用于增加植物生长和产量的方法和组合物与流程

文档序号:11109518阅读:521来源:国知局
本发明涉及用于控制参与植物生长和发育的基因表达的方法和组合物。发明背景持续增加的世界人口和日渐减少的农业可耕种土地供应推动开发具有增加的生物质和产量的植物。常规农作物和园艺改进手段采用选择性育种技术来鉴定具有所需特性的植物。然而,这种选择性育种技术具有几个缺陷,即,这些技术一般是费力的并且产生通常含有异源遗传组件的植物,其可能并不总是导致所需的性状从亲本植物传递下去。分子生物学的进展提供了调节植物种质的手段。植物遗传改造要求分离和操作遗传物质(一般是DNA或RNA的形式)并且随后向植物导入该遗传物质。这种技术具有向作物或植物递送各种改善的经济、农业或园艺性状的能力。感兴趣性状包括植物生物质和产量以及对非生物胁迫条件的耐受性。产量通常定义为可测量的来自作物的有经济价值的产物。这可以量和/或质来定义。产量直接取决于几个因素,例如,器官的数量和尺寸、植物结构(例如,分枝数量)、种子产生、叶衰老等。根发育、营养摄入、胁迫耐受性和早期活力也可能是决定产量的重要因素。因此,优化上述因素可产生增加的植物产量。植物遇到的非生物胁迫可包括高或低温度胁迫、干旱或浇水过度和盐胁迫。植物对于这些和其他非生物胁迫的响应可能对产量有重要影响,因为这些胁迫可导致产量显著降低。因此需要产生面对非生物胁迫时保持其生长以最大化其在非优化生长条件下的产量的植物和植物变体。种子产量的增加是特别重要的性状,因为许多植物的种子对于人和动物消耗而言是重要的。作物例如玉米、水稻、小麦、油菜和大豆占总人热量摄入的超过一般,无论是通过直接消耗其种子或通过消耗在经加工的种子上产生的肉制品。它们也是工业过程中使用的糖类、油脂和许多类型矿物质的来源。种子含有胚(新芽和根的来源)和胚乳(在萌发期间和幼苗的早期生长期间胚生长的营养源)。种子的发育涉及许多基因,并且需要将代谢物从根、叶和茎转移到生长的种子中。尤其是胚乳,其吸收了糖类、油脂和蛋白质的代谢前体并将它们合成储存大分子以填充谷粒。植物生物质的增加对于饲料作物如苜蓿、青贮玉米和干草而言重要。许多基因参与植物生长和发育。因此,需要调节这些基因的方法。技术实现要素:提供了用于获得更高的作物产量而增加植物生长的方法和组合物。组合物包含转录因子,包含转录因子的构建体,和含有转录因子的转基因植物、种子和植物部分。可使用转录因子通过调节感兴趣植物中一种或多种转录因子的表达水平和/或表达模式来改变植物生长和/或胁迫耐受性。可调节调控参与植物生长、光合作用的基因或其他基因的转录因子来增加植物生长、增加植物质量、改善植物胁迫耐受性、并且增加植物产量。本发明的实施方式包括:1.一种通过改变或调节编码选自下组的多肽或其片段或变体的至少一种核苷酸序列的表达来改善感兴趣植物中的植物生长的方法:SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、21、23、27、29、31、33、35、37、39、43、45、47、49、或51。2.如实施方式1所述的方法,其中所述核苷酸序列编码选自下组的多肽或其片段或变体:SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、或16。3.如实施方式1所述的方法,其中至少一种核苷酸序列上调,使得TF的表达相对于对照植物细胞增加。4.如实施方式1所述的方法,其中至少一种核苷酸序列下调,使得TF的表达相对于对照植物细胞减少。5.如实施方式1、2、3或4所述的方法,其中所述调节通过稳定插入至少一种表达构建体来实现,所述表达构建体包含驱动在植物细胞中表达的启动子,所述启动子可操作地连接至编码至少一种转录因子的至少一种核苷酸序列,其中所述转录因子包含选自下组的多肽:SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、21、23、27、29、31、33、35、37、39、43、45、47、49、或51。6.如实施方式1或2中任一项所述的方法,其中所述片段或变体与所述核苷酸序列或所述多肽序列具有至少80%的序列相同性。7.如实施方式1或2中任一项所述的方法,其中所述片段或变体与所述核苷酸序列或所述多肽序列具有至少90%的序列相同性。8.如实施方式1或2中任一项所述的方法,其中所述片段或变体与所述核苷酸序列或所述多肽序列具有至少95%的序列相同性。9.如实施方式1-4中任一项所述的方法,其中所述调节通过稳定插入DNA构建体来实现,所述DNA构建体包含驱动在植物细胞中表达的至少一个启动子,所述启动子可操作地连接至针对编码选自下组的转录因子多肽的至少一种核苷酸设计的一个或多个amiRNA盒:SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、21、23、27、29、31、33、35、37、39、43、45、47、49、或51。10.如实施方式1-4中任一项所述的方法,其中所述调节是通过稳定插入转化构建体来实现,所述转化构建体包含一个或多个在植物细胞中可操作的启动子,所述启动子可操作地连接至针对至少一种感兴趣转录因子设计的一个或多个RNAi盒。11.如实施方式1-4中任一项所述的方法,其特征在于,所述调节通过用衍生自植物病毒并包含在植物细胞中可操作的至少一个启动子的自复制转化构建体来转化感兴趣植物物种来实现,所述启动子可操作地连接至编码至少一种转录因子的至少一个开放阅读框。12.如实施方式1-4中任一项所述的方法,其特征在于,所述调节通过用衍生自植物病毒并包含在植物细胞中可操作的至少一个启动子的自复制转化构建体来转化感兴趣植物物种来实现,所述启动子可操作地连接至针对至少一种感兴趣转录因子设计的至少一个amiRNA盒。13.如实施方式1-4中任一项所述的方法,其特征在于,所述调节通过用衍生自植物病毒并包含在植物细胞中可操作的至少一个启动子的自复制转化构建体来转化感兴趣植物物种来实现,所述启动子可操作地连接至针对至少一种感兴趣转录因子设计的至少一个RNAi盒。14.如实施方式1-4中任一项所述的方法,其特征在于,所述调节通过将至少一个顺式调节元件在一定位置插入植物细胞的基因组来实现,使得所述顺式调节元件可改变至少一种感兴趣转录因子的表达水平和/或表达概况。15.如实施方式9-13中任一项所述的方法,其中所述至少一个启动子是组成型启动子。16.如实施方式9-13中任一项所述的方法,其中所述至少一个启动子是非组成型启动子。17.如实施方式16所述的方法,其中所述至少一个启动子是发育调节的启动子。18.如实施方式16所述的方法,其中所述至少一个启动子是昼夜节律调节或昼调节的启动子。19.如实施方式16所述的方法,其中所述至少一个启动子是组织特异性启动子。20.如实施方式16所述的方法,其中所述至少一个启动子是诱导型启动子。21.如实施方式16所述的方法,其中所述至少一个启动子是光调节的启动子。22.如实施方式16所述的方法,其中所述至少一个启动子包含SEQIDNO:17所示的序列。23.如实施方式16所述的方法,其中所述至少一个启动子包含SEQIDNO:18所示的序列。24.如实施方式16所述的方法,其中所述至少一个启动子包含SEQIDNO:19所示的序列。25.如实施方式1-24中任一项所述的方法,其中所述感兴趣植物是单子叶植物。26.如实施方式1-24中任一项所述的方法,其中所述感兴趣植物是双子叶植物。27.