本发明属于植物基因工程
技术领域：
：，具体涉及一种提高棉花再生及转化效率的方法及应用。
背景技术：
：：一个成功的棉花的遗传转化体系依赖于高效稳定的转化和植株再生过程。随着农杆菌介导的遗传转化和基因枪转化的广泛应用，棉花的转化技术日益成熟，转基因抗虫棉也取得了巨大的成功,但是转化细胞的再生的频率和受体棉花基因型的限制仍是棉花转基因的最重要限制因素。前期研究表明棉花组织培养植株再生的途径主要是通过两种途径：一是器官发生途径，二是体细胞胚胎发生途径。目前，体细胞胚胎发生是棉花植株再生的主要途径。棉花野生种克劳茨基棉最早实现了胚胎发生，但当时没有能得到再生植株。1983年Davidonis等在继代了两年的陆地棉珂字310的胚性愈伤组织中得到了再生植株。其它研究者也报道了成功的棉花体细胞胚胎发生和植株再生。Trolinderetal(1987)通过硝酸钾加倍和悬浮培养等改进技术，得到了一个简单高效的再生程序。但这种方法比较适用于珂字棉系列，而且再生的植株会有一定程度上的细胞学和形态学的变异。陈志贤等(1987)等将Trolinder的技术引入中国，成功的再生了多个国内品种。张家明和孙济中(1994)，张家明和张献等(1997)研究发现具有胚胎发生能力的品种具有较为明显的地域性特征，黄河流域品种比长江流域品种容易获得再生植株。Sunetal(2006)成功再生了多个野生棉材料，并从珂字201的六种外植体分离的原生质体通过体细胞胚胎发生得到了再生植株(Sunetal.,2005)。早期研究表明影响体细胞胚发生和植株再生的因素的主要因素如下：包括外植体类型，激素组合，基因型，培养方式等。其中基因型的影响对棉花体细胞胚胎发生和植株再生能力具有决定性作用。在棉属不同棉种间体细胞胚胎发生和植株再生能力差异很大。有人对多个棉种进行了比较，发现只有陆地棉、雷蒙德氏棉、夏威夷棉能形成体细胞胚(董合忠等，1990)。董合忠和陈志贤(1991)比较了4个棉花栽培种的体细胞胚发生能力，发现陆地棉较易诱导体细胞胚，亚洲棉次之，海岛棉和非洲棉较差。棉属共有50个种，其中46个野生种，4个栽培种，而到目前为止仅克劳茨基棉、陆地棉、海岛棉、亚洲棉、草棉、夏威夷棉、旱地棉、戴维逊棉、雷蒙迪棉、阿拉伯棉等10个种获得了体细胞胚，其中克劳茨基棉、阿拉伯棉、陆地棉、海岛棉、旱地棉、草棉和戴维逊氏棉获得了再生植株。张献龙等(1991)认为，材料的基因型对棉花体细胞胚胎发生与植株再生的影响是第一位的，激素类型及其使用浓度则是第二位的。目前，陆续有难再生的基因型棉种体细胞培养成功的报道(Mishraetal.,2003；Wuetal.,2004)。Sakhanokho等(2001)报道了海岛棉(Pima)植株再生。也有草棉(G.herbaceumL.)胚性愈伤组织产生的报道(Jayashankeretal.,1991a)，这是二倍体栽培种。Sun等(2003)得到野生棉G.klotzschianum再生植株，并按照这个培养过程，通过选择不同的激素组合，高盐离子胁迫，不同碳源组合等调控手段，先后观察了多个野生棉的体细胞胚胎发生，并且用悬浮培养和外界胁迫等方法得到多个野生 棉的再生植株(Sunetal.,2006)。在体细胞胚发生和植株再生能力上，陆地棉棉花品种间也存在着差异。Trolinderandxhixian(1988)对陆地棉28个品种进行了研究，结果表明只有珂字312和T25具有较高的体细胞胚发生能力，而其他品种较难或不能进行体细胞胚发生。棉花种质资源丰富，目前仅珂字棉、岱字棉、鲁棉、冀棉系列品种获得了体细胞胚和再生植株。虽然目前关于棉花再生的报道有几十例，但能够获得再生植株的基因型多数为生产上淘汰的老品种，主要是以珂子棉及其衍生材料，如泗棉三号等，直接利用的价值不大，以这些老品种为转化受体获得的转基因材料要通过杂交和多代回交，才能够在生产上利用，大大降低了转基因育种的利用价值，而且由于再生时间很长，体细胞变异很严重，再生植株中畸形苗比例增加，严重影响转化的效率。