本发明属于海洋生物医药技术领域，具体涉及一种肉芝软珊瑚提取物的生物活性SRB测定方法。
背景技术：
肉芝软珊瑚(Sarcophyton sp.)，分类学上属腔肠动物门(Cnidaria)，珊瑚虫纲(Anthozoa)，软珊瑚目动物(Alcyonacea)，软珊瑚科(Alcyoniidae)，肉芝软珊瑚属(Sarcophyton)动物，是一种在热带与亚热带比较常见的海洋生物。肉芝软珊瑚颜色多种，包括褐色、绿色或棕色，带有白色或金色的水螅体，随着生长会长出褶皱。珊瑚体呈平铺的盆形，群体肥厚，中央凹入，表面常具有略呈辐射状的脊，脊宽约1至3公分；群体的柱部低矮、粗大。
全球有肉芝软珊瑚约41种，到目前为止，国内外研究者已对该属的17个种开展了化学成分研究。该属的化学成分主要有萜类(包括倍半萜、二萜、三萜、四萜，尤其以西松烷二萜居多)、甾醇(尤其以多羟基甾醇居多)、糖苷类、前列腺素、神经酰胺、吡啶衍生物及脂肪酸等化合物。这其中不乏许多结构新颖、生理活性显著的化学成分，因此我们选择南海肉芝软珊瑚(Sarcophyton sp.)进行化学成分及其生物活性的研究。
技术实现要素：
本发明旨在为肉芝软珊瑚的提取物提供一种方便可靠的生物活性测定方法。
一种肉芝软珊瑚提取物的生物活性SRB测定方法，步骤如下：
(1)取对数期的肿瘤细胞，用新鲜的RPMI-1640培养基调整细胞悬液的浓度为2×105个/ml，每孔200μL加入96孔板中，每孔加入不同浓度的样品溶液2μL；
(2)37ºC培养17h；
(3)离心3min(4ºC、3000prm)，吸去上清；
(4)每孔加入50μL预冷的80%TCA溶液，移入4ºC冰箱中固定1.5h，再用去离子水冲洗5次，室温晾干；
(5)每孔加入0.5%SRB染液(1%的TCA溶液)50μL，室温静置30min后，用预冷的1%TCA水溶液冲洗4次，去除未结合的染料，室温晾干；
(6)每孔加入150μL非缓冲Tris溶液溶解(10mM，pH=10.5)与蛋白结合的染料，用酶标仪在520nm下测定每孔吸光度OD值。在96孔板中每个样品浓度设3孔，另设空白对照3孔，取3孔平均值，按公式IR(%)=(OD空白-OD样品)/OD空白×100%计算细胞增殖抑制率(IR%)，再利用Bliss方法由各种浓度的IR求出半数抑制浓度(IC50)的标准差和平均值。
本发明的测定原理：磺酰罗丹明B(SulforhodamineB，SRB)比色法，主要用来检测细胞增殖情况。SRB是一种粉红色阴离子染料，易溶于水，在酸性条件下可特异性地与细胞内组成蛋白质的碱性氨基酸结合；在520nm波长下产生吸收峰，吸光值与细胞量成线性正相关，故可用作细胞数的定量检测。
本发明的测定方法相对于现有技术简单快速、而且检测结果可靠，适于推广应用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
选择HeLa肿瘤细胞株用SRB法对从肉芝软珊瑚分离得到的多羟基甾醇SAR 1 - SAR 11进行体外抗肿瘤活性筛选，包括如下步骤：
(1)取对数期的肿瘤细胞，用新鲜的RPMI-1640培养基调整细胞悬液的浓度为2×105个/ml，每孔200μL加入96孔板中，每孔加入不同浓度的样品溶液2μL；
(2)37ºC培养17h；
(3)离心3min(4ºC、3000prm)，吸去上清；
(4)每孔加入50μL预冷的80%TCA溶液，移入4ºC冰箱中固定1.5h，再用去离子水冲洗5次，室温晾干；
(5)每孔加入0.5%SRB染液(1%的TCA溶液)50μL，室温静置30min后，用预冷的1%TCA水溶液冲洗4次，去除未结合的染料，室温晾干；
(6)每孔加入150μL非缓冲Tris溶液溶解(10mM，pH=10.5)与蛋白结合的染料，用酶标仪在520nm下测定每孔吸光度OD值。在96孔板中每个样品浓度设3孔，另设空白对照3孔，取3孔平均值，按公式IR(%)=(OD空白-OD样品)/OD空白×100%计算细胞增殖抑制率(IR%)，再利用Bliss方法由各种浓度的IR求出半数抑制浓度(IC50)的标准差和平均值。
测定结果见表1，分析表中数据可以看出在浓度为50μM浓度水平，化合物SAR 3、6、9对HeLa细胞表现出较强的细胞毒活性，SAR1、2、7表现出中等的细胞毒活性，其中化合物SAR4、10对HeLa细胞无抑制活性。
表1 多羟基甾醇化合物 SAR 1-SAR 11 对Hela肿瘤细胞株的抑制率(%)