猪带绦虫TsEP45重组蛋白及其应用的制作方法

本发明涉及猪带绦虫TsEP45重组蛋白及其应用，尤其涉及TsEP45重组蛋白作为猪囊尾蚴病特异性检测抗原的应用和在基于TsEP45重组蛋白的猪囊尾蚴病间接ELISA（iELISA）鉴别诊断试剂盒中的应用。

背景技术：

囊虫病（Cysticercosis）是由猪带绦虫（Taeniasolium）幼虫寄生在人和猪的皮下、肌肉和脑等部位引起的一种食源性的人兽共患寄生虫病。该病不但对养猪业造成巨大经济损失，而且严重威胁着食品安全和人类健康。由于猪感染囊尾蚴后，无明显临床症状，因而该病生前的血清学诊断就显得尤为重要。目前，用于人囊尾蚴病和猪囊尾蚴病血清学诊断的抗原有不少，但无论是虫体抗原还是重组抗原，都与其他寄生虫存在明显交叉反应，尤其是与其亲缘关系很近的猪细颈囊尾蚴病存在严重的交叉反应，导致临床检测常常出现假阳性。因此，寻找与猪细颈囊尾蚴无交叉反应的猪囊尾蚴特异性诊断抗原，是该病诊断和综合防控中的首要问题。

研究发现，丝氨酸蛋白酶抑制剂在蠕虫寄生宿主免疫调节中扮演着重要角色，病原体的丝氨酸蛋白酶抑制剂通过干扰宿主免疫调节信号来抑制宿主免疫系统的激活。因此，研究猪带绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂的免疫调节功能，无疑将为阐明猪带绦虫在感染宿主过程中的免疫逃避机制和探索新的诊断和疫苗抗原具有指导意义。丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serpin）是一类重要的结构相似、功能多样的球状蛋白酶抑制剂超家族，真核生物、细菌、病毒、古细菌中都发现存在serpin基因。寄生蠕虫的Serpins通过抑制宿主丝氨酸蛋白酶活性，使其免受宿主体内蛋白水解酶类的降解，从而逃避宿主的免疫攻击。已有研究表明，从蛔虫、钩虫等寄生虫分离的丝氨酸蛋白酶抑制剂可抑制胰蛋白酶、糜蛋白酶等肠道消化酶活性。埃及血吸虫通过虫体表面丝氨酸蛋白酶抑制剂因子与人的胰蛋白酶相结合来降低自身的免疫原性，从而逃脱宿主的免疫攻击。此外，血吸虫的丝氨酸蛋白酶抑制剂还可作为种特异性抗原，鉴别诊断埃及血吸虫和曼氏血吸虫。因此，Serpin有望成为重要的猪囊尾蚴病诊断和疫苗抗原候选分子，用于该病新型诊断制剂和方法以及新型疫苗的研究。我们的研究已表明，在猪带绦虫的5个serpin基因的表达产物中，无论是特异性还是敏感性TsEP45都明显优于其他serpin和已知的一些诊断抗原，尤其是与猪细颈囊尾蚴几乎不存在任何交叉反应，显示了良好的应用前景。

技术实现要素：

为解决现有猪囊尾蚴病诊断抗原存在的交叉反应问题，本发明提供了猪带绦虫TsEP45重组蛋白及其应用，尤其涉及TsEP45重组蛋白作为猪病囊尾蚴特异性检测抗原的应用和TsEP45重组蛋白在制备猪囊尾蚴病iELISA检测试剂盒中的应用。

本发明的第一个目的是提供猪带绦虫TsEP45重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2。

本发明的第二个目的是提供猪带绦虫TsEP45重组蛋白作为猪带绦虫/囊尾蚴检测抗原的应用；所述猪带绦虫TsEP45重组蛋白的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2。

本发明的第三个目的是提供猪带绦虫TsEP45重组蛋白在制备猪囊尾蚴病检测试剂盒中的应用；所述重组蛋白的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2。