一种分离的多核苷酸,所述多核苷酸包含编码转录因子的核苷酸序列,与SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、21、23、27、29、31、33、35、37、39、43、45、47、49、或51所示的氨基酸序列有至少90%序列相同性。28.如实施方式27所述的分离的多核苷酸,其中所述多肽与SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、21、23、27、29、31、33、35、37、39、43、45、47、49、或51所示的氨基酸序列有至少95%序列相同性。29.如实施方式1所述的方法,其特征在于,所述改善植物生长包括向所述感兴趣植物提供对高pH条件的耐受性。30.如实施方式29所述的方法,其特征在于,所述植物可耐受超过8的pH。31.如实施方式29所述的方法,其特征在于,所述植物可耐受超过8.5的pH。32.如实施方式29所述的方法,其特征在于,所述植物可耐受超过9的pH。33.如实施方式29所述的方法,其特征在于,所述植物可耐受超过9.5的pH。34.如实施方式1所述的方法,其特征在于,所述改善植物生长包括向所述感兴趣植物提供对高盐条件的耐受性。35.如实施方式34所述的方法,其特征在于,所述高盐条件包括超过50ppm的Na+浓度。36.如实施方式34所述的方法,其特征在于,所述高盐条件包括超过55ppm的Na+浓度。37.如实施方式34所述的方法,其特征在于,所述高盐条件包括超过60ppm的Na+浓度。38.如实施方式34所述的方法,其特征在于,所述高盐条件包括超过90ppm的SO42-浓度。39.如实施方式34所述的方法,其特征在于,所述高盐条件包括超过100ppm的SO42-浓度。40.如实施方式34所述的方法,其特征在于,所述高盐条件包括超过110ppm的SO42-浓度。41.如实施方式34所述的方法,其特征在于,所述高盐条件包括超过120ppm的SO42-浓度。42.如实施方式34所述的方法,其特征在于,所述高盐条件包括超过130ppm的SO42-浓度。43.如实施方式34所述的方法,其特征在于,所述高盐条件包括超过140ppm的SO42-浓度。44.如实施方式34所述的方法,其特征在于,所述高盐条件包括超过150ppm的SO42-浓度。45.如实施方式34所述的方法,其特征在于,所述高盐条件包括超过20ppm的Cl-浓度。46.如实施方式34所述的方法,其特征在于,所述高盐条件包括超过50ppm的Na+浓度、超过90ppm的SO42-浓度、和超过20ppm的Cl-浓度。发明详述增加作物植物生长以获得更高产量是植物育种和植物生物技术的主要目标。作为一种极复杂的性状,产量潜力通过正反馈和负反馈同时控制,并且通过多个代谢通路中的许多不同基因调节。因此,这种性状的成功操作需要同时操作许多不同基因的表达。同时操作许多基因的表达的理想方法是改变调节与感兴趣性状(即,升高的作物生长和产量)相关的多个基因的表达的一个或多个转录因子(TF)的表达。本发明描述了改变植物中TF表达的方法,其导致改善的植物生长和产量。提供了编码TF的重组核苷酸序列。描述了改变所述TF的表达水平和/或概况以改善植物生长的方法。另外,提供了已经修饰以调节至少一种本发明的TF的表达的植物、种子和植物部分。“产量”或“作物产量”是每单位耕地面积收获的作物的量的量度。作物产量是通常用于谷物或谷类的量度,并且通常测量为给定时间内单位面积收获的植物的量,即吨/公顷或千克/公顷的度量。作物产量也指由植物产生或生成的实际种子或生物质。“耐受”或“耐受性”是指植物在特定组的环境条件下生长的能力,该环境条件一般被视为不利于植物生长,并且对照植物在该环境条件下无法正常生长。当在这类环境条件下生长时,耐受植物可相对于对照植物显示出改善的产量。“重组多核苷酸”包含两个或更多个化学连接的核酸区段的组合,未发现这些区段在自然中直接接合。“直接接合”指2个核酸区段紧邻并且通过化学键互相连接。在具体实施方式中,重组多核苷酸包含感兴趣多核苷酸或其活性变体或片段,使得其他化学连接的核酸区段位于感兴趣多核苷酸的5’、3’或内部。或者,可通过删除序列来形成重组多核苷酸的化学连接的核酸区段。其他化学连接的核酸区段或删除以接合连接的核酸区段的序列可以是任意长度,包括,例如,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多核苷酸。本文公开了用于制备这种重组多核苷酸的各种方法,例如,通过化学合成或通过遗传工程技术对多核苷酸的分离区段进行操作。在具体实施方式中,重组多核苷酸可包含重组DNA序列或重组RNA序列。“重组多核苷酸的片段”包含两个或更多个化学连接的氨基酸区段的组合中的至少一个,未发现这些区段在自然中直接接合。“重组多核苷酸构建体”包含两个或更多个可操作连接的核酸区段,未发现这些区段在自然中可操作连接。重组多核苷酸构建体的非限制性示例包括可操作连接至异源序列的感兴趣多核苷酸或其活性变体或片段,该异源序列辅助感兴趣序列的表达、自体复制和/或基因组插入。这类异源且可操作连接的序列包括,例如,启动子、终止序列、增强子等,或表达盒的任意组分;质粒、粘粒、病毒、自体复制序列、噬菌体、或者线性或环状单链或双链DNA或RNA核苷酸序列;和/或编码异源多肽的序列。“重组多肽”包含两个或更多个化学连接的氨基酸区段的组合,未发现这些区段在自然中直接接合。在具体实施方式中,重组多肽包含额外的化学连接的氨基酸区段,其位于重组多肽的N-端、C-端或内部。或者,可通过删除至少一个氨基酸来形成重组多肽的化学连接的氨基酸区段。其他化学连接的氨基酸区段或删除的化学连接的氨基酸区段的序列可以是任意长度,包括,例如,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多氨基酸。本发明包括合成寡核苷酸或核苷酸序列。合成序列是在实验室条件中产生或再生成的序列。虽然,核苷酸序列可具有相对于母序列改变的核苷酸序列,合成序列可与天然产生的序列相同。然而,在两种情况中,合成序列的结构改变或者与从其自然条件中直接分离的序列中所见的不同。“改变”或“调节”TF的表达是指表达相对于野生型或对照植物中所述TF的表达水平上调或下调。认识到在一些情况中,通过增加一种或多种本发明的TF的表达水平(即上调表达)来增加植物生长和产量。类似地,在一些情况中,通过降低一种或多种本发明的TF的表达水平,即下调表达来增加植物生长和产量。因此,本发明包括上调或下调一种或多种本发明的TF。另外,该方法包括在感兴趣植物中上调至少一种TF并下调至少一种TF。调节转基因植物中本发明的TF中的至少一种的浓度和/或活性是指相对于天然对照植物、植物部分或没有导入本发明序列的细胞,浓度和/或活性增加或降低至少1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、或90%。认识到可通过选择本发明的启动子或使用本发明的增强子来控制TF的表达水平。例如,如果需要30%增加,可选择启动子来提供合适的表达水平。例如,可通过测定植物中TF的水平来直接测量TF的表达水平。使用本发明的组合物来改变植物中感兴趣基因,尤其是参与光合作用的基因的表达。因此,可与对照植物相比调节TF的表达。“对象植物或植物细胞”是其中已经实现感兴趣基因的遗传改变如转化,或者是源自如此改变的植物或细胞并包含改变的植物或植物细胞。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供了测量对象植物或植物细胞的表型变化的参照点。