一种五肽胃泌素合成方法与流程

本发明涉及多肽合成技术领域，尤其涉及一种五肽胃泌素合成方法。

背景技术：

五肽胃泌素为白色或类白色粉末。本品能促进胃酸、胃蛋白酶及内因子的分泌，其促胃酸分泌作用相当于内源性胃泌素的1/4，作用可持续10～40分钟。临床上主要用于胃酸分泌机能的检查。

目前，五肽胃泌素合成方法较为复杂，合成难度高，成本高，收率低，并且成品的杂质含量多，纯度不高

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种五肽胃泌素合成方法。本发明方法的合成工艺简单，减少了合成难度，减少杂质(纯度在98％以上)，降低成本，提高了收率。

本发明的具体技术方案为：一种五肽胃泌素合成方法，包括以下步骤：

1)制备树脂(1)：

将树脂2-Chlorotrityl Chloride Resin在有机溶液DCM或DMF中浸泡，使树脂2-Chlorotrityl Chloride Resin充分溶胀；用有机溶液DMF或DCM溶解片段Fmoc-Asp-Phe-NH₂、DIPEA后，与树脂2-Chlorotrityl Chloride Resin混合震荡，常温下过夜反应，抽掉溶液，用DMF，DCM，无水甲醇各洗三遍；然后加入过量无水甲醇震荡或搅拌1-4h封闭树脂，抽干，得到树脂(1)：

2)固相法合成五肽胃泌素肽树脂：

以步骤1)所得的树脂(1)为载体通过固相合成法，依次偶联Fmoc-Met-OH，Fmoc-Trp-OH，Boc-β-Ala-OH；得到五肽胃泌素肽树脂；具体方法如下：

2.1)树脂预处理：将树脂(1)用DMF或DCM浸泡充分溶胀，抽掉后用DMF洗净；

2.2)加入脱帽试剂：

向树脂(1)中加入其2-3倍体积量的脱帽试剂反应4-6min，然后抽滤，用DMF洗涤，抽滤，再添加树脂(1)2-3倍体积量的脱帽试剂反应8-12min，去除Fmoc保护基团；然后洗涤6遍，洗涤剂依次为：DMF、无水甲醇、DMF、DCM+DMF、DMF、DMF或用DMF洗6遍，抽掉；以DMF为溶剂加入1.2-3倍摩尔量的Fmoc-Met-OH，和偶联剂，1.2-6倍摩尔量的有机碱，偶联1-3小时，用茚三酮检测反应进程，偶联结束后抽掉反应液，用DMF洗净；重复2.2)中上述步骤直至完成最后一个氨基酸Boc-β-Ala-OH；用DMF洗三遍，DCM洗三遍，无水甲醇洗三遍；完成洗涤和树脂收缩，干燥得到五肽胃泌素肽树脂；

3)切割：

以DCM为溶剂，配制体积比为2％的TFA切割试剂，进行冷冻；取出后向切割试剂中加入步骤2)所得的五肽胃泌素肽树脂，在-10至10℃下震荡18-22min；然后升温至23-27℃震荡1.5-2.5h；抽滤，收集滤液；滤液加入有机碱，调解pH至中性，旋蒸去掉溶液，用石油醚或乙醚洗涤3-6遍，干燥得到五肽胃泌素粗品；

通过HPLC检测粗品纯度，经纯化、转盐、冻干后得五肽胃泌素精品。

五肽胃泌素的序列为：N-t-Boc-β-Ala-Trp-Met-Asp-Phe-NH₂。本发明方法概述：在片段Fmoc-Asp-Phe-NH₂的(ASP)的侧链羧基上链接树脂：2-Chlorotrityl Chloride Resin。得到：

再采用固相合成的方法依次偶联Fmoc-Met-OH，Fmoc-Trp-OH，Boc-β-Ala-OH得到五肽胃泌素肽树脂，再通过温和的切割方式(2％TFA/DCM)裂解树脂，洗涤，干燥得到五肽胃泌素粗品。纯化，冻干，得到精品。简化了工艺，减少了合成难度，减少杂质(纯度在98％以上)，降低成本，提高了收率。

因片段Fmoc-Asp-Phe-NH₂在市场上较少，而Fmoc-Asp(otbu)-OH和H-Phe-NH₂市场上很常见，可采用已知方法自行制备Fmoc-Asp-Phe-NH₂或采用以下液相方法制得：

以Fmoc-Asp(otbu)-OH和H-Phe-NH2为原料，加入HOBT，DCC或DIC溶于有机溶剂THF或DCM或DMF中，25-35℃下反应2-8小时，反应结束后处理得到片段Fmoc-Asp(otbu)-Phe-NH₂；用TFA酸解2-6小时后处理得到Fmoc-Asp-Phe-NH₂。