因此筛选再生能力强、容易重复且农艺性状优良的基因型，是开展转基因育种的重要条件。从2004年开始，华中农业大学棉花课题组先后对100多个份陆地棉，亚洲棉材料进行再生能力的比较，希望能够筛选到高体细胞胚胎发生能力基因型，为棉花转基因育种提供优良的遗传转化受体材料。经过努力筛选到一个再生能力极强的陆地棉材料YZ-1(Jinetal.,2006),目前这个材料已经被美国德州，德州农工大学，美国克莱门森大学，中国的河北大学，石河子大学，中国种子集团公司，大北农集团等大学、研究机构及种子企业引入，受到广泛好评。以YZ-1为转化受体发表的研究论文超过20篇，其中包括NatureCommunication,PlantPhysiologic,PlantJournal等国际知名杂志。YZ-1具有超鸡脚叶，无腺体，无棉酚等特点，转化周期短，成苗率极高，是棉花基础研究的理想模式材料。但因为YZ-1的农艺性状一般，转基因材料不能直接用于生产实践，无疑制约了这个材料的应用潜力。因此申请人近年把研究重点转移到另外一个陆地棉受体材料，前期的筛选发现豫668(又称Y668)再生能力也很强，要明显优于珂字棉和泗棉3号等材料，但仍然逊色于YZ-1.因此，申请人开始尝试另外一种研究策略提高Y668的再生及转化效率，并取得重要进展。Y668是近年才选育的棉花品种，产量高，纤维品质好，综合农艺性状优良,经过申请人多年的驯化培养，获得的J668材料，完全保留了母本Y668的优良农艺性状，同时显著地提高其再生能力，这一培育过程正是本发明的主要内容。本发明涉及一个棉花优良受体基因型的驯化，培育过程，通过多个基因的转化实验证明，该基因型具有转化效率高，再生植株体细胞变异小，转基因后代遗传稳定等优点。申请人认为利用本发明对提高棉花的遗传转化效率，缩短转基因材料进入育种体系的进程，对棉花转基因基础理论和实践应用都具有重要价值。技术实现要素：本发明的目的在于克服棉花现有遗传转化过程中存在的基因型老化、转化效率低，转化周期长等缺陷，提供一种提高棉花再生及转化效率的方法及应用。本发明通过组织培养以及遗传转化试验对不同的棉花品种再生能力先进行初筛，通过多次离体再生和杂交驯化方法培育出一个遗传转化效率高、再生频率好的棉花基因型材料，该棉花基因型材料是一种良好的转基因材料，申请人将这个基因型材料命名为Jin668，于2015年11月3日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCCNO：P201519，与该基因型材料Jin668与其原始亲本Y668相比，其转化再生效率提高了3倍，分化时间缩短了约20天。利用Jin668为转化受体，已将10个不同功能的的基因导入这个受体材料，并获得大量转基因T1代群体。转基因后代群体农艺性状好，可 以直接用于棉花杂交育种，从而大大缩短了转基因棉花育种的进程。本发明通过以下技术方案实施：一种提高棉花转基因受体材料的转化及再生能力的方法，其步骤包括：A、利用两种不同的激素组合(例如IBA+KT和2,4-D+KT)对棉花原植株的再生能力进行评估，测定包括愈伤诱导效率、愈伤增殖速度、愈伤质量以及愈伤分化时间和效率等，得到再生能力超过棉花组织培养模式材料-珂字棉的测试材料,将所得的材料入选后续的驯化试验；B、利用农杆菌介导的遗传转化方法转化棉花品种，获得T0转基因后代，使T0转基因植株自交获得T1代分离群体，选择T1群体中的阴性单株(利用GFP报告基因，同时结合PCR技术鉴定阴性植株)作为再生能力作为下一步驯化对象；C、对R0代阴性分离单株进行连续两次的再生试验，依次获得R1，R2群体，在R1,R2世代，以棉花品种Y668为对照，剔除农艺性状有变异的株系，在驯化的R1，R2群体中保留原始品种的典型农艺性状，通过R2群体自交得到保藏编号为CCTCCNO：P201519的转基因受体材料Jin668。