因此,根据本发明的方法,表达水平高于或低于对照植物中的表达水平。一种对照植物或植物细胞可包含,例如:(a)野生型植物或细胞,即具有与用于产生对象植物或细胞的遗传改变的起始材料相同的基因型;(b)与起始材料有相同基因型的植物或植物细胞,但其已经用无效构建体(即,用对感兴趣性状没有已知影响的构建体,如包含标记基因的构建体)转化;(c)植物或植物细胞,其是对象植物或植物细胞的后代中的非转化分离体;(d)与对象植物或植物细胞在遗传上相同但没有接触会诱导感兴趣基因表达的条件或刺激的植物或植物细胞;或(e)在不表达感兴趣基因的条件下的对象植物或植物细胞本身。虽然本发明以转化的植物描述,应认识到本发明的转化的生物体可包括植物细胞、植物原生质体、植物可再生的植物组织培养物、植物愈伤组织、植物块、和在植物或植物部分中完整的植物细胞如胚胎、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝条、果实、仁、谷穗、穗轴、外壳、柄、根、根尖、花粉囊、种子等。谷粒是指由种植户处于生长或繁殖物种以外的目的产生的成熟种子。再生植物的后代、变体和突变体也包括在本发明的范围内,只要这些部分包含导入的多核苷酸。本发明包括分离的或基本纯化的转录因子或增强子多核苷酸或氨基酸组合物。“分离的”或“纯化的”多核苷酸或蛋白或其生物活性部分基本或本质上不含其天然产生环境中通常伴随多核苷酸或蛋白或与之相互作用的组分。因此,通过重组技术产生时,分离或纯化的多核苷酸或蛋白基本不含其它细胞物质或培养基,或者通过化学方法合成时基本不含化学物质前体或其他化学物质。任选地,“分离的”多核苷酸不含该多核苷酸源自的生物体基因组DNA中天然侧接所述多核苷酸(即位于多核苷酸5′和3′末端处的序列)的序列(任选蛋白编码序列)。本发明也包括本文公开的多核苷酸和由其编码的氨基酸序列的片段和变体。“片段”是指多核苷酸的部分或氨基酸序列的部分。“变体”是指基本相似的序列。对于多核苷酸,变体包括具有以下的多核苷酸:在5′和/或3′端处的删除(即,截短);在天然多核苷酸中一个或多个内部位点处的删除和/或添加;和/或在天然多核苷酸中一个或多个位点处一个或多个核苷酸的取代。本文所用的“天然”多核苷酸或多肽分别包含天然产生的核苷酸序列或氨基酸序列。一般而言,本发明的特定多核苷酸的变体将与由本文他处所述的序列比对程序和参数确定的特定核苷酸有至少约75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大的序列相同性。“变体”氨基酸或蛋白是指通过在天然蛋白质的N-末端和/或C-末端处删除(也称为截短)一个或多个氨基酸;在天然蛋白质的一个或多个内部位点处删除和/或添加一个或多个氨基酸;或在天然蛋白质的一个或多个位点处取代一个或多个氨基酸衍生的氨基酸或蛋白质。本发明包括的变体蛋白质有生物活性,即它们继续具有天然TF或增强子的所需生物活性。本发明的天然TF或增强子序列的生物活性变体将与由本文所述的序列比对程序和参数确定的天然蛋白质的氨基酸序列有至少约80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大的序列相同性。本发明的蛋白质的生物活性变体与该蛋白质可相差少至1-15个氨基酸残基,少至1-10个,如6-10个,少至4、3、2或甚至1个氨基酸残基。如图所示,本发明的TF因子在感兴趣植物中调整,即上调或下调。可能需要上调至少一种TF,同时下调至少一种不同的TF。增加表达或上调TF的方法是本领域已知的并且可用于本发明的方法中。在一个实施方式中,可通过用包含可操作地连接至至少一种本发明的TF的在植物中驱动表达的启动子的表达盒来稳定或瞬时转化植物或植物细胞以实现上调。可通过使用精确基因组编辑技术来实现一种或多种本发明的TF的表达以调节内源性TF序列的表达。通过这种方式,通过使用本领域已知的方法将核酸插入编码感兴趣TF的天然植物序列附近。这类方法包括但不限于针对感兴趣植物基因组序列设计的大范围核酸酶(D’Halluin等,(2013)PlantBiotechnolJ11:933-941);CRISPR-Cas9,TALEN,和其他精确编辑基因组的技术(Feng等,(2013)CellResearch23:1229-1232,Podevin等,(2013)TrendsBiotechnology31:375-383,Wei等,(2013)JGenGenomics40:281-289,Zhang等,(2013)WO2013/026740);Cre-lox位点-特异性重组(Dale等,(1995)PlantJ7:649-659;Lyznik等,(2007)TransgenicPlantJ1:1-9;FLP-FRT重组(Li等,(2009)PlantPhysiol151:1087-1095);Bxb1-介导的整合(Yau等,PlantJ(2011)701:147-166);锌指介导的整合(Wright等,(2005)PlantJ44:693-705);Cai等,(2009)PlantMolBiol69:699-709);和同源重组(Lieberman-Lazarovich和Levy(2011)MethodsMolBiol701:51-65);Puchta,H.(2002)PlantMolBiol48:173-182)。使用所述核酸序列的插入来实现本发明的一种或多种TF的过表达的所需结果。增强子包括能够在插入植物的基因组时增强基因表达的任何分子。因此,可将增强子插入至少一个感兴趣TF序列的上游或下游基因组区中以增强表达。相对于将增强表达的基因,增强子可以起顺式作用,并且可位于基因组内的任何位置。例如,增强子可位于增强表达的编码序列的约1Mbp以内、约100kbp以内、约50kbp、约30kbp、约20kbp、约10kbp、约5kbp、约3kbp、或约1kbp以内。增强子也可位于其增强表达的基因的约1500bp以内,或者可紧邻或位于其增强表达的基因的内含子以内。本发明的用于调节内源性TF或同源物表达的增强子包括经典增强子元件,如CaMV35S增强子元件、巨细胞病毒(CMV)早期启动子增强子元件、和SV40增强子元件,还包括增强基因表达的内含子-介导的增强子元件如玉米shrunken-1增强子元件(Clancy,M.和Hannah,L.C.(2002)PlantPhysiol.130(2):918-29)。可导入植物基因组以调节表达的增强子的其他示例包括PetE增强子(Chua等,(2003)PlantCell15:11468-1479),或水稻α-淀粉酶增强子(Chen等,(2002)J.Biol.Chem.277:13641-13649),或本领域已知的任何增强子(Chudalayandi,S.(2011)MethodsMol.Biol.701:285-300)。在一些实施方式中,本发明包括亚结构域、片段、或重复增强子元件(Benfrey等,(1990)EMBOJ9:1677-1684)。本发明还提供通过将启动子或增强子插入植物基因组使其调节内源或外源序列的表达来调节植物中TF表达的方法。如上所述,使用本文提供的序列确定启动子或增强子的插入位点的方法和在给定插入位点处将启动子或增强子序列插入植物基因组的方法是本领域已知的。本发明的方法也包括TF的下调或活性降低(也称为基因沉默或基因抑制)。