作为优选，步骤2.2)中所述脱帽试剂为体积比为20％的DBLK溶液。

作为优选，步骤2.2)中所述偶联剂选自TBTU、HBTU、HATU、PYBOP、HOBT、DIC。

作为优选，所述有机碱为DIPEA或NMM。

作为优选，步骤2.2)中，用无水甲醇洗三遍时，无水甲醇每次洗涤时间为5-10min。

与现有技术对比，本发明的有益效果是：本发明方法的合成工艺简单，减少了合成难度，减少杂质(纯度在98％以上)，降低成本，提高了收率。

附图说明

图1为本发明制得的五肽胃泌素的HPLC图谱；

图2为本发明制得的五肽胃泌素的MS图谱。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

实施例1

一种五肽胃泌素合成方法，包括以下步骤：

1)制备树脂(1)：

将树脂2-Chlorotrityl Chloride Resin在有机溶液DCM中浸泡，使树脂2-Chlorotrityl Chloride Resin充分溶胀；用有机溶液DMF溶解片段Fmoc-Asp-Phe-NH₂、DIPEA后，与树脂2-Chlorotrityl Chloride Resin混合震荡，常温下过夜反应，抽掉溶液，用DMF，DCM，无水甲醇各洗三遍；然后加入过量无水甲醇震荡2.5h封闭树脂，抽干，得到树脂(1)：

2)固相法合成五肽胃泌素肽树脂：

以步骤1)所得的树脂(1)为载体通过固相合成法，依次偶联Fmoc-Met-OH，Fmoc-Trp-OH，Boc-β-Ala-OH；得到五肽胃泌素肽树脂；具体方法如下：

2.1)树脂预处理：将树脂(1)用DMF浸泡充分溶胀，抽掉后用DMF洗净。

2.2)加入脱帽试剂：

向树脂(1)中加入其2.5倍体积量的体积比为20％的DBLK溶液反应5min，然后抽滤，用DMF洗涤，抽滤，再添加树脂(1)2.5倍体积量的体积比为20％的DBLK溶液反应10min，去除Fmoc保护基团；然后洗涤6遍，洗涤剂依次为：DMF、无水甲醇、DMF、DCM+DMF、DMF、DMF，抽掉；以DMF为溶剂分别加入3倍摩尔量的Fmoc-Met-OH、TBTU和6倍摩尔量的DIPEA，常温偶联2小时，用茚三酮检测反应进程，偶联结束后抽掉反应液，用DMF洗净；重复2.2)中上述步骤直至完成最后一个氨基酸Boc-β-Ala-OH；用DMF洗三遍，DCM洗三遍，无水甲醇洗三遍(每次洗涤时间为7.5min)；完成洗涤和树脂收缩，干燥得到五肽胃泌素肽树脂；

3)切割：

以DCM为溶剂，配制体积比为2％的TFA切割试剂，进行冷冻；取出后向切割试剂中加入步骤2)所得的五肽胃泌素肽树脂，在0℃下震荡20min；然后升温至25℃震荡2h；抽滤，收集滤液；滤液加入DIPEA，调解pH至中性，旋蒸去掉溶液，用石油醚洗涤5遍，干燥得到五肽胃泌素粗品；

通过HPLC检测粗品纯度，经纯化、转盐、冻干后得五肽胃泌素精品。

实施例2

一种五肽胃泌素合成方法，包括以下步骤：

1)制备树脂(1)：

以Fmoc-Asp(otbu)-OH和H-Phe-NH₂为原料，加入HOBT，DCC溶于有机溶剂THF中，30℃下反应5小时，反应结束后处理得到片段Fmoc-Asp(otbu)-Phe-NH₂；用TFA酸解4小时后处理得到Fmoc-Asp-Phe-NH₂。

将树脂2-Chlorotrityl Chloride Resin在有机溶液DMF中浸泡，使树脂2-Chlorotrityl Chloride Resin充分溶胀；用有机溶液DCM溶解片段Fmoc-Asp-Phe-NH₂、DIPEA后，与树脂2-Chlorotrityl Chloride Resin混合震荡，常温下过夜反应，抽掉溶液，用DMF，DCM，无水甲醇各洗三遍；然后加入过量无水甲醇搅拌1h封闭树脂，抽干，得到树脂(1)：

2)固相法合成五肽胃泌素肽树脂：

以步骤1)所得的树脂(1)为载体通过固相合成法，依次偶联Fmoc-Met-OH，Fmoc-Trp-OH，Boc-β-Ala-OH；得到五肽胃泌素肽树脂；具体方法如下：