本发明的应用技术路线如图1所示：本发明的特点主要是利用两种激素组合的诱导培养基(IBA+KT和2,4-D+KT)诱导愈伤组织及后续的体细胞胚发生，在此过程中考察愈伤组织的质地，增重速率，分化的频率，以及分化时间。以珂字棉310,312和泗棉三号作为对照，综合上述考核参数(表1)，筛选得到再生能力要高于珂字棉310、312和泗棉3号的优良基因型Y668。上述B步骤中的农杆菌介导的遗传转化方法是指：以绿色荧光蛋白GFP为报告基因(见图2)，通过农杆菌介导的遗传转化方法，获得转基因植株T0，具体步骤如下：(1)选择饱满、健康的Y668的棉花种子剥去种皮后，用0.1％的HgCl2浸泡10min，再用无菌水洗涤3次。接种于无菌苗萌发培养基上，在28℃黑暗条件下，于恒温箱中培养4-6d后,取无菌苗下胚轴切成0.5-0.8cm小段接种于0.5OD的用MGL活化培养基悬浮的农杆菌菌液中，侵染10mim后，用无菌滤纸吸干下胚轴表面的菌液，将下胚轴接种在含有共培培养基的培养皿中，21℃共培养数天，最后将下胚轴放入含有头孢霉素500mg/L的无菌水中，冲洗3遍,吸干表面水份后，接种到选择培养基中，每1个月继代1次。(2)将步骤(1)所得的愈伤组织转到分化培养基中，至产生体细胞胚胎及幼苗；(3)将步骤(2)所得的体细胞胚胎及幼苗转入到胚萌发及成苗培养基中至获得再生植株；(4)将步骤(3)所得的再生植株进行水培，驯化处理然后移栽到温室土钵中；(5)将步骤(4)获得的再生植株进行PCR和荧光检测鉴定，筛选获得阳性单株，通过使阳性泛珠自交获得分离群体，再通过荧光检测和PCR方法，鉴定出T1群体的中阴性分离单株，自交后获得R0群体。用于鉴定阳性植株的PCR的引物序列如下：GFP-正向引物：5-GTTCTCTGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3，GFP-反向引物：5-GATCTTCTCTTGGACAGCTCGTCCATGCCG-3。PCR反应程序：94℃预变性2min；94℃变性1min,63℃退火1min,72℃延伸1.5min，重复30循环；72℃延伸10min；4℃保存。其中：用于转基因植株的GFP荧光检测的步骤如下：分别从再生材料的不同组织，器官切取后，置于 体式荧光显微镜检测GFP基因的表达。体视荧光显微镜型号为LeicaMZ2500，滤光片为GFP2，激发光源为480nm波长的蓝光(结果见图3)。以获得的R0代群体为转化受体，通过连续组织培养对R0代群体再生2次：具体步骤如下：选择饱满、健康的R0植株的棉花种子剥去种皮后，用0.1％的HgCl2浸泡10min，再用无菌水洗涤3次。接种于无菌苗萌发培养基上，黑暗条件下，置于28℃恒温箱中培养4-6d,取无菌苗下胚轴切成0.5-0.8cm小段接种于愈伤诱导培养基中，每月继代一次，进行2-3次，所得的愈伤组织转到分化培养基中，至产生体细胞胚胎及幼苗，所得的体细胞胚胎及幼苗转入到胚萌发及成苗培养基中至获得再生植株。再生植株收获的种子命名了R1代，然后重复这一再生过程，获得R2群体。在R1,R2群体内对每个株系进行农艺性状考察，对保留有原始亲本主要农艺性状的株系予以保留，其余的予以淘汰，最终获得的R2群体基本保持了原始品种的农艺性状，但再生能力和转化效率得到极大驯化，经过对R2群体的再生能力和转化效率的鉴定，与亲本对照Y668相比，本发明的转化材料再生效率提高了3倍，分化时间缩短了约20天，综合再生性能和YZ-1品系相当(结果见图4)。上述培养中的各种培养基组分及配比如下所示：无菌苗萌发培养基：1/2MS大量元素，附加15g/L葡萄糖，2.5g/L的Phytagel。DK愈伤诱导培养基：MSB(MS培养基+B5培养基的维生素)，24-D0.1mg/L，KT0.1mg/L，3％Glucose，0.3％Phytagel。