本发明的第四个目的是提供一种猪囊尾蚴病iELISA检测试剂盒，所述试剂盒中包被抗原为猪带绦虫TsEP45重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.2。

作为优选，所述包被抗原的浓度为10μg/ml。

作为优选，所述试剂盒中还包括HRP标记的兔抗猪IgG。

作为优选，所述试剂盒还包括包被缓冲液，所述包被缓冲液为pH9.6的碳酸盐缓冲液。

作为优选，所述试剂盒还包括封闭液，所述封闭液为1%BSA。

本发明的第五个目的是提供一种猪囊尾蚴iELISA检测方法，所述方法不以专利法规定的疾病的诊断和治疗为目的，以纯化的TsEP45重组蛋白 1μg于37℃包被酶标反应板1h，封闭液为1%BSA，用PBST充分洗涤后分别加入待测样品和猪阳性血清、猪阴性血清，37℃孵育1h，PBST洗涤三次后，加入1:10000倍稀释的HRP标记的兔抗猪IgG，充分洗涤后显色，终止反应后测定吸光度，P(阳性)/N（阴性）>2时，为阳性血清，反之，为阴性血清。

本发明利用猪带绦虫基因组和转录组数据设计TsEP45特异引物，以猪囊尾蚴总RNA为模板，RT-PCR扩增TsEP45基因，并通过生物信息学分析进行鉴定。构建pET-30a-TsEP45重组表达载体，在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。纯化的目的蛋白进行SDS-PAGE和Western-blotting分析。结果表明，TsEP45的ORF由1350个核苷酸组成，编码449个氨基酸残基；其编码氨基酸具有Serpins较为保守的反应中心环（RCL）和特征性结构域，并且存在13个潜在的线性B淋巴细胞抗原表位。TsEP45的表达产物主要以包涵体形式存在，且可与猪囊尾蚴阳性血清发生反应，在55kDa处产生特异条带。以纯化的TsEP45重组蛋白 1μg作为间接ELISA的诊断抗原，可特异性检测猪囊尾蚴阳性血清，而与猪细颈囊尾蚴、猪旋毛虫、弓形虫无任何交叉反应。结论：所克隆的片段即为TsEP45，其表达产物可作为猪囊尾蚴病iELISA诊断的特异性抗原。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为猪囊尾蚴的TsEP45基因的PCR扩增结果；其中，M: DNA分子质量标准；1：TsEP45；

图2为TsEP45的三级结构预测；

图3为TsEP45部分序列与其他寄生虫丝氨酸蛋白酶抑制剂的序列对比；

图4为不同物种TsEP45 的系统进化分析；

图5为TsEP45融合蛋白纯化结果；其中，M:蛋白质分子质量标准；1：TsEP45；

图6为TsEP45融合蛋白Western-blotting结果，其中，M:蛋白质分子质量标准；1:猪阳性血清；2：猪阴性血清；

图7为基于Tsserpins的猪囊尾蚴病特异性检测；

图8为基于TsEP45抗原的ELISA检测方法的敏感性和特异性。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

实施例1

1材料与方法

1.1虫株与血清

猪囊尾蚴、猪囊尾蚴阳性和阴性血清、猪细颈囊尾蚴血清、猪旋毛虫血清和猪弓形虫血清均由中国农业科学院兰州兽医研究所蠕虫病课题组保存。

质粒小量提取试剂盒、TRIzol Reagent、DNA胶回收试剂盒、pMD-T-19(simple)Vector、限制性内切酶BamH I、Hind III、T4 DNA连接酶、均购自Takara公司；Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒、Prestained Protein Ladder均购自Thermo公司；大肠杆菌感受态细胞、pET-30a、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、X-Gal、5×蛋白上样缓冲液均购自北京全式金生物技术有限公司；兔抗猪IgG（HRP）购自Sigma公司；Ni Sepharose 6 Fast Flow蛋白纯化试剂盒购自GE公司。

用TRIzol法提取猪带绦虫囊尾蚴的总RNA，以Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒合成cDNA第一链。