2.1)树脂预处理：将树脂(1)用DCM浸泡充分溶胀，抽掉后用DMF洗净。

2.2)加入脱帽试剂：

向树脂(1)中加入其2倍体积量的体积比为20％的DBLK溶液反应4min，然后抽滤，用DMF洗涤，抽滤，再添加树脂(1)2倍体积量的体积比为20％的DBLK溶液反应8min，去除Fmoc保护基团；然后用DMF洗涤6遍，抽掉；以DMF为溶剂分别加入3倍摩尔量的Fmoc-Met-OH、HBTU和6倍摩尔量的NMM，在25℃温度下偶联3小时，用茚三酮检测反应进程，偶联结束后抽掉反应液，用DMF洗净；重复2.2)中上述步骤直至完成最后一个氨基酸Boc-β-Ala-OH；用DMF洗三遍，DCM洗三遍，无水甲醇洗三遍(每次洗涤时间为5min)；完成洗涤和树脂收缩，干燥得到五肽胃泌素肽树脂；

3)切割：

以DCM为溶剂，配制体积比为2％的TFA切割试剂，进行冷冻；取出后向切割试剂中加入步骤2)所得的五肽胃泌素肽树脂，在-10℃下震荡22min；然后升温至23℃震荡2.5h；抽滤，收集滤液；滤液加入NMM，调解pH至中性，旋蒸去掉溶液，用乙醚洗涤3遍，干燥得到五肽胃泌素粗品；

通过HPLC检测粗品纯度，经纯化、转盐、冻干后得五肽胃泌素精品。

实施例3

一种五肽胃泌素合成方法，包括以下步骤：

1)制备树脂(1)：

以Fmoc-Asp(otbu)-OH和H-Phe-NH₂为原料，加入HOBT，DIC溶于有机溶剂DCM中，35℃下反应2小时，反应结束后处理得到片段Fmoc-Asp(otbu)-Phe-NH₂；用TFA酸解6小时后处理得到Fmoc-Asp-Phe-NH₂。

将树脂2-Chlorotrityl Chloride Resin在有机溶液DMF中浸泡，使树脂2-Chlorotrityl Chloride Resin充分溶胀；用有机溶液DCM溶解片段Fmoc-Asp-Phe-NH₂、DIPEA后，与树脂2-Chlorotrityl Chloride Resin混合震荡，常温下过夜反应，抽掉溶液，用DMF，DCM，无水甲醇各洗三遍；然后加入过量无水甲醇搅拌4h封闭树脂，抽干，得到树脂(1)：

2)固相法合成五肽胃泌素肽树脂：

以步骤1)所得的树脂(1)为载体通过固相合成法，依次偶联Fmoc-Met-OH，Fmoc-Trp-OH，Boc-β-Ala-OH；得到五肽胃泌素肽树脂；具体方法如下：

2.1)树脂预处理：将树脂(1)用DMF浸泡充分溶胀，抽掉后用DMF洗净。

2.2)加入脱帽试剂：

向树脂(1)中加入其3倍体积量的体积比为20％的DBLK溶液反应6min，然后抽滤，用DMF洗涤，抽滤，再添加树脂(1)3倍体积量的体积比为20％的DBLK溶液反应12min，去除Fmoc保护基团；然后洗涤6遍，洗涤剂依次为：DMF、无水甲醇、DMF、DCM+DMF、DMF、DMF，抽掉；以DMF为溶剂分别加入3倍摩尔量的Fmoc-Met-OH、HOBT、DIC，在32℃温度下偶联1小时，用茚三酮检测反应进程，偶联结束后抽掉反应液，用DMF洗净；重复2.2)中上述步骤直至完成最后一个氨基酸Boc-β-Ala-OH；用DMF洗三遍，DCM洗三遍，无水甲醇洗三遍(每次洗涤时间为10min)；完成洗涤和树脂收缩，干燥得到五肽胃泌素肽树脂；

3)切割：

以DCM为溶剂，配制体积比为2％的TFA切割试剂，进行冷冻；取出后向切割试剂中加入步骤2)所得的五肽胃泌素肽树脂，在10℃下震荡18min；然后升温至27℃震荡1.5h；抽滤，收集滤液；滤液加入NMM，调解pH至中性，旋蒸去掉溶液，用石油醚洗涤6遍，干燥得到五肽胃泌素粗品；

通过HPLC检测粗品纯度，经纯化、转盐、冻干后得五肽胃泌素精品。

本发明制得的五肽胃泌素纯度在98％以上，

本发明制得的五肽胃泌素的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明制得的五肽胃泌素的HPLC图谱如图1所示，其中各峰情况如下表所示：

本发明制得的五肽胃泌素的MS图谱如图2所示，

本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州固拓生物科技有限公司

<120> 一种五肽胃泌素合成方法

<130> 2016

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Ala Trp Met Asp Phe

1 5