许多基因沉默的技术是本领域技术人员所知的,包括但不限于,反义技术(参见,例如,Sheehy等,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:8805-8809;和美国专利号5,107,065;5,453,566;和5,759,829);共抑制(例如,Taylor(1997)PlantCell9:1245;Jorgensen(1990)TrendsBiotech.8(12):340-344;Flavell(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:3490-3496;Finnegan等,(1994)Bio/Technology12:883-888;和Neuhuber等,(1994)Mol.Gen.Genet.244:230-241);RNA干扰(Napoli等,(1990)PlantCell2:279-289;美国专利号5,034,323;Sharp(1999)GenesDev.13:139-141;Zamore等,(2000)Cell101:25-33;和Montgomery等,(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:15502-15507),病毒诱导的基因沉默(Burton等,(2000)PlantCell12:691-705;和Baulcombe(1999)Curr.Op.PlantBio.2:109-113);靶-RNA-特异性核酶(Haseloff等,(1988)Nature334:585-591);发夹结构(Smith等,(2000)Nature407:319-320;WO99/53050;WO02/00904;WO98/53083;Chuang和Meyerowitz(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:4985-4990;Stoutjesdijk等,(2002)PlantPhysiol.129:1723-1731;Waterhouse和Helliwell(2003)Nat.Rev.Genet.4:29-38;Pandolfini等,BMCBiotechnology3:7,美国专利公开号20030175965;Panstruga等,(2003)Mol.Biol.Rep.30:135-140;Wesley等,(2001)PlantJ.27:581-590;Wang和Waterhouse(2001)Curr.Opin.PlantBiol.5:146-150;美国专利公开号20030180945;和WO02/00904,其全部通过引用纳入本文);核酶(Steinecke等,(1992)EMBOJ.11:1525;和Perriman等,(1993)AntisenseRes.Dev.3:253);寡核苷酸-介导的靶向修饰(例如,WO03/076574和WO99/25853);Zn-指靶向的分子(例如,WO01/52620;WO03/048345;和WO00/42219);转座子标签(Maes等,(1999)TrendsPlantSci.4:90-96;Dharmapuri和Sonti(1999)FEMSMicrobiol.Lett.179:53-59;Meissner等,(2000)PlantJ.22:265-274;Phogat等,(2000)J.Biosci.25:57-63;Walbot(2000)Curr.Opin.PlantBiol.2:103-107;Gai等,(2000)NucleicAcidsRes.28:94-96;Fitzmaurice等,(1999)Genetics153:1919-1928;Bensen等,(1995)PlantCell7:75-84;Mena等,(1996)Science274:1537-1540;和美国专利号5,962,764);dCas9-基转录因子(Piatek等,(2015)PlantBiotechnolJ13:578-589);其各自通过引用纳入本文;和本领域技术人员已知的其他方法或上述方法的组合。也可通过使用衍生自植物病毒的自复制DNA序列而不是通过将一种或多种感兴趣基因稳定插入植物核基因组来调节一种或多种本发明的TF的表达。已经成功使用衍生自植物病毒如双粒病毒的序列来实现在植物中表达多种感兴趣基因(Mozes-Koch等,(2012)PlantPhysiol158:1883-1892)。通过将编码一种或多种本发明的TF的一种或多种基因插入衍生自植物病毒的自复制构建体,可通过将病毒衍生的构建体转化到植物细胞中并选择转化的细胞来实现所述TF在感兴趣植物物种中的上调。认识到使用本发明的多核苷酸,可构建与TF序列的信使RNA(mRNA)的至少一部分互补的反义构建体。构建反义核苷酸以与相应mRNA杂交。可进行反义序列的修饰,至少该序列杂交并干扰相应mRNA的表达。在这种方式中,可使用与待沉默的相应序列有70%,较佳80%,更佳85%或更大的序列相同性的反义构建体。此外,可使用反义核苷酸的部分来破坏编码TF的靶基因的表达。也可以正义取向使用本发明的多核苷酸以抑制植物中内源性基因的表达。方法一般包括用包含启动子的DNA构建体转化植物,所述启动子驱动植物中可操作连接至对应于内源性基因的转录本的多核苷酸的至少一部分的表达。一般而言,这种核苷酸序列与内源性基因的转录本有明显序列相同性,较佳超过约65%序列相同性,更佳超过约85%序列相同性,最佳超过约95%序列相同性。参见美国专利号5,283,184和5,034,323,其通过引用纳入本文。可使用这类方法来降低至少一种TF的表达。可使用本发明的多核苷酸来从其他植物中分离相应序列。在这种方式中,PCR、杂交和其他类似方法可用于根据此类序列与本文所示序列的序列同源性来鉴定该序列。根据该序列与本文所示完整序列或其变体和片段的序列相同性而分离的序列涵盖在本发明中。此类序列包括公开序列的直向同源物序列。“直向同源物”是指源自共同祖先基因且由于物种形成而在不同物种中发现的基因。在不同物种中发现的基因当它们的核苷酸序列和/或它们的编码蛋白质序列具有至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大的序列相同性时被认为是直向同源物。直向同源物的功能通常在物种之间高度保守。因此,本发明包括转录活化或增强子激活并在严格条件下与本文公开的序列或其变体或片段杂交的分离的多核苷酸。可通过PCR分离变体序列。设计PCR引物和PCR克隆的方法是本领域熟知的并且公开于Sambrook等,(1989)《分子克隆:实验室手册》(MolecularCloning:ALaboratoryManual)(第2版,纽约州普莱恩维尤的冷泉港出版社)。还参见Innis等编,(1990)《PCR方案:方法和应用指南》(PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications)(纽约学术出版社);Innis和Gelfand编,(1995)《PCR策略》(PCRStrategies)(纽约学术出版社);以及Innis和Gelfand编,(1999)《PCR方法手册》(PCRMethodsManual)(纽约学术出版社)。也可通过分析测序的基因组的现有数据库来鉴定变体序列。在这种方式中,可鉴定相应TF或启动子序列并用于本发明的方法中。比对序列的比较方法是本领域熟知的。因此,可采用数学算法确定两个序列的序列相同性百分数。