根据本申请人完成的猪带绦虫全基因组测序注释信息及转录组分析，并结合GeneDB数据库公布的猪带绦虫EP45的开放阅读框序列，利用软件Primer 5.0设计一对特异性引物，上游引物加入Sac I酶切位点，其序列为：5'-CGAGCTCATGATTTCTCTACGTATGAGAGAC-3'；下游引物加入Hind III酶切位点，其序列为：5'-CCCAAGCTTGCTAGTGGCAGAGTGTGGAG-3'。引物送至江苏金唯智生物技术有限公司合成。

以反转录的cDNA为模板，用TsEP45基因特异性引物进行PCR扩增。PCR反应体系为：cDNA0.5µL，5×PS Buffer 10µL，dNTP Mix 4µL，上下游引物各1µL，Easy Taq酶 1µL，补水至50µL。PCR扩增程序如下：95℃ 5min；94℃ 40s，67℃ 40s，72℃ 1min，30个循环；72℃ 10min。PCR产物纯化后克隆入pMD-T-19 simple载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。选择单克隆菌株进行PCR和酶切鉴定，阳性克隆送江苏金唯智生物技术有限公司测序。该扩增产物的核苷酸序列为：ATGATTTCTCTACGTATGAGAGACAAAGGAAAGGCAGCTGCATCTGAGCCTGAGAGACCCAAGTCTACTTTTTCGAAAAGCGTCAAAGTCAATCCGGTCGACTATCTGAAGCACAGGGACTTCAACAACAAATATTGCTTCGGTGTTCATGCCATTAATGACATCACCAAGAAGTCGGGTCACTCGCCAACAACGATACGCTTCCTCCTGACAGTGTTGGTGGGCTCGAAGGCGGCACGGGGCACTAGTGCGGACCAGATCACACAGGCACTCAGCACCACGAACTCACGTGACGTGGGCACCGAATGCACCAGCCTCGTGGACAGCGCGCTTGACGAGTGGGCTCTGCTCTCTACTGCGGGTCTAAGCGATATACCACTCGATCGCATTGAGGAAGGGCGCCTCTGTCGCTTTCAGTCTGCTATCTTCGTCCCCATGGATGATCTCACCTTCAAGGCCGAGTTCCAGTGGTTGATCACCAACCGCATGGGTGTCGTCTGGACTCAGACTTCGAGAAAGGATTTCGCCCATGCTCAGAAGTGGTTATCCAAAGTGTCAAAAGGTTTATTCACTCACCACTTTCCAAAACAATGTGCCAACTCTATTGTACTTGCCACAGCATTACAATTTAAAGGCAGGTGGACTCAACCTTTGGAACTCTACGGTAGTTCCAAGGGATCATTCGAAGTGTCACCCCACTCGAAGATCGATGTTCCTATGCTAAAAATTTCAACAAAGGTTATTTACTATAAGGATACCAAAAAAGGCTTCCATTTGGTTGGAATTCCACTTAAGGATGCGCGGTTCGCAATCGCATTTCTATTACCCTTGGTGCCGCACAAGTTCGTAGAGGTGGAGCATCGCTTTACAGAGGGTTTGAACTACGGTCTCTTCAACAGCTCGCGACTGCATTTCTGCAGCATGCACGTGGTCATTCCTATGTTCCGAGTGCAAACGGAGGTGGACCTCTGTAAGGCCTTGCCCTTCCTCGGCATGAGCAATCCATTCGATTCTGATCGGGCAGACTTCTCCGGTATCAGCGATGTAGAGAATCTGCATATCAACAGCGGCAAGGAGTCGGCCTTTCTGCAGGTCTCCAGAAGCGGGATCCGACTGCTCTCAGTGGGTACTCTCAATCTGGAGACGAACCAGCACCAGTTTAGGCATCCTGACCTCTTTGAGGTGCCAACCCTCGAGGCACCCGGGGACGTGGACCCAAAGGGGTTGCACTCTTTCTTAGTGAATCAGCCCTTTGCTGTCATCCTCATTGATCGCGAGTCCGGCTGCGTCCTATACCAAGCCAGAATCAAGGTGCCTGAGCCCCCCCCCAACTCCACACTCTGCCACTAA。

