于100℃加热5分钟，如果树脂显蓝色即为阳性。

(6)肽链的延长

按照肽链的序列，重复上述脱保护和偶合的步骤依次连接上相应的氨基酸直至肽链合成完毕，得到连有化合物的树脂。

(7)树脂上多肽的裂解

将上述得到的连有化合物的树脂放入反应瓶中，各加入裂解剂Reagent K(TFA/苯甲硫醚/水/苯酚/EDT，82.5:5:5:5:2.5，V/V)5mL，再在常温下搅拌反应2h。反应结束后抽滤，加少量TFA洗涤三次，合并滤液，滤液减压浓缩。将浓缩滤液加入大量的冰乙醚中析出白色絮状沉淀，冷冻离心得到目标多肽的粗品，最终收率为92.2％。

(8)Gly₈-Cys₁₇(S-PEG analog)-xGLP(7～36)-Ex-NH₂

将mPEG₂₀₀₀-MAL用甲醇/水(v/v＝1:1，pH 7.0)溶解，加入等摩尔的(7)步得到的半胱氨酸改构的非洲爪蟾胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，室温下搅拌反应，反应结束后，反应液直接进制备液相色谱纯化，色谱条件为：C18反相柱(320mm×28mm，5μm)；流动相A：0.1％TFA/水(V/V)，流动相B：甲醇(V/V)；流动相梯度：流动相B 40％～90％，20min；流速为8mL/min检测波长为214nm，收集的溶液冻干得纯品。由于PEG是混合物，分子量为226.1+44n，这里n＝40，化合物的平均理论相对分子质量为6265.9。ESI-MS m/z:calu[M+5H]⁵⁺1254.2，[M+6H]⁶⁺1045.3；found[M+5H]⁵⁺1254.1，[M+6H]⁶⁺1045.6。

实施例2～10

根据实施例1所述的方法，根据相应的序列合成得到实施例2～10的非洲爪蟾胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，通过ESI-MS确证各自的分子量。

实施例2

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Cys(S-PEG anolog)-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Lys-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH₂

(SEQ.ID NO:3)

平均理论相对分子质量为6237.9。ESI-MS m/z:calu[M+5H]⁵⁺1248.6，[M+6H]⁶⁺1040.6；found[M+5H]⁵⁺1248.8，[M+6H]⁶⁺1040.7。

实施例3

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Glu-Cys(S-PEG anolog)-Leu-Glu-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Lys-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH₂

(SEQ.ID NO:4)

平均理论相对分子质量为6203.9。ESI-MS m/z:calu[M+5H]⁵⁺1241.8，[M+6H]⁶⁺1034.9；found[M+5H]⁵⁺1242.0，[M+6H]⁶⁺1035.2。

实施例4

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Glu-Tyr-Cys(S-PEG anolog)-Glu-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Lys-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH₂

(SEQ.ID NO:5)

平均理论相对分子质量为6253.8。ESI-MS m/z:calu[M+5H]⁵⁺1251.7，[M+6H]⁶⁺1043.3；found[M+5H]⁵⁺1250.9，[M+6H]⁶⁺1043.5。

实施例5

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Glu-Tyr-Leu-Glu-Glu-Cys(S-PEG anolog)-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Lys-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH₂

(SEQ.ID NO:6)

平均理论相对分子质量为6238.8。ESI-MS m/z:calu[M+5H]⁵⁺1248.8，[M+6H]⁶⁺1040.8；found[M+5H]⁵⁺1248.5，[M+6H]⁶⁺1040.2。

实施例6

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Glu-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys-Cys(S-PEG anolog)-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Lys-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH₂

(SEQ.ID NO:7)

平均理论相对分子质量为6295.9。ESI-MS m/z:calu[M+5H]⁵⁺1260.2，[M+6H]⁶⁺1050.3；found[M+5H]⁵⁺1261.1，[M+6H]⁶⁺1050.9。

实施例7

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Glu-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys-Ala-Cys(S-PEG anolog)-Lys-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Lys-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH₂

(SEQ.ID NO:8)

平均理论相对分子质量为6295.9。ESI-MS m/z:calu[M+5H]⁵⁺1260.2，[M+6H]⁶⁺1050.3；found[M+5H]⁵⁺1260.8，[M+6H]⁶⁺1050.5。

实施例8

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Glu-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Cys(S-PEG anolog)-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Lys-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH₂

(SEQ.ID NO:9)

平均理论相对分子质量为6253.8。ESI-MS m/z:calu[M+5H]⁵⁺1251.7，[M+6H]⁶⁺1043.3；found[M+5H]⁵⁺1251.5，[M+6H]⁶⁺1043.2。

实施例9

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Glu-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Cys(S-PEG anolog)-Ile-Lys-Gly-Lys-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH₂

(SEQ.ID NO:10)