该数学算法的非限制性示例是Myers和Miller(1988)CABIOS4:11-17的算法;Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部比对算法;Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443-453的全局比对算法;Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444-2448的搜索局部比对方法;Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264的算法,由Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877改良。这些数学算法的计算机实施可用于比较序列来确定序列相同性。这类实施包括但不限于:PC/Gene程序中的CLUSTAL(购自美国加利福尼亚州芒廷维尤的智慧遗传公司(Intelligenetics,MountainView,California);ALIGN程序(2.0版)和GCGWisconsin遗传软件包中的GAP,BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA,10版(购自阿克赛勒里公司(AccelrysInc.),美国加利福尼亚州圣地亚哥Scranton路9685号)。可用默认参数来进行使用这些程序的比对。CLUSTAL程序由以下详细描述:Higgins等,(1988)Gene73:237-244(1988);Higgins等,(1989)CABIOS5:151-153;Corpet等,(1988)NucleicAcidsRes.16:10881-90;Huang等,(1992)CABIOS8:155-65;和Pearson等,(1994)Meth.Mol.Biol.24:307-331。ALIGN程序基于Myers和Miller(1988)同上的算法。比较氨基酸序列时,PAM120权重残基表、缺口长度罚分12、和缺口罚分4可与ALIGN程序联用。Altschul等,(1990)J.Mol.Biol.215:403的BLAST程序基于Karlin和Altschul(1990)同上的算法。可利用BLASTN程序进行BLAST核苷酸搜索(评分=100,字长=12),以获得与编码本发明蛋白质的核苷酸序列同源的核苷酸序列。可利用BLASTX程序进行BLAST蛋白质搜索(评分=50,字长=3),以获得与本发明蛋白质或多肽同源的氨基酸序列。为了获得缺口比对(出于比较目的),可如Altschul等,(1997)NucleicAcidsRes.,25:33893402所述利用缺口BLAST(在BLAST2.0中)。或者,可利用PSI-BLAST(在BLAST2.0中)进行迭代搜索,其用来检测分子之间的远近关系。参见Altschul等,(1997)同上。利用BLAST、缺口BLAST和PSI-BLAST程序时,可使用各程序(例如针对蛋白质的BLASTX,针对核苷酸的BLASTN)的默认参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。也可通过检查来人工进行比对。可在表达盒中提供本发明的多核苷酸用于在感兴趣植物中表达。该盒将包括与可操作连接至本发明的TF多核苷酸的5′和3′调节序列。“可操作地连接”是指2个或更多个元件之间的功能性连接。盒还可含有至少一种待共转化到生物体中的额外基因。或者,可在多个表达盒上提供额外基因。这种表达盒可提供多个限制位点和/或重组位点用于在调节区的转录条件下插入TF多核苷酸。表达盒还可含有选择性标记基因。表达盒将包括5′-3′方向的转录,转录和翻译起始区(即,启动子),本发明的TF多核苷酸,和在植物中有功能的转录和翻译终止区(即,终止区)。本发明的实践中可使用多种启动子。组成型启动子包括CaMV35S启动子(Odell等,(1985)Nature313:810-812);水稻肌动蛋白(McElroy等,(1990)PlantCell2:163-171);泛素(Christensen等,(1989)PlantMol.Biol.12:619-632和Christensen等,(1992)PlantMol.Biol.18:675-689);pEMU(Last等,(1991)Theor.Appl.Genet.81:581-588);MAS(Velten等,(1984)EMBOJ.3:2723-2730);ALS启动子(美国专利号5,659,026)等。组织优选的启动子包括Yamamoto等,(1997)PlantJ.12(2):255-265;Kawamata等,(1997)PlantCellPhysiol.38(7):792-803;Hansen等,(1997)Mol.GenGenet.254(3):337-343;Russell等,(1997)TransgenicRes.6(2):157-168;Rinehart等,(1996)PlantPhysiol.112(3):1331-1341;VanCamp等,(1996)PlantPhysiol.112(2):525-535;Canevascini等,(1996)PlantPhysiol.112(2):513-524;Yamamoto等,(1994)PlantCellPhysiol.35(5):773-778;Lam(1994)ResultsProbl.CellDiffer.20:181-196;Orozco等,(1993)PlantMolBiol.23(6):1129-1138;Matsuoka等,(1993)ProcNatl.Acad.Sci.USA90(20):9586-9590;和Guevara-Garcia等,(1993)PlantJ.4(3):495-505。叶优选启动子也是本领域已知的。参见,例如,Yamamoto等,(1997)PlantJ.12(2):255-265;Kwon等,(1994)PlantPhysiol.105:357-67;Yamamoto等,(1994)PlantCellPhysiol.35(5):773-778;Gotor等,(1993)PlantJ.3:509-18;Orozco等,(1993)PlantMol.Biol.23(6):1129-1138;和Matsuoka等,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(20):9586-9590。认识到特异性非组成型表达概况可相对于一种或多种感兴趣基因的组成型表达提供改善的植物表型。例如,通过光条件、施加特定应力、昼夜循环、或植物发育阶段来调节许多植物基因。这些表达概况对于植物中基因或基因产物的功能而言是非常重要的。可用于提供所需的表达概况的一个策略是使用含有在植物中所需的时间和位置处驱动所需的表达水平的顺式调节元件的合成启动子。多名研究人员已经鉴定了可用于改变植物中基因表达的顺式调节元件(Vandepoele等,(2009)PlantPhysiol150:535-546;Rushton等,(2002)PlantCell14:749-762)。已经对使用顺式调节元件来改变启动子表达概况进行了综述(Venter(2007)TrendsPlantSci.12:118-124)。转录组研究的新技术和分析这类数据库的新方法的快速开发使得能够发现新的顺式调节元件。