利用在线软件预测并分析蛋白质的理论分子质量、氨基酸组成、信号肽、二级和三级结构、B细胞抗原表位、结构域等。

用BlastP软件将TsEP45的氨基酸序列与GenBank中的其他物种氨基酸序列进行比对，利用MEGA 6.0 软件中Test Maximum Likelihood Tree方法对选择的序列构建进化树并分析。

将鉴定正确的pMD19-T-TsEP45及原核表达载体pET-30a质粒分别用BamH I+XhoI进行双酶切。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，对目的片段进行纯化回收。利用T4 DNA连接酶将目的片段与pET-30a连接，并转化BL21(DE3)感受态细胞，提取质粒进行PCR及酶切鉴定，阳性克隆进行测序验证。

取测序正确的阳性克隆菌液1:100接种于100mL LB(卡那抗性100mg/mL)液体培养基中，37℃ 220r/min振荡培养至菌液OD_600nm=0.6~0.8时，加入100μL 500mmol/L的IPTG，37℃ 220r/min振荡培养6h。收集诱导表达的菌液进行SDS-PAGE分析。同时设置诱导前和pET-30a转化菌液的诱导表达产物作为对照。

取50mL诱导表达的菌液，8000r/min离心15min,弃上清，加等体积的PBS重悬菌体沉淀后，反复冻融3次。利用超声破碎仪处理菌体悬液20min，直至溶液澄清透亮。4℃，12000r/min离心10min，分别收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE分析。利用镍NTA琼脂糖凝胶FF在不同咪唑梯度下对目的蛋白进行纯化。纯化后的蛋白用猪囊尾蚴阳性血清进行Western-blotting检测。该纯化后的重组蛋白的氨基酸序列为：

MISLRMRDKGKAAASEPERPKSTFSKSVKVNPVDYLKHRDFNNKYCFGVHAINDITKKSGHSPTTIRFLLTVLVGSKAARGTSADQITQALSTTNSRDVGTECTSLVDSALDEWALLSTAGLSDIPLDRIEEGRLCRFQSAIFVPMDDLTFKAEFQWLITNRMGVVWTQTSRKDFAHAQKWLSKVSKGLFTHHFPKQCANSIVLATALQFKGRWTQPLELYGSSKGSFEVSPHSKIDVPMLKISTKVIYYKDTKKGFHLVGIPLKDARFAIAFLLPLVPHKFVEVEHRFTEGLNYGLFNSSRLHFCSMHVVIPMFRVQTEVDLCKALPFLGMSNPFDSDRADFSGISDVENLHINSGKESAFLQVSRSGIRLLSVGTLNLETNQHQFRHPDLFEVPTLEAPGDVDPKGLHSFLVNQPFAVILIDRESGCVLYQARIKVPEPPPNSTLCH

2结果

2.1 TsEP45基因的扩增及生物信息学分析

以猪囊尾蚴的cDNA为模板，通过PCR扩增，获得大小为1350bp左右的片段，与预期结果一致（图1）。

TsEP45cDNA序列含有一个由1350bp的开放阅读框，编码由449个氨基酸残基组成的多肽。综合分析表明，TsEP45蛋白的抗原表位可能主要位于氨基酸序列的第2-10、12-25、52-62、77-83、89-98、165-173、180-186、218-227、248-254、334-340、352-359、361-369、421-427位。MotifScan分析表明，TsEP45可能存在1个潜在的cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点、9个潜在的酪蛋白激酶磷酸化位点、5个潜在的N-豆蔻酰化位点、13个潜在的蛋白激酶C磷酸化位点和1个潜在的酪氨酸蛋白激酶磷酸化位点。SMART分析显示，TsEP45氨基酸序列中60-434位为serpin结构域，具有Serpin蛋白的保守序列FXVDHPFLFFI。TsEP45三级结构预测显示，该蛋白有11个α螺旋，15个β折叠，其余为无规卷曲（图2），与二级结果预测相符。