平均理论相对分子质量为6253.8。ESI-MS m/z:calu[M+5H]⁵⁺1251.7，[M+6H]⁶⁺1043.3；found[M+5H]⁵⁺1252.6，[M+6H]⁶⁺1043.9。

实施例10

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Asn-Asp-Val-Thr-Glu-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ile-Lys-Gly-Cys(S-PEG anolog)-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH₂

(SEQ.ID NO:11)

平均理论相对分子质量为6238.8。ESI-MS m/z:calu[M+5H]⁵⁺1248.8，[M+6H]⁶⁺1040.8；found[M+5H]⁵⁺1248.9，[M+6H]⁶⁺1040.6。

实施例11

非洲爪蟾GLP-1类似物对大鼠血浆的稳定性实验

大鼠眼球取血，血液装入含有肝素的离心管中，3000rpm离心10分钟，取上清血浆作为温孵血浆，利用LC-MS来检测化合物的响应信号。100ul的Exenatide(对照)和非洲爪蟾GLP-1类似物与100ul的血浆，涡旋混合后置入37℃水浴中，温孵24小时，在0，1，2，4，8，12，24，36，48，72h时间点取10ul，加入20ul乙腈沉淀，14000rpm离心，取上清液进LC-MS，计算各个时间点的峰面积，做出衰减曲线。如图1所示，Exenatide的血浆半衰期为4h左右，而非洲爪蟾GLP-1类似物的血浆半衰期都在36小时以上。

实施例12

非洲爪蟾GLP-1类似物的腹腔糖耐量实验

6周龄db/db糖尿病模型小鼠，适应性饲养一周，随机分组，每组六只。小鼠在禁食18h，提前30min腹腔给予阳性对照Exenatide(25nmol/kg)，阴性对照生理盐水和非洲爪蟾GLP-1类似物(25nmol/kg)，0min腹腔给予葡萄糖(1g/kg)，在0，15，30，60，120min用血糖仪监测血糖水平。如图2所示，非洲爪蟾GLP-1类似物的降糖活性与Exenatide相当，说明PEG化并没有影响非洲爪蟾GLP-1类似物的血糖控制能力。

实施例13

非洲爪蟾GLP-1类似物的不禁食降糖实验

七周龄db/db糖尿病模型小鼠，适应性饲养一周，血糖仪测定小鼠的血糖值高于20mmol/L后，随机分组，每组六只。分为阳性对照组Exenatide(25nmol/kg)，阴性对照组生理盐水，化合物组SEQ.ID NO:5，SEQ.ID NO:6，SEQ.ID NO:10(25nmol/kg)。小鼠自由饮水、饮食，0h给予化合物，在0，1，2，3，4，6，8，10，12，16，20，24，36，48h用血糖仪测定血糖，做出时间-血糖曲线，检测各组小鼠血糖恢复到8.35mmol/L的时间。如图3所示，化合物组的血糖稳定时间都显著优于阳性对照Exenatide，它们血糖稳定时间都超过24h。

实施例14

非洲爪蟾GLP-1类似物的降低体重实验

6周龄db/db糖尿病模型小鼠，适应性饲养一周，随机分组，每组6只。小鼠每天2次给予阳性对照Exenatide(25nmol/kg)，阴性对照生理盐水，给药组1天1次给予SEQ.ID NO:5，SEQ.ID NO:6(25nmol/kg)，治疗周期20天，每两天检测一次小鼠的体重。如图4所示，化合物能SEQ.ID NO:5、SEQ.ID NO:6够显著抑制小鼠的体重增长，并且其体重减轻作用优于阳性对照Exenatide，表明了非洲爪蟾GLP-1类似物具有良好的治疗糖尿病和减肥的药用前景。

<110> 江苏师范大学

<120> 一种新型非洲爪蟾胰高血糖素样肽-1（GLP-1）缀合肽及其应用

<160> 10

<210> 1

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 合成构建体

<222> (2)..(2)

<223> 第2位的Xaa是Ala，Leu，Val，Met，Ile，Tyr，Phe，Arg，Asn，Lys，Thr，Asp，His，Trp，Gln，Glu，Ser或Gly

<220>

<221> 合成构建体

<222> (11)..(11)

<223> 第11位的Xaa是Cys (S-PEG anolog)或Thr

<220>

<221> 合成构建体

<222> (12)..(12)

<223> 第12位的Xaa是Cys (S-PEG anolog)或Glu

<220>

<221> 合成构建体

<222> (13)..(13)

<223> 第13位的Xaa是Cys (S-PEG anolog)或Tyr

<220>

<221> 合成构建体

<222> (14)..(14)

<223> 第14位的Xaa是Cys (S-PEG anolog)或Leu

<220>

<221> 合成构建体

<222> (15)..(15)

<223> 第15位的Xaa是Cys (S-PEG anolog)或Glu

<220>

<221> 合成构建体

<222> (16)..(16)

<223> 第16位的Xaa是Cys (S-PEG anolog)或Glu

<220>

<221> 合成构建体

<222> (17)..(17)