已知之前使用的微阵列数据库没有与使用RNA-Seq生成的转录组数据相同的分辨率。使用这些更新的技术来生成转录组数据和开发用于分析转录组数据的新软件算法使得能够发现包括本文所述的那些的新顺式调节元件。本领域已知植物终止子并且包括来自根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)的Ti-质粒的那些,如真蛸碱合酶和胆脂碱合酶终止区。还参见Guerineau等,(1991)Mol.Gen.Genet.262:141-144;Proudfoot(1991)Cell64:671-674;Sanfacon等.(1991)GenesDev.5:141-149;Mogen等,(1990)PlantCell2:1261-1272;Munroe等,(1990)Gene91:151-158;Ballas等,(1989)NucleicAcidsRes.17:7891-7903;和Joshi等,(1987)NucleicAcidsRes.15:9627-9639。如上所述,TF可用于表达盒来转化感兴趣植物。转化方案以及向植物中导入多肽或多核苷酸序列的方案可根据转化靶向的植物或植物细胞的类型变化,即,单子叶或双子叶。向植物细胞中导入多肽和多核苷酸的合适方法包括微注射(Crossway等,(1986)Biotechniques4:320-334)、电穿孔(Riggs等,(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:5602-5606),农杆菌-介导的转化(美国专利号5,563,055和美国专利号5,981,840),直接基因转化(Paszkowski等,(1984)EMBOJ.3:2717-2722),和弹道颗粒加速(参见例如,美国专利号4,945,050;美国专利号5,879,918;美国专利号5,886,244;和5,932,782;Tomes等,(1995)《植物细胞、组织和器官培养中的基础方法》(PlantCell,Tissue,andOrganCulture:FundamentalMethods),Gamborg和Phillips编(Springer-Verlag,Berlin);McCabe等,(1988)Biotechnology6:923-926);和Lec1转化(WO00/28058)。还参见Weissinger等,(1988)Ann.Rev.Genet.22:421-477;Sanford等,(1987)ParticulateScienceandTechnology5:2737(洋葱);Christou等,(1988)PlantPhysiol.87:671-674(大豆);McCabe等,(1988)Bio/Technology6:923-926(大豆);Finer和McMullen(1991)InVitroCellDev.Biol.27P:175-182(大豆);Singh等,(1998)Theor.Appl.Genet.96:319-324(大豆);Datta等,(1990)Biotechnology8:736(水稻);Klein等,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:4305-4309(玉米);Klein等,(1988)Biotechnology6:559-563(玉米);美国专利号5,240,855;5,322,783;和5,324,646;Klein等,(1988)PlantPhysiol.91:440-444(玉米);Fromm等,(1990)Biotechnology8:833-839(玉米);Hooykaas-VanSlogteren等,(1984)Nature(伦敦)311:763-764;美国专利号5,736,369(谷类);Bytebier等,(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:5345-5349(百合);DeWet等,(1985)《胚珠组织实验操作》(TheExperimentalManipulationofOvuleTissues),Chapman等编,(纽约朗文出版社(Longman,NewYork),第197-209页(花粉);Kaeppler等,(1990)PlantCellReports9:415-418和Kaeppler等,(1992)Theor.Appl.Genet.84:560-566(须-介导的转化);D′Halluin等,(1992)PlantCell4:1495-1505(电穿孔);Li等,(1993)PlantCellReports12:250-255以及Christou和Ford(1995)AnnalsofBotany75:407-413(水稻);Osjoda等,(1996)NatureBiotechnology14:745-750(玉米,通过根癌农杆菌);其全部通过引用纳入本文。“稳定转化”是指导入植物的核苷酸构建体整合到植物的基因组中并且能够被其后代遗传。“顺式转化”是指导入植物的核苷酸构建体并不稳定整合到植物的基因组中,但是在植物细胞中保持足够的时间以允许导入基因的表达。按照常规方式,已经转化的细胞可长成植物。参见,例如,McCormick等,(1986)PlantCellReports5:81-84。在这种方式中,本发明提供了具有稳定整合到其基因组中的本发明的多核苷酸,例如,本发明的表达盒的转化的种子(也称为“转基因种子”)。本发明可用于任何植物物种的转化,包括但不限于单子叶和双子叶。感兴趣植物物种的示例包括但不限于,玉米(Zeamays),油菜种(例如,甘蓝型油菜(B.napus)、白菜型油菜(B.rapa)、芥菜型油菜(B.juncea)),尤其是用作菜籽油来源的那些油菜物种,苜蓿(Medicagosativa),水稻(Oryzasativa),黑麦(Secalecereale),高粱(Sorghumbicolor,Sorghumvulgare),粟(例如,珍珠粟(Pennisetumglaucum),黍(Panicummiliaceum),小米(Setariaitalica),穇子(Eleusinecoracana)),向日葵(Helianthusannuus),红花(Carthamustinctorius),小麦(Triticumaestivum),大豆(Glycinemax),烟草(Nicotianatabacum),马铃薯(Solanumtuberosum),花生(Arachishypogaea),棉花(Gossypiumbarbadense,Gossypiumhirsutum),甘薯(Ipomoeabatatas),木薯(Manihotesculenta),咖啡(Coffeaspp.),椰子(Cocosnucifera),菠萝(Ananascomosus),柠檬树(Citrusspp.),可可(Theobromacacao),茶(Camelliasinensis),香蕉(Musaspp.),鳄梨(Perseaamericana),无花果(Ficuscasica),番石榴(Psidiumguajava),芒果(Mangiferaindica),橄榄(Oleaeuropaea),番木瓜(Caricapapaya),腰果(Anacardiumoccidentale),澳洲坚果(Macadamiaintegrifolia),杏(Prunusamygdalus)、甜菜(Betavulgaris)、甘蔗(Saccharumspp.)