通过同源序列相似性比较发现，TsEP45与其他物种的Serpins拥有共同的活性位点即Serpins反应中心环（RCL），具有丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员的特征性保守结构：FXVDHPFLFFI（图3）。

在图3中，红色下划线表示serpins特征性保守区序列，黑色方框表示serpins较为保守的反应中心环。Sh(Schistosomahaematobium)，Em (Echinococcusmultilocularis)，Eg (Echinococcusgranulosus)，Sj (Schistosomajaponicum)，Sm (Schistosomamansoni)，Cs(Clonorchissinensis)，Pw(Paragonimuswestermani)，Hc (Haemonchuscontortus)，Tv (Trichostrongylusvitrinus)，Bm1and Bm2 (Brugiamalayi), Ta(Taeniaasiatica), Ts (Taeniasaginata)。

利用MEGA 6.0 软件中Test Maximum Likelihood Tree方法构建系统进化树。结果表明，TsEP45与细粒棘球绦虫的Serpin位于同一分支，亲缘关系最近，而与其他物种的亲缘关系较远。结果如图4。

重组质粒pET-30a-TsEP45经PCR鉴定和酶切鉴定均得到约1350bp的片段，说明成功构建了携带TsEP45基因的原核表达载体。用IPTG对pET-30a-TsEP45重组菌诱导表达，并经SDS-PAGE检测分析，在预期的55kDa附近出现蛋白目的条带，经超声破碎后菌体SDS-PAGE分析结果表明，目的蛋白主要以包涵体形式存在。

8M尿素溶解包涵体沉淀，用Ni-NTA Purification System进行纯化。SDS-PAGE分析表明，目的蛋白获得较好的纯化效果（结果如图5）。以纯化的TsEP45重组蛋白为抗原，进行Western-blot分析。结果显示，TsEP45蛋白可与猪囊尾蚴阳性血清特异性反应，说明TsEP45蛋白具有良好的免疫反应性(图6)。

丝氨酸蛋白酶抑制剂呈现构象多态性，功能多样性，它们大多数都属于非经典类Kazal抑制剂家族。丝氨酸蛋白酶抑制剂大多数为单链的糖蛋白，核心结构含有8-9个α-螺旋和3个β折叠，主要标志性的结构是较为保守的反应中心环（reactive center loop, RCL）。RCL结构是丝氨酸蛋白酶识别丝氨酸蛋白酶抑制的靶点，当RCL被丝氨酸蛋白酶识别并被切开后,丝氨酸蛋白酶抑制剂的构象发生改变，从而引起丝氨酸蛋白酶的构象也发生改变，导致酶的活性中心破坏，发挥抑制作用。同源序列比对显示，TsEP45具有丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员的特征性保守结构：FXVDHPFLFFI。系统进行分析也表明所获得的序列与棘球绦虫Serpin亲缘关系较近，说明本发明获得的序列即为猪带绦虫TsEP45基因。

本发明利用生物信息学分析对TsEP45蛋白进行预测，表明该蛋白N端不含信号肽序列，可能为非分泌型蛋白。已有研究表明，Serpin基因家族成员既可胞内表达，也可分泌到胞外。但仅仅根据TsEP45缺乏信号肽序列就判定其为非分泌性蛋白可能不太准确。因为已有研究表明，绦虫许多蛋白序列虽然缺乏信号肽序列，但在其囊液中都能检测到该蛋白组分，说明这些蛋白即使没有信号肽仍然可分泌到细胞外。本发明在原核表达系统中高效表达的TsEP45蛋白，虽然主要以包涵体形式存在，但可与猪囊尾蚴阳性血清发生特异性反应，说明重组TsEP45具有良好的免疫反应性，而且该蛋白可能为分泌性蛋白，可分泌到虫体外刺激宿主产生针对该组分的特异性抗体。以上结果表明TsEP45具有作为猪囊虫病血清学诊断候选分子的潜力。此外，通过对TsEP45蛋白B淋巴细胞抗原表位的预测，表明该蛋白具有13个潜在的线性B细胞表位，说明TsEP45还可能成为新型疫苗研发的候选分子。