IK愈伤诱导培养基:MSB(MS培养基+B5培养基的维生素)，IBA0.5mg/L，KT0.1mg/L，3％Glucose，0.3％Phytagel。农杆菌活化培养基(简称MGL)：胰化蛋白胨5g/L，NaCl5g/L，MgSO4.7H2O0.1g/L，KH2PO40.25g/L，甘露醇5g/L，甘氨酸1.0g/L；pH值5.6。共培养培养基：MSB(MS培养基+B5培养基的维生素)，2，4-D0.1mg/l，KT0.1mg/l，50mg/lAS，3％Glucose，0.25％Phytagel，pH5.6。选择培养基：MSB(MS培养基+B5培养基的维生素)，2，4-D0.1mg/L，KT0.1mg/L，3％Glucose，0.3％Phytagel，卡那霉素50mg/L，头孢霉素400mg/L；pH5.9。分化培养基：MSB培养基中去掉NH4NO3,将KNO3用量加倍+Gln1.0g/L+Asn0.5g/L+IBA0.5mg/L+KT0.15mg/L+3％Glucose+0.25％Phytagel，pH5.9。胚萌发及成苗培养基：1/2MS无机盐+B5有机物，附加15g/L葡萄糖，2.5g/L的Phytagel。上述培养基在添加完各组分后，加蒸馏水定容至1L；在121℃高压蒸汽下灭菌15分钟。培养基中的抗生素采用过滤灭菌后，在超净工作台上的无菌环境下加入到冷却到60℃的高压灭菌后的培养基中使用。培养物的培养条件，除愈伤组织诱导阶段不需要光照外，其他阶段的培养条件为28±2℃，光照强度为135μmolm-2s-1，每天光照14h。本发明过多次再生驯化培育出一个遗传转化效率高、再生频率高的棉花基因型材料，申请人将这个基因型材料作为棉花转基因受体材料命名为Jin668，于2015年11月3日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCCNO：P201519。本发明的优点：本发明获得的的转基因棉花品系Jin668具有很好的农艺性状，作为转基因受体后，获得的转基因材料能够直接用于棉花育种实践，可以缩短育种周期2-3年。同时其转化效率和再生能力显著高于棉花目前组织培养所用的经典材料“珂字棉”和“泗棉3号”，对棉花转基因的技术的进一步推广应用具有重要意义，在本发明中，申请人已经成功地将多个抗虫基因，棉花种子营养品质改良基因通过农杆菌介导的遗传转化方法导入Jin668中。本发明通过转化-再生驯化的模式显著提高了受体材料的再生能力，对其它植物的组织培养和遗传转化研究也有重要的指导意义。附图说明图1：是本发明的预备试验及棉花再生能力比较的技术流程图。图2：是本发明构建的质粒载体pBINm-gfp5-ER图谱。图3：利用GFP报告基因转化棉花亲本Y668，获得转基因T1代植株的过程。附图标记说明：图3中的A图为Y668亲本下胚轴切段与农杆菌共培养，该农杆菌含有pBINm-gfp5-ER质粒(Jinetal.,2012)，质粒上有GFP报告基因；图3中的B图为侵染后的下胚轴切段在含有卡那霉素的培养基上培养；图3中C图为选择培养基上长出的抗性愈伤组织；图3中的D图为进入分化阶段的胚性愈伤组织，红圈中的为分化的体细胞胚；图3中的E-F图:三角瓶和钵子中移栽的转基因再生棉花；图3中的G图:转基因阳性和阴性植株的茎段的GFP荧光检测；图3中的H图:转基因阳性植株叶片的GFP检测；图3中的I图:转基因阴性和阳性植株的花蕾的GFP荧光检测。通过GFP荧光检测，在转基因GFP的T1群体中，分离得到阴性单株Null。图4：是Jin668的选育过程及Jin668不同世代再生效率比较图。以棉花亲本Y668为转化受体，通过农杆菌介导的遗传转化，将GFP报告基因导入到Y668中，获得T0代转基因植株，自交后获得T1代转基因分离群体。通过PCR及GFP荧光检测，分离阴性单株Null，作为新的转化受体，连续经过2次组织培养，获得再生植株，在每一世代的再生群体中，选择育性高，和亲本变型接近的单株，自交结实，用于下一次的组织培养。