、油棕榈(Elaeisguineensis)、杨树(Populussp.)、桉树(Eucalyptussp.)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。通过说明的方式,而非限制性方式提供以下实施例。本说明书中涉及的所有专利申请和出版物指示本发明涉及领域技术人员的水平。所有发表物和专利申请通过引用纳入本文,就好像将各篇单独的发表物或专利申请具体和单独地通过引用纳入本文那样。虽然出于方便理解的目的,通过阐述和举例的方式详细描述了上述发明,但可明显看出,某些改变和修改应属于所附权利要求书的范围。实验部分实施例1-二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)中的GRMZM2G143718表达对GRMZM2G143718编码序列进行密码子优化,用于在二穗短柄草中表达(SEQIDNO:1)。将所得的编码序列克隆到4个分开的二元载体中,各自具有不同的启动子和5’UTR。这些二元载体描述于表1。表1:GRMZM2G143718构建体使用表1所述的载体来转化二穗短柄草细胞。使用植物组织培养技术来再生转化的二穗短柄草细胞以产生含有这些载体中的GRMZM2G143718转基因盒的转基因二穗短柄草植物。通过使用从再生植物的叶中提取的DNA作为模板的PCR来确认转基因盒的导入。在这些转化过程期间,发现不可能从用载体130020转化的细胞中再生植物,该载体含有由ZmUbi启动子和5’UTR驱动的GRMZM2G143718编码序列。这表明预期由该启动子产生的高水平组成型基因表达对于组织培养过程期间的植物细胞而言是不利的。相反,可从用130028、130036、和130044载体转化的二穗短柄草细胞再生植物。用130028、130036、和130044载体转化的转基因二穗短柄草植物培养并生长至成熟。这些植物自花授粉以产生种子,然后收获这些种子并种植以使T1-代植物生长。T1-代植物和野生型二穗短柄草植物一起在生长室中以20小时光/4小时黑暗循环生长。植物在单独盆中生长。在用给定构建体转化的个体事件中观察生长差异。这三种构建体的选择事件的生物质产量数据与野生型二穗短柄草植物的类似数据一起示于表2。表2:来自GRMZM2G143718二穗短柄草植物的T1-代生物质和种子数据构建体事件n生物质产量(g)130028B5135.01±2.06130036F9-144.66±0.88130044B6-1104.98±1.21野生型n/a561.70±0.85从130028二穗短柄草植物的叶中提取RNA。进行定量RT-PCR实验,并且发现GRMZM2G143718转录本以比二穗短柄草中存在的组成型表达的天然Ubi10基因高约0.252倍的转录本水平存在。实施例2-二穗短柄草中的GRMZM2G117497表达对GRMZM2G117497编码序列进行密码子优化,用于在二穗短柄草中表达(SEQIDNO:3)。将所得的编码序列克隆到4个分开的二元载体中,各自具有不同的启动子和5’UTR。这些二元载体描述于表3。表3:GRMZM2G117497构建体使用表3所述的载体来转化二穗短柄草细胞。使用植物组织培养技术来再生转化的二穗短柄草细胞以产生含有这些载体中的GRMZM2G117497转基因盒的转基因二穗短柄草植物。通过使用从再生植物的叶中提取的DNA作为模板的PCR来确认转基因盒的导入。通过使用从再生植物的叶中提取的DNA作为模板的PCR来确认转基因盒的导入。含GRMZM2G117497基因的T0-代植物生长至成熟并且允许自花授粉以产生T1-代种子。种植所得的T1-代种子,T1-代植物与野生型二穗短柄草植物在20小时光/4小时黑暗的光周期下一起培养。植物在单个盆中生长。来自130032和130040构建体的选择事件的生物质产量数据与野生型二穗短柄草植物的类似数据一起示于表4。表4:来自GRMZM2G117497二穗短柄草植物的T1-代生物质和种子数据构建体事件n生物质产量(g)130032E14-242.17±0.66130040I4-324.61±0.31野生型n/a561.70±0.85实施例3-二穗短柄草中的GRMZM2G158117表达对GRMZM2G158117编码序列进行密码子优化,用于在二穗短柄草中表达(SEQIDNO:5)。将所得的编码序列克隆到4个分开的二元载体中,各自具有不同的启动子和5’UTR。这些二元载体描述于表5。表5:GRMZM2G158117构建体使用表5所述的载体来转化二穗短柄草细胞。使用植物组织培养技术来再生转化的二穗短柄草细胞以产生含有GRMZM2G158117转基因盒的转基因二穗短柄草植物。用130018构建体的转化尝试都是不成功的,而表5所列的其他三种构建体都产生转基因植物。这表明来自构建体130018中ZmUbi启动子的强烈组成型表达产生不利的表型。通过使用从再生植物的叶中提取的DNA作为模板的PCR来确认转基因盒的导入。T0-代植物生长至成熟并且自花授粉以产生T1-代种子。所得的T1-代种子与同龄的野生型二穗短柄草植物在20小时光/4小时黑暗的光周期下一起种植。植物在单个盆中生长。来自130026和130034构建体的选择事件的生物质产量数据与野生型二穗短柄草植物的类似数据一起示于表6。表6:来自GRMZM2G158117二穗短柄草植物的T1-代生物质和种子数据出乎意料,当由玉米PepC启动子和5’UTR(SEQIDNO:17)驱动时,GRMZM2G158117开放阅读框在二穗短柄草中的表达导致不利的表型。在载体130042中,玉米PepC启动子和5’UTR刚好位于GRMZM158117编码序列(SEQIDNO:5)的上游。在这些130042植物中,T0-代植物没有在移植到土壤中之后存活或者生长不良并且不产生任何种子。这些130042植物中的许多无法产生任何花。从130026和130034二穗短柄草植物的叶中提取RNA。进行定量RT-PCR实验,并且发现GRMZM2G158117转录本以比二穗短柄草中存在的组成型表达的天然Ubi10基因的转录本水平分别高约0.027倍和0.072倍的水平存在。实施例4-二穗短柄草中的GRMZM2G150260表达对GRMZM2G150260编码序列进行密码子优化,用于在二穗短柄草中表达(SEQIDNO:7)。将所得的编码序列克隆到3个分开的二元载体中,各自具有不同的启动子和5’UTR。这些二元载体描述于表7。表7:GRMZM2G150260构建体使用植物组织培养技术来再生转化的二穗短柄草细胞,以产生含有表7所述的GRMZM2G150260转基因盒的转基因二穗短柄草植物。通过使用从再生植物的叶中提取的DNA作为模板的PCR来确认转基因盒的导入。T0-代植物生长至成熟并且自花授粉以产生T1-代种子。所得的T1-代种子与同龄的野生型二穗短柄草植物在20小时光/4小时黑暗的光周期下一起种植。植物在单个盆中生长。这些构建体的选择事件的生物质产量数据与野生型二穗短柄草植物的类似数据一起示于表8,并且其中有无效分离子(nullsegregant)植物。表8:来自GRMZM2G150260二穗短柄草植物的T1-代生物质和种子数据从130027二穗短柄草植物的叶中提取RNA。进行定量RT-PCR实验,并且发现GRMZM2G150260转录本以比二穗短柄草中存在的组成型表达的天然Ubi10基因高约0.006倍的转录本水平存在。