现已研究证实，在蠕虫、原生动物和其他寄生虫中都存在丝氨酸蛋白酶抑制剂，Serpins在寄生虫-宿主相互作用过程中起着十分重要的作用，通过调节内源性蛋白酶和外源性蛋白酶的作用，使寄生虫成功逃避宿主的防御机制。寄生虫在感染宿主的过程中，其丝氨酸蛋白酶抑制剂可通过抑制宿主丝氨酸蛋白酶的活性，从而使自身的蛋白酶免遭宿主降解，逃避宿主免疫攻击。因此，进一步研究猪带绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在虫体入侵及寄生过程中的功能和作用，将为阐明猪带绦虫入侵和免疫逃避机制，以及猪带绦虫新型疫苗和生物药物的研发提供理论基础。

实施例2基于重组抗原TsEP45的ELISA试剂盒

本发明的ELISA试剂盒包括：

用包被缓冲液稀释的纯化的TsEP45重组蛋白，包被抗原浓度为10μg/ml，每孔100 μl，包被缓冲液为pH9.6的碳酸盐缓冲液；

封闭液：1%BSA，每孔100 μl；

猪阳性血清，1:200稀释，每孔100 μl；

猪阴性血清，1:200稀释，每孔100 μl；

HRP标记的兔抗猪IgG，1:10000稀释，每孔100 μl；

显色剂：TMB，每孔50 μl；

终止液：浓硫酸，每孔20 μl。

实施例3 基于重组抗原TsEP45的ELISA对猪囊尾蚴病的特异性检测

以纯化的TsEP45重组蛋白 1μg于37℃包被酶标反应板1h，包被缓冲液为pH9.6的碳酸盐缓冲液，包被抗原浓度为10μg/ml，封闭液为1%BSA，用PBST充分洗涤后分别加入倍比稀释的猪阴性血清及猪囊尾蚴、猪细颈囊尾蚴、猪旋毛虫和猪弓形虫阳性血清，37℃孵育1h，PBST洗涤三次后，加入1:10000倍稀释的HRP标记的兔抗猪IgG，充分洗涤后再加入TMB显色，用浓硫酸终止反应后测定吸光度。检测结果如表1所示。

表1 以重组TsEP45(1μg)为抗原的ELISA检测结果

从表1可以看出，TsEP45抗原与200倍稀释的猪囊尾蚴阳性血清反应的平均OD值达1.36，而与同样倍数稀释的猪阴性血清、猪细颈囊尾蚴阳性血清、猪旋毛虫阳性血清、猪弓形虫阳性血清反应的OD值均在0.4以下，即P(阳性)/N（阴性）=5.91>2（图7所示）。说明以TsEP45为抗原的ELISA方法，具有很好的检测特异性，克服了现有血清学检测方法易与猪细颈囊尾蚴病等存在交叉反应的缺点，是理想的猪囊尾蚴病特异性检测抗原。

实施例4 基于Tsserpins的猪囊尾蚴病的特异性检测

基于Tsserpins建立间接ELISA方法：样品为猪囊尾蚴阳性血清30份（T.solium cysticercus ,Ts, n=30)）；猪细颈囊尾蚴阳性血清6份（Cysticercus tenuicollis ,Ct, n=6)）；猪旋毛虫阳性血清6份（Trichinellaspiralis ,Tr, n=6)）；猪弓形虫阳性血清6份（Toxoplasma gondii,Tg, n=6)）；阴性(control)血清51份。以实施例3中的ELISA方法进行检测，每个检测点重复三次，统计显著性为p<0.05（*=p<0.05, **=p<0.01, ***=p<0.001）。

