本发明涉及一种便捷高效地粗提葛仙米藻胆蛋白的方法。
背景技术：
葛仙米学名拟球状念珠藻(Nostoc sphaeroides Kutzing)，又称天仙米、天仙菜，是一种可以食用的固氮蓝藻，是一种群体态藻。其藻体含有丰富的蛋白质、8种人体所需氨基酸、藻类淀粉、叶酸、可溶性纤维，多种维生素及15种矿物质，最丰富的有磷、硫、钙、钾、铁等，微量元素有锌、铜、锰、硒，其含钙量之高在蔬菜中极为少见，是一种高钙低脂肪营养均衡的食品。据《本草纲目》和《本草纲目拾遗》等记载，葛仙米可治疗夜盲症、脱肛、烧烫伤等。此外，据《全国中草药汇编》介绍，葛仙米性寒、味淡，具有清热、收敛、益气、明目等药用保健功效。综上所述葛仙米具有可观的食用、药用价值和保健功能。
藻胆蛋白是藻类特有的捕光色素蛋白，是一种重要的生物活性物质。已知藻胆蛋白主要包含藻红蛋白(PE)，藻蓝蛋白(PC)，藻红蓝蛋白(PEC)，别藻蓝蛋白(APC)，它可作为天然的食品色素，不但色彩亮丽，而且具有抗辐射、消炎、促进伤口愈合、调节免疫力、促进造血、抗癌等功效。目前藻胆蛋白用于化妆品、染料、临床医学诊断和免疫化学及生物工程等研究领域中，还可以制成食品和药品用于医疗保健上。
有研究表明葛仙米中的藻胆蛋白包含色素蛋白种类全(PC、PE、PEC和APC)，其中藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)和藻红蓝蛋白(PEC)含量最多，这点优于其他单细胞藻类和群体态藻类，比如发菜、螺旋藻及紫菜等。因此用葛仙米提取藻胆蛋白是藻类植物中最具有开发价值和潜力的研究。
现有针对葛仙米藻胆蛋白提取的技术多采用葛仙米干粉细粉(100目)低温反复冻融，超声破壁，磷酸盐缓冲液浸提的方法。这种方法虽然能够提取到藻胆蛋白，但得率比较低，仅在7％左右，而且使用过程中添加了有机试剂，不能保证最终成品的安全性；常用提取方法在提取过程中进行研究使用到仪器设备较多，操作繁琐，未考虑在实际企业生产过程中会消耗大量人力、物力及能耗；并且大多数研究都集中在怎么将藻蓝蛋白从葛仙米藻胆蛋白中提取分离出来，而没有考虑富含多种营养物质的藻胆蛋白更具食用价值。鉴于此，有必要开发一种快捷高效的从葛仙米中提取藻胆蛋白的方法利于企业大生产。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种快捷高效地粗提葛仙米藻胆蛋白的方法。
为实现上述目的，本发明提供一种葛仙米藻胆蛋白的提取方法，包括将干燥的葛仙米粉碎至20-80目，加入40-60倍重量的纯化水提取4-8h，过滤，制得富含藻胆蛋白的粗提液，冷冻干燥，即得葛仙米藻胆蛋白粗提物。
优选地，所述葛仙米粒径为60-80目，进一步优选为60目或80目；较佳为60目。
优选地，所述葛仙米与纯化水的重量比是1:50。
优选地，所述提取时间为6h。
优选地，所述提取在室温下进行，一般20～25℃。
优选地，所述葛仙米含水量为7％-13％，进一步优选为11％。
优选地，所述过滤前还包括离心的步骤，所述离心转速为5000-10000r/min，离心时间为15-30min；进一步优选地，所述离心转速为8000r/min，离心时间为15min。
具体地，上述葛仙米藻胆蛋白的提取方法，包括将干燥至含水量为11％的葛仙米粉碎至60-80目，加入40-60倍重量的纯化水室温提取6h，于转速8000r/min条件下离心15min，过滤，制得富含藻胆蛋白的粗提液，冷冻干燥，即得葛仙米藻胆蛋白粗提物。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.本发明方法使用20-80目的葛仙米干粉直接提取藻胆蛋白，填补这一研究领域的空白；本发明方法简化了提取工艺，比采用反复冻融、超声破壁、磷酸盐缓冲液浸泡、硫酸铵盐析提取藻胆蛋白的方法简单易操作；
2.本发明方法提高了葛仙米藻胆蛋白粗提物的得率，比现有冻融法提取得率高一倍多，并且也提高了粗提物的藻胆蛋白含量，从7％提高到12％；
3.本发明方法不需要使用任何有机试剂，不破坏藻胆蛋白中多种重要的色素蛋白，真正能够做到安全零添加，放心食用；
4.本方法在提取温度上也有所创新，实现提取藻胆蛋白不必在低温条件下进行，这突破了目前常用的方法对提取温度的限制；
5.本发明方法主要采用葛仙米干物质，它比新鲜的葛仙米易于贮存，在使用、运输过程中方便，节约成本，同时它也比新鲜葛仙米粉碎后藻胆蛋白得率高；为生产企业提供一条更简单实用、节省成本、安全的可工业化大生产的技术工艺。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
以下藻胆蛋白含量检测方法为紫外可见分光光度法，测定波长562nm、615nm、652nm处吸光值，按文献“Bennett A，Bogorad L.Complementary chromatic adaptation in a filamentous blue-green-alga[J].Journal of Cell Biology，1973，58(2)：419—435”记载的方法计算含量。