获得的R2代群体，选择优良单株自交繁殖，获得R3群体，即为Jin668(见图4中的A图)。图4中的B图是Y668亲本，Jin668早期世代Null,R1,R2以及长江流域组织培养的模式品种泗棉3号的组培再生效率的比较，结果显示Jin668早期世代的再生效率都显著高于其亲本材料Y668以及泗棉3号材料，充分说明本发明能够显著提高改良棉花的组织培养特性，通过多代驯化能够提高棉花材料的再生能力。图5：利用Jin668为转化受体，成功转入dsRNA:CAD基因。CAD基因为棉花棉酚代谢路径中的关键基因，通过表达该基因的dsRNA，形成RNA干涉导致CAD基因的表达下调，进而影响棉酚的合成，利用基因工程的方法获得低酚棉种质的目标。图5中的A图为PCR检测转基因植株；图5中的B图为Southern杂交检测转基因后代的T-DNA插入拷贝数。图5中的C图为转基因T2代群体种植于田间，从表型上看，转基因后代和受体亲本Jin668没有明显差异。图5中的D图为转基因植株中的棉酚含量，结果表明有多个株系中的棉酚含量要显著低于亲本对照。图6：以Jin668为受体获得转基因抗盲蝽象植株。附图标记说明：图6中的A图和6中的B图，分别是PCR和Southern杂交检测转基因后代的结果，说 明外源基因已经成功导入受体材料Jin668中。图6中的C图为转基因T1植株种植于试验田的图片，图片显示转基因后代与棉花亲本Jin668没有明显的表型差异。图7：以Jin668为受体，获得的转基因抗棉铃虫，红铃虫植株的结果。将Cry9C基因和PNZIP绿色启动子融合，成功转入受体材料Jin668中。附图标记说明：图7中的A图，图7中的B图分别为卡拉霉素筛选鉴定和PCR鉴定，上述结果表明外源基因已经成功导入到受体材料Jin668中。图7中的C图、图7中的D图分别为转基因叶片和棉铃的抗虫鉴定。图7中的C图表明，转基因叶片(图7中的C图右)对棉铃虫有明显抗性。图7中的D图表明，转基因棉铃(图7中的D图，右)对红铃虫有明显抗性。具体实施方式以下实施例定义了本发明，并描述了如何鉴定棉花的体细胞再生能力及如何实施棉花品种的再生驯化，进而提高再生能力的具体方法，并且提供了Jin668作为优良转基因受体的应用实例。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用不同的用途和条件。实施例1在离体培养条件下对棉花再生能力的初步评估试验为验证本发明的技术路线，对四个棉花品种Y668(河南省农科院经济作物研究所)、珂字棉312(华中农业大学棉花课题组)和YZ-1(中国农业科学院棉花研究所)和泗棉3号(华中农业大学棉花课题组)(这四个材料均为常规棉花品系材料，公众可以通过购买或者向相关单位索取获得)进行再生能力的比较(对照)，棉花体细胞胚胎发生过程及再生能力比较的技术流程如图1所示。步骤如下所示：(1)无菌苗的培育：将硫酸脱绒后的棉花种子剥掉种皮后浸泡于0.1％的升汞溶液中15min，再用无菌水冲洗4次以上，将灭菌后的棉种播种在在无菌苗萌发培养基上，暗培养3d后，置于光照培养室(光照强度135μmolm-2s-1，每天光照14h)培养2d后待用。(2)棉花体细胞胚胎发生和植株再生的培养体系的建立:取7d的棉花无菌苗下胚轴切成0.5-0.8cm小段接种于两种愈伤诱导培养基上(编号为IK愈伤诱导培养基,DK愈伤诱导培养基)愈伤组织，25d后用相同的新鲜的愈伤诱导培养基继代1次，最后转入分化培养基，连续继代(用相同的新鲜分化培养基继代)，每代25d，至愈伤组织发生胚分化时，把胚性愈伤组织转入胚成熟培养基中完成体细胞胚的发育成熟，接着把发育成熟的子叶胚转入胚萌发和生根培养基上，促进小苗生根。(3)愈伤秤重、形态及细胞学压片观察挑取不同发育阶段的愈伤组织直接在倒置显微镜(LeikaDM2500)下观察，或用液体分化培养基稀释后观察，CCD照相。