图7为基于Tsserpins的猪囊尾蚴病特异性检测。其中，

图A为不同Tsserpins与猪囊尾蚴阳性血清反应性检测；

图B为基于Ts570的猪囊尾蚴病特异性检测；

图C为基于TsEP45的猪囊尾蚴病特异性检测；

图D为基于TsB6的猪囊尾蚴病特异性检测；

图E为基于Ts4848的猪囊尾蚴病特异性检测；

图F为基于Ts12383的猪囊尾蚴病特异性检测；

图中，Ts：猪囊尾蚴血清；Ct：猪细颈囊尾蚴血清；Tr：猪旋毛虫阳性血清；Tg,：猪弓形虫阳性血清；Control:阴性血清。

实施例5基于重组抗原TsEP45的ELISA方法的特异性和敏感性

应用实施例2和3中的试剂盒及检测方法对51份阴性血清和30份猪囊尾蚴阳性血清进行检测和分析，绘制ROC曲线。从该曲线可以得出，基于TsEP45抗原的ELISA检测方法的敏感性和特异性分别达到93.33%和94.12%（图8和表2所示）。说明基于该抗原的ELISA方法具有很高的敏感性和特异性。

表2 ROC曲线分析

注：曲线下面积（AUC）、似然比（LR）、敏感性、特异性作为基于TsEP45、TsB6 和 Ts570的间接ELISA方法的评价指标。比较显示，TsEP45的诊断价值优于TsB6 和 Ts570。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 猪带绦虫TsEP45重组蛋白及其应用

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1350

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgatttctc tacgtatgag agacaaagga aaggcagctg catctgagcc tgagagaccc 60