以下所述得率的计算方法为：
得率％＝{藻胆蛋白粗提物重量/葛仙米粗粉重量×(1-水分)}×100
实施例1采用本发明方法进行实验室小试粗提藻胆蛋白
将经过晒干或者烘干水分葛仙米干物质(含水量11％)用万能粉碎机粉碎至粒径60目，分别取该葛仙米粗粉21.99g、23.94g、23.35g置于烧杯中加入1100g的纯化水，室温下静置6小时后，8000r/min离心15min，过滤，得到粗提液，将粗提液冷冻干燥制得葛仙米藻胆蛋白粗提物。结果见下表1：
表1
由上表1可见，三次提取得到粗提物得率较高，均有20％以上，平均值为22.5％,葛仙米藻胆蛋白粗提物中藻胆蛋白含量平均值为12.5％。经过三次重复实验验证了本发明方法有很好的重现性。
实施例2采用本发明方法进行实验室小试粗提藻胆蛋白
将经过晒干或者烘干水分葛仙米干物质(含水量11％)用万能粉碎机粉碎至粒径80目，分别取该葛仙米粗粉25.12g、25.30g、25.60g置于烧杯中加入1260g的纯化水，室温下静置6小时后，8000r/min离心15min，过滤，得到粗提液，将粗提液冷冻干燥制得葛仙米藻胆蛋白粗提物。结果见下表2：
表2
由上表2可见，三次提取得到粗提物得率较高，均有10％以上，平均值为11.1％,葛仙米藻胆蛋白粗提物中藻胆蛋白含量平均值为10.1％。经过三次重复实验验证了本发明方法有很好的重现性。
实施例3采用本发明方法进行实验室小试粗提藻胆蛋白
将经过晒干或者烘干水分葛仙米干物质(含水量11％)用万能粉碎机粉碎至粒径20目，分别取该葛仙米粗粉24.87g、25.45g、25.00g置于烧杯中加入1260g的纯化水，室温下静置6小时后，8000r/min离心15min，过滤，得到粗提液，将粗提液冷冻干燥制得葛仙米藻胆蛋白粗提物。结果见下表3：
表3
由上表3可见，三次提取得到粗提物得率较高，均有10％以上，平均值为13.2％,葛仙米藻胆蛋白粗提物中藻胆蛋白含量平均值为9.8％。经过三次重复实验验证了本发明方法有很好的重现性。
对比例1
将葛仙米干物质(含水量11％)粉碎至粒径100目，取该葛仙米细粉12.92g、12.39g、13.51g，按文献“汪兴平等，反复冻融法在葛仙米破壁技术上的应用”记载的方法，采用多次冻融法提取葛仙米藻胆蛋白，制得葛仙米藻胆蛋白粗提物。结果见下表4：
表4
由上表4可知，三次提取得到的粗提物得率平均值为16.3％，葛仙米藻胆蛋白粗提物中藻胆蛋白含量平均值为7.1％，葛仙米藻胆蛋白粗提物中藻胆蛋白含量均显著低于实施例1。
反复冻融不仅增加了操作次数，而且在实际生产应用中会增加成本，而本发明方法一次操作即可，验证了本法可操作性强，操作简便，使用成本远低于反复冻融。
对比例2
分别取新鲜葛仙米(含水量98％)1.78kg、1.74kg、1.80kg，按与对比例1相同的方法提取葛仙米藻胆蛋白，制得葛仙米藻胆蛋白粗提物。结果见下表5：
表5
由上表5可知，三次冻融法提取得率均在10％以下，平均值为7.5％，葛仙米藻胆蛋白粗提物中藻胆蛋白含量平均值为2.2％。由表1和表5可见，使用本发明方法从干粉中提取藻胆蛋白粗提物比从新鲜葛仙米中得到的高3倍多。这也是本方法选用葛仙米干品制备而不用新鲜葛仙米的原因。
对比例3
分别取粉碎至粒径在60目的葛仙米粗粉(含水量11％)33.88g、33.49g、22.21g，采用对比例1反复冻融法提取藻胆蛋白，制得葛仙米藻胆蛋白粗提物，结果见下表6：
表6
由上表6可知，三次提取得率均在10％以上，得到的粗提物得率平均值为13.4％；葛仙米藻胆蛋白粗提物中藻胆蛋白含量平均值为5.5％。由表1和表6可见，葛仙米藻胆蛋白粗提物中藻胆蛋白含量均显著低于实施例1。
另外，本对比例3所得葛仙米藻胆蛋白粗提物成品外观、颜色均不如实施例1好。实施例1所得葛仙米藻胆蛋白粗提物颜色为紫色，而对比例3所得葛仙米藻胆蛋白粗提物颜色为紫灰色。
通过对比再一次验证了本发明方法比目前普遍使用的多次冻融法提取得到的藻胆蛋白粗提物得率高，且葛仙米藻胆蛋白粗提物中藻胆蛋白含量高，验证了本法的高效性。
对比例4
分别取葛仙米干物质(含水量11％)粉碎至粒径在10目、60目、100目各22.47g，分别采用实施例1方法和对比例1冻融法进行提取，制得葛仙米藻胆蛋白粗提物。对其含量进行对比，结果见下表7：
表7
由上表7可知，粒径过大(10目)葛仙米干物质未能完全粉碎，不能提取藻胆蛋白；采用实施例1方法提取细粉(100目)含量和得率均不高；实施例1方法粗粉(60目)提取得到的粗提物藻胆蛋白含量高于对比例1细粉(100目)冻融法。
综上所述，采用本发明方法可以从葛仙米中得到藻胆蛋白含量在10％以上，提取得率在20％以上的粗提物，并且本发明方法比现有报道的研究中采用的制备工艺周期短，操作简便；比使用新鲜葛仙米和葛仙米细粉提取得率高，同时本发明方法还将藻胆蛋白含量从已有文献中报道的7％提高到12％以上。故本发明方法比其他提取工艺有明显的优势和创新。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。