并统计各种体细胞胚数量和比例。愈伤组织中随机取样5次，每次统计3个视野。在愈伤生长的30d秤重，计算单个愈伤重量，所有外植体均秤重，计算平均值。同时考察两种培养条件不同基因型愈伤增殖量、质地、颜色、分化时间及分化频率。研究结果表明，在愈伤组织诱导能力，分化效率，再生时间等关键指标上，Y668要优于棉花组织培养的经典模式材料C312和C201，也优于泗棉3号再生能力，和YZ-1相比要稍微差一些(见表1)。表1不同棉花品种再生能力比较实施例2：以Y668为转化受体，农杆菌介导的GFP遗传转化农杆菌菌株EHA105及质粒载体pBINm-gfp5-ER(见Jinetal.,2012)用于棉花的遗传转化，该质粒的T-DNA结构图见图2。农杆菌转化棉花下胚轴的程序如下：挑选饱满、健康的棉花种子剥去种皮后，用0.1％的HgCl2浸泡10min，再用无菌水洗涤3次。将所得的灭菌的棉花下胚轴接种于无菌苗萌发培养基上，在黑暗条件下，于28℃恒温箱中培养4-6d,取无菌苗下胚轴切成0.5-0.8cm小段，接种于0.5OD的用MGL悬浮的农杆菌菌液中，侵染10mim后，用无菌滤纸吸干下胚轴表面的菌液，将下胚轴接种在含有共培培养基的培养皿中，21℃共培养48h，最后将下胚轴放入含有头孢霉素500mg/L的无菌水中，冲洗3遍,吸干表面水份后，接种到选择培养基中，每1个月继代1次，直到获得胚性愈伤及体细胞胚胎发生。分别取转基因植株的不同组织、器官利用体式荧光显微镜检测GFP基因的瞬时表达。体视荧光显微镜型号为LeicaMZ2500，滤光片为GFP2，激发光源为480nm波长的蓝光。利用GFP荧光检测结合PCR检测结果，在T1代分离群体中，分离出GFP阴性分离单株，即命名为Null分离株用于后续的再生能力驯化试验(图2)。实施例3Jin668的选育过程及Jin668不同世代转化再生效率比较以Null植株自交收获的种子，作为再生能力驯化的目标。挑选饱满、健康的棉花种子剥去种皮后，用0.1％的HgCl2浸泡10min，再用无菌水洗涤3次。接种于无菌苗萌发培养基上，黑暗条件下，置于28℃恒温箱中培养4-6d,取无菌苗下胚轴切成0.5-0.8cm小段接种于愈伤诱导培养基上(MSB+2,4-D0.1mg/L+KT0.1mg/L+3％Glucose+0.25％Phytagel，pH5.9)，每隔1个月继代一次，直到获得胚性愈伤组织(或体细胞胚胎)。然后将胚性愈伤组织或者体细胞胚转入分化培养基中,直到获得再生的幼苗。将获得的幼苗转入到胚萌发及成苗培养基中(1/2MS无机盐+B5有机物+1.5％Glucose+0.25％Phytagel，pH5.9)，直到苗子移栽到土钵中。由Rull再生获得的植株群体即为R1群体。以亲本Y668为对照，对 R1群体的农艺性状(特别是结实率)进行考核，农艺性状变异小，结实率高的，自交繁种，用于下一次的再生实验。第二次再生试验步骤和Null的再生试验一致，从而获得R2群体，对R2群体进行农艺性状考察，对具有亲本典型性状的单株，进行自交从而获得Jin668(图3中的A图)。为了比较Jin668不同世代如Null,R1,R2和亲本Y668转化、再生效率，以GFP为报告基因，每个材料选择100段下胚轴做转化、再生实验(再生过程和前述Null的再生过程完全一致)，继代三次后(3个月)，统计分化的下胚轴数目，计算下胚轴的分化效率(分化的下胚轴/接种的下胚轴总数*100％)。本实验重复三次(见图3B)。实施例4：以Jin668为转基因受体，获得棉酚含量减低的转基因植株Gh_A13G1207(cad-a)基因(申请人克隆的基因)是棉花棉酚合成路径中的关键基因，通过构建该基因的RNAi载体(见图4中的A图)(载体构建方法参考论文Tianetal.,2015)，通过农杆菌介导的遗传转化(转化过程和实施例3中的过程一致)，将该载体导入到受体材料Jin668。