aagtctactt tttcgaaaag cgtcaaagtc aatccggtcg actatctgaa gcacagggac 120

ttcaacaaca aatattgctt cggtgttcat gccattaatg acatcaccaa gaagtcgggt 180

cactcgccaa caacgatacg cttcctcctg acagtgttgg tgggctcgaa ggcggcacgg 240

ggcactagtg cggaccagat cacacaggca ctcagcacca cgaactcacg tgacgtgggc 300

accgaatgca ccagcctcgt ggacagcgcg cttgacgagt gggctctgct ctctactgcg 360

ggtctaagcg atataccact cgatcgcatt gaggaagggc gcctctgtcg ctttcagtct 420

gctatcttcg tccccatgga tgatctcacc ttcaaggccg agttccagtg gttgatcacc 480

aaccgcatgg gtgtcgtctg gactcagact tcgagaaagg atttcgccca tgctcagaag 540

tggttatcca aagtgtcaaa aggtttattc actcaccact ttccaaaaca atgtgccaac 600

tctattgtac ttgccacagc attacaattt aaaggcaggt ggactcaacc tttggaactc 660

tacggtagtt ccaagggatc attcgaagtg tcaccccact cgaagatcga tgttcctatg 720

ctaaaaattt caacaaaggt tatttactat aaggatacca aaaaaggctt ccatttggtt 780

ggaattccac ttaaggatgc gcggttcgca atcgcatttc tattaccctt ggtgccgcac 840

aagttcgtag aggtggagca tcgctttaca gagggtttga actacggtct cttcaacagc 900

tcgcgactgc atttctgcag catgcacgtg gtcattccta tgttccgagt gcaaacggag 960

gtggacctct gtaaggcctt gcccttcctc ggcatgagca atccattcga ttctgatcgg 1020

gcagacttct ccggtatcag cgatgtagag aatctgcata tcaacagcgg caaggagtcg 1080

gcctttctgc aggtctccag aagcgggatc cgactgctct cagtgggtac tctcaatctg 1140

gagacgaacc agcaccagtt taggcatcct gacctctttg aggtgccaac cctcgaggca 1200

cccggggacg tggacccaaa ggggttgcac tctttcttag tgaatcagcc ctttgctgtc 1260

atcctcattg atcgcgagtc cggctgcgtc ctataccaag ccagaatcaa ggtgcctgag 1320

ccccccccca actccacact ctgccactaa 1350

<210> 2

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工蛋白

<400> 2

Met Ile Ser Leu Arg Met Arg Asp Lys Gly Lys Ala Ala Ala Ser Glu

1 5 10 15

Pro Glu Arg Pro Lys Ser Thr Phe Ser Lys Ser Val Lys Val Asn Pro

20 25 30

Val Asp Tyr Leu Lys His Arg Asp Phe Asn Asn Lys Tyr Cys Phe Gly

35 40 45

Val His Ala Ile Asn Asp Ile Thr Lys Lys Ser Gly His Ser Pro Thr

50 55 60

Thr Ile Arg Phe Leu Leu Thr Val Leu Val Gly Ser Lys Ala Ala Arg

65 70 75 80

Gly Thr Ser Ala Asp Gln Ile Thr Gln Ala Leu Ser Thr Thr Asn Ser

85 90 95

Arg Asp Val Gly Thr Glu Cys Thr Ser Leu Val Asp Ser Ala Leu Asp

100 105 110

Glu Trp Ala Leu Leu Ser Thr Ala Gly Leu Ser Asp Ile Pro Leu Asp

115 120 125

Arg Ile Glu Glu Gly Arg Leu Cys Arg Phe Gln Ser Ala Ile Phe Val

130 135 140

Pro Met Asp Asp Leu Thr Phe Lys Ala Glu Phe Gln Trp Leu Ile Thr

145 150 155 160

Asn Arg Met Gly Val Val Trp Thr Gln Thr Ser Arg Lys Asp Phe Ala

165 170 175

His Ala Gln Lys Trp Leu Ser Lys Val Ser Lys Gly Leu Phe Thr His

180 185 190

His Phe Pro Lys Gln Cys Ala Asn Ser Ile Val Leu Ala Thr Ala Leu

195 200 205

Gln Phe Lys Gly Arg Trp Thr Gln Pro Leu Glu Leu Tyr Gly Ser Ser

210 215 220

Lys Gly Ser Phe Glu Val Ser Pro His Ser Lys Ile Asp Val Pro Met

225 230 235 240

Leu Lys Ile Ser Thr Lys Val Ile Tyr Tyr Lys Asp Thr Lys Lys Gly

245 250 255

Phe His Leu Val Gly Ile Pro Leu Lys Asp Ala Arg Phe Ala Ile Ala

260 265 270

Phe Leu Leu Pro Leu Val Pro His Lys Phe Val Glu Val Glu His Arg

275 280 285

Phe Thr Glu Gly Leu Asn Tyr Gly Leu Phe Asn Ser Ser Arg Leu His

290 295 300

Phe Cys Ser Met His Val Val Ile Pro Met Phe Arg Val Gln Thr Glu

305 310 315 320

Val Asp Leu Cys Lys Ala Leu Pro Phe Leu Gly Met Ser Asn Pro Phe

325 330 335

Asp Ser Asp Arg Ala Asp Phe Ser Gly Ile Ser Asp Val Glu Asn Leu

340 345 350

His Ile Asn Ser Gly Lys Glu Ser Ala Phe Leu Gln Val Ser Arg Ser

355 360 365

Gly Ile Arg Leu Leu Ser Val Gly Thr Leu Asn Leu Glu Thr Asn Gln

370 375 380

His Gln Phe Arg His Pro Asp Leu Phe Glu Val Pro Thr Leu Glu Ala

385 390 395 400

Pro Gly Asp Val Asp Pro Lys Gly Leu His Ser Phe Leu Val Asn Gln

405 410 415

Pro Phe Ala Val Ile Leu Ile Asp Arg Glu Ser Gly Cys Val Leu Tyr

420 425 430

Gln Ala Arg Ile Lys Val Pro Glu Pro Pro Pro Asn Ser Thr Leu Cys

435 440 445

His