<223> 第17位的Xaa是Cys (S-PEG anolog)或Lys

<220>

<221> 合成构建体

<222> (18)..(18)

<223> 第18位的Xaa是Cys (S-PEG anolog)或Ala

<220>

<221> 合成构建体

<222> (19)..(19)

<223> 第19位的Xaa是Cys (S-PEG anolog)或Ala

<220>

<221> 合成构建体

<222> (20)..(20)

<223> 第20位的Xaa是Cys (S-PEG anolog)或Lys

<220>

<221> 合成构建体

<222> (21)..(21)

<223> 第21位的Xaa是Cys (S-PEG anolog)或Glu

<220>

<221> 合成构建体

<222> (22)..(22)

<223> 第22位的Xaa是Cys (S-PEG anolog)或Phe

<220>

<221> 合成构建体

<222> (23)..(23)

<223> 第23位的Xaa是Cys (S-PEG anolog)或Ile

<220>

<221> 合成构建体

<222> (24)..(24)

<223> 第24位的Xaa是Cys (S-PEG anolog)或Glu

<220>

<221> 合成构建体

<222> (25)..(25)

<223> 第25位的Xaa是Cys (S-PEG anolog)或Trp

<220>

<221> 合成构建体

<222> (26)..(26)

<223> 第26位的Xaa是Cys (S-PEG anolog)或Leu

<220>

<221> 合成构建体

<222> (27)..(27)

<223> 第27位的Xaa是Cys (S-PEG anolog)或Ile

<220>

<221> 合成构建体

<222> (28)..(28)

<223> 第28位的Xaa是Cys (S-PEG anolog)或Lys

<220>

<221> 合成构建体

<222> (29)..(29)

<223> 第29位的Xaa是Cys (S-PEG anolog)或Gly

<220>

<221> 合成构建体

<222> (30)..(30)

<223> 第30位的Xaa是Cys (S-PEG anolog)或Lys

<400> 1

His Xaa Glu Gly Thr Tyr Thr Asn Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

20 25 30 35

<210> 2

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 合成构建体

His Gly Glu Gly Thr Tyr Thr Asn Asp Val Cys (S-PEG anolog) Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Ala Ala

1 5 10 15

Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Ile Lys Gly Lys Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

20 25 30 35

<210> 3

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 合成构建体

His Gly Glu Gly Thr Tyr Thr Asn Asp Val Thr Cys (S-PEG anolog) Tyr Leu Glu Glu Lys Ala Ala

1 5 10 15

Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Ile Lys Gly Lys Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

20 25 30 35

<210> 4

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 合成构建体

His Gly Glu Gly Thr Tyr Thr Asn Asp Val Thr Glu Cys (S-PEG anolog) Leu Glu Glu Lys Ala Ala

1 5 10 15

Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Ile Lys Gly Lys Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

20 25 30 35

<210> 5

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 合成构建体

His Gly Glu Gly Thr Tyr Thr Asn Asp Val Thr Glu Tyr Cys (S-PEG anolog) Glu Glu Lys Ala Ala

1 5 10 15

Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Ile Lys Gly Lys Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

20 25 30 35

<210> 6

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 合成构建体

His Gly Glu Gly Thr Tyr Thr Asn Asp Val Thr Glu Tyr Ley Glu Glu Cys (S-PEG anolog) Ala Ala

1 5 10 15

Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Ile Lys Gly Lys Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

20 25 30 35

<210> 7

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 合成构建体

His Gly Glu Gly Thr Tyr Thr Asn Asp Val Thr Glu Tyr Ley Glu Glu Lys Cys (S-PEG anolog) Ala

1 5 10 15

Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Ile Lys Gly Lys Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

20 25 30 35

<210> 8

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 合成构建体

His Gly Glu Gly Thr Tyr Thr Asn Asp Val Thr Glu Tyr Ley Glu Glu Lys Ala Ala

1 5 10 15

Lys Glu Phe Cys (S-PEG anolog) Glu Trp Leu Ile Lys Gly Lys Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

20 25 30 35

<210> 9

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 合成构建体

His Gly Glu Gly Thr Tyr Thr Asn Asp Val Thr Glu Tyr Ley Glu Glu Lys Ala Ala

1 5 10 15

Lys Glu Phe Cys (S-PEG anolog) Glu Trp Leu Ile Lys Gly Lys Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

20 25 30 35

<210> 10

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 合成构建体

His Gly Glu Gly Thr Tyr Thr Asn Asp Val Thr Glu Tyr Ley Glu Glu Lys Ala Ala

1 5 10 15

Lys Glu Phe Ile Glu Trp Cys (S-PEG anolog) Ile Lys Gly Lys Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

20 25 30 35

<210> 11

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 合成构建体

His Gly Glu Gly Thr Tyr Thr Asn Asp Val Thr Glu Tyr Ley Glu Glu Lys Ala Ala

1 5 10 15

Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Ile Lys Gly Cys (S-PEG anolog) Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

20 25 30 35