PCR及Southern杂交检测结果表明，外源基因已经成功导入到棉花受体Jin668中(见图4中的B图,图4中的C图)，将转基因后代T1群体移栽到大田中(图4中的D图),农艺性状考察结果表明经过多次组织培养，再生后的Jin668与其亲本在植株表型上没有明显差异。转基因后代群体中，经棉酚含量测定发现，有多个转基因株系叶片及种子中棉酚含量显著减低(图4中的E图)。实施例5：利用Jin668为转化受体，成功转入dsRNA:FAR基因申请人利用Jin668为转化受体，成功转入dsRNA:FAR基因。发现FAR基因(Luoetal.,2014))与盲蝽象性别分化相关，通过转基因表达FAR基因的dsRNA,当害虫取食含有dsRNA的棉花叶片后，FAR基因可能会沉默。FAR基因是棉花主要害虫盲蝽象性别分化的关键基因，在雌性虫子中表达量很高，如果这个基因被沉默，可能会影响虫子种群的分化，进而导致害虫发育、交配行为发生紊乱，最终实现控制害虫的目的。申请人利用农杆菌介导的遗传转化，将能够表达FAR基因的双链小RNA(dsRNA)的dsRNA:FAR载体成功导入到受体材料Jin668中，PCR及Southern杂交检测结果表明，外源基因己经成功转到受体材料基因组中(见图5中的A图,图5中的B图)。田间的网室接虫鉴定结果表明，转dsRNA:FAR基因的，棉花材料对盲蝽象抗性增强(图5中的C图)。实施例6：以Jin668为受体，获得的转基因抗棉铃虫，红铃虫植株申请人从裂叶牵牛中扩增出PnZip基因的启动子(登录号:AF373414.1)，该启动子是来源于牵牛属中的一种绿色组织特异性启动子与目的基因Cry9C(Guoetal.,2006)融合，通过农杆菌介导的遗传转化方法将pPnZip::Cry9C载体(见图7中的A图))，导入到棉花受体材料Jin668中(见图7中的B,C图)。对2个pPnZip::Cry9C转基因株系和1个p35S::Cry9C株系进行了ELISA蛋白检测及喂虫实验(Lietal.,2014)。在p35S::Cry9C转基因株系的各种组织中，每克转基因棉株鲜重组织的Cry9C蛋白量在24.6μg到45.5μg的范围内波动。在pPnZip::Cry9C转基因株系的绿色组织中，如叶片、铃壳及苞叶，申请人检测到 每克鲜重组织中Cry9C蛋白量分别高达50.2μg、39.7μg和48.3μg。然而，在pPnZip::Cry9C转基因株系PZ1.3的种子中，Cry9C蛋白量仅为0.26μg，相比p35S::Cry9C株系的种子，低了近百倍。此外喂虫实验也表明，pPnZip::Cry9C转基因植株对棉铃虫、红铃虫有很强的抗性(见图7中的D,E图)。综上所述，PnZip启动子能使Bt蛋白在绿色组织中高效表达，而在非绿色组织中表达量很低或不表达。这将有利于减轻公众对转基因食品安全性的担忧，同时也表明PnZip启动子是一种经济的、环境友好型的启动子，在未来的生物技术研究中将发挥重要的作用。参考文献：1.张献龙，孙济中.陆地棉体细胞胚胎发生与植株再生.遗传学报，1991，18(5)：461-4672.董合忠.不同基因型棉花下胚轴离体培养胚状体发生的研究.莱阳农学院学报，1991，97-1013.JinSX,liuGZ,ZhuHG,YangXYandZhangXL.TransformationofUplandCotton(GossypiumhirsutumL.)withgfpGeneasaVisualMarker.JournalofIntegrativeAgriculture,2012,11(6):910-9194.ShuangxiaJin,XianlongZhang(2005)FactorsaffectingstabletransformationandplantregenerationduringtransformingembryogeniccallusofUplandcotton(GossypiumhirsutumL.)viaAgrobacteriumtumefaciens,PlantCell,TissueandOrganCulture,81(2):229-2375.SunYQ,ZhangXL,JinSX,LiangSG,NieYC.Somaticembryogenesisandplantregenerationinwildcotton(GossypiumklotzschianumAnderss).PlantCellTissOrganCult,2003,75:247-2536.WuJH,ZhangXL,NieYC,JinSX,LiangSG.FactorsaffectingsomaticembryogenesisandplantregenerationfromarangeofrecalcitrantgenetypesofChinesecotton.InvitroCellDevBiol-Plant,2004,40:371-3757.ShuangxiaJin,XianlongZhang,etal,Identificationofanovelelitegenotypeforinvitrocultureandgenetictransformationofcotton.BiologiaPlantarum,200650(4):519-524.(SCI)8.TrolinderNL,GoodinJR.SomaticembryogenesisandplantregenerationinGossypiumhirsutumL.PlantCellRep,1987,6:231-2349.MishraR,WangHY,YadavNR,WilkinsTA.DevelopmentofhighlyregenerableeliteAcalacotton(Gossypiumhirsutumcv.Maxxa)-asteptowardsgenotype-independentregeneration.PlantCellTissOrganCult,2003,73:21-3510.SakhanokhoHF,ZiptA,RajasekaranK,SahaS,SharmaGC.Inductionofhighlyembryogeniccalliandplantregenerationinupland(GossypiumhirsutumL.)andPima(GossypiumbarbadenseL.)cottons.CropSci,2001,41:1235-124011.LuoJ,LiuXY,LiuLetal.DenovoanalysisoftheAdelphocorissuturalisJakovlevmetathoracicscentglandstranscriptomeandexpressionpatternsofpheromonebiosynthesis-relatedgenes.2014,Gene,551,271-278.12.GuoX,JinS,ZhangX.Agrobacterium-mediatedtransformationofCry1C,Cry2AandCry9CgenesintoGossypiumhirsutumandplantregeneration.BiologiaPlantarum,2007,51(2):242-24813.LiLebin,ZhuY,JinSX,ZhangXL.PyramidingBtgenesforincreasingresistanceofcottontotwomajorlepidopteranPests:SpodopteralituraandHeliothisarmigera.ActaPhysiologiaePlantarum，2014,36(10), 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