实施例5-二穗短柄草中的GRMZM2G165042表达对GRMZM2G165042编码序列进行密码子优化,用于在二穗短柄草中表达(SEQIDNO:9)。将所得的编码序列克隆到4个分开的二元载体中,各自具有不同的启动子和5’UTR。这些二元载体描述于表9。表9:GRMZM2G165042构建体使用植物组织培养技术来再生转化的二穗短柄草细胞以产生含有表9所述的GRMZM2G165042转基因盒的转基因二穗短柄草植物。通过使用从再生植物的叶中提取的DNA作为模板的PCR来确认转基因盒的导入。含有GRMZM2G165042转基因的转基因植物生长并允许自花授粉以产生T1种子。转基因130041二穗短柄草植物显示不利的生长表型。24个产生的130041植物中的11个没有在移植到土壤之后存活。24个130041植物中的8个显示非常弱的生长,其生物质累积较低。24个130041植物中的5个显示良好生长,但是在其叶上有棕色病变。来自构建体130017、130025、和130033的T1-代植物与野生型二穗短柄草植物一起在生长室中以20小时光/4小时黑暗的光周期生长。植物在单个盆中生长。这些构建体的选择事件的生物质产量数据与野生型二穗短柄草植物的类似数据一起示于表10。表10:来自GRMZM2G165042二穗短柄草植物的T1-代生物质和种子数据构建体事件n生物质产量(g)130017C3-221.50±0.58130033C132.41±0.85130033D741.54±0.43野生型n/a561.70±0.85实施例6-二穗短柄草中的GRMZM2G162749表达对GRMZM2G162749编码序列进行密码子优化,用于在二穗短柄草中表达(SEQIDNO:11)。将所得的编码序列克隆到4个分开的二元载体中,各自具有不同的启动子和5’UTR。这些二元载体描述于表11。表11:GRMZM2G162749构建体使用植物组织培养技术来再生转化的二穗短柄草细胞以产生含有表11所述的GRMZM2G162749转基因盒的转基因二穗短柄草植物。通过使用从再生植物的叶中提取的DNA作为模板的PCR来确认转基因盒的导入。在使用其中ZmUbi启动子驱动GRMZM2G162749序列的130021构建体转化的重复尝试之后,不可能生成任何转基因事件。这强烈表明由ZmUbi启动子赋予的强组成型表达对于植物再生而言是不利的。从130029、130037、和130045载体中回收转基因植物。这些植物生长至成熟并且允许自花授粉以产生T1-代种子。种植T1-代种子,并且所得的植物与野生型二穗短柄草植物在20小时光/4小时黑暗的光周期下一起生长。植物在单独盆中生长。这些构建体的选择事件的生物质产量数据与野生型二穗短柄草植物的类似数据一起示于表12。表12:来自GRMZM2G162749二穗短柄草植物的T1-代生物质和种子数据从130037二穗短柄草植物的叶中提取RNA。进行定量RT-PCR实验,并且发现GRMZM2G162749转录本以比二穗短柄草中存在的组成型表达的天然Ubi10基因高约0.260倍的转录本水平存在。实施例7-操作天然植物转录因子的表达用于改善的生长表15所列的玉米TF克隆到植物转化载体中用于在转基因植物中表达。本领域技术人员预期天然玉米TF在玉米中的表达将导致增加的生长、生物质积累、种子产量、和/或其他改善的植物特性,包括但不限于干旱耐受性、热胁迫耐受性、和耐受盐胁迫的能力。本领域技术人员还将充分理解这些TF的直向同源物在感兴趣植物物种中的表达也可到配制改善的植物特性,包括但不限于,改善的生长、生物质积累、种子产量、和/或对生物或非生物胁迫的抵抗。由于预期改变表15所列的玉米TF的直向同源物的表达水平和/或表达概况可改善植物特性,在感兴趣植物物种中鉴定这些TF的直向同源物。鉴定的直向同源物的表达水平和/或表达概况然后在感兴趣植物物种中处理以改善所述植物的农业性质。例如,本文所述的玉米TF的水稻(O.sativa)和二穗短柄草直向同源物示于表15。表15:玉米TF及其在水稻(Oryzasativa)和二穗短柄草中的直向同源物除了表15所列的玉米TF的水稻(Oryzasativa)和二穗短柄草直向同源物以外,通过使用生物信息学工具鉴定到其他直向同源物。用于鉴定直向同源基因的方法已经描述于科学文献中并且可用于鉴定对于表15中所列的TF而言直向同源的TF(Li等,(2003)GenomeRes13:2178-2189;Fulton等,(2002)PlantCell14:1457-1467)。在感兴趣植物中改变这类直向同源基因的表达以实现植物生长或产量的所需增加或增加的对生物或非生物胁迫的抵抗。实施例8-确定TF结合位点通过酵母单杂交试验方法来确定感兴趣TF的结合序列。在该方法中,表15中所列的TF被克隆到适于在微生物系统中产生蛋白质的载体(例如,pET-系列载体;生命技术公司)。TF在含有蛋白质产生质粒的合适微生物中产生并纯化。纯化的TF针对酵母单杂交试验中的合成启动子文库进行筛选。这种启动子文库在至少2种不同情况中含有全部8聚体DNA序列。这些酵母单杂交试验的结果是测试TF的结合位点。已经在科学文献中描述了类似的策略用于基于酵母单杂交试验筛选来确定TF结合位点(Pruneda-Paz等,(2009)Science323:481-485)。实施例9-狗尾草(Setariaviridis)和水稻(Oryzasativa)中的TF表达使用表16所列构建体来转化狗尾草组织。在共培养含有表16中所示的转化构建体的根癌农杆菌(A.tumefaciens)细胞和狗尾草愈伤组织之后,狗尾草细胞被转移到组织培养基中用于植物再生。使用PCR试验确认感兴趣基因的存在以检测所述基因存在与否。这些转化产生的原代转化体生长至成熟并且允许自花授粉以产生T1-代种子。表16:用于狗尾草转化的构建体将用表16所列构建体转化的狗尾草植物的T1-代种子种植在土壤中并且所得的T1植物与野生型狗尾草植物一起在温室中在单独盆中生长。表17显示了来自用载体130027和130044转化的可用狗尾草品系的收获的生物质以及与这些130027和130044植物一起生长的野生型狗尾草的生物质的干重。表17:选择的130027和130044狗尾草事件的干重表18显示了来自用载体130026、130034、130037、和130045转化的可用狗尾草品系的收获的生物质以及与这些植物一起生长的野生型狗尾草的生物质的干重。表18:选择的130026、130034、130037、和130045狗尾草事件的干重也使用表16所列构建体来转化水稻(Oryzasativacv.Kitaake)细胞。在与含有表16所述转化构建体的根癌农杆菌(A.tumefaciens)细胞共培养之后,使用组织培养技术再生转化的水稻细胞以产生转基因植物。通过使用从植物的叶提取的DNA和对感兴趣基因特异性的引物来确认再生的水稻植物中感兴趣基因的存在。这些转化产生的原代转化体生长至成熟并且允许自花授粉以产生T1-代种子。在收获T1-代种子之后,将这些种子种植在土壤中并且允许与野生型和/或空分离子植物作为阴性对照一起发芽。通过PCR或另一种合适的分子试验来对T1-代植物进行基因分型以检测感兴趣TF基因是否存在。T1植物生长至成熟并且自花授粉以产生T2-代种子。收获地上总生物质并在37℃烘箱中干燥。这些种子被单独收获、干燥、并称重,并计数。用一种或多种表16所列构建体转化的水稻植物产生的生物质的干重与由野生型和/或空分离子水稻植物产生的生物质的干重进行比较。用一种或多种表16所列构建体转化的水稻植物产生的种子的干重和总数也与由野生型和/或空分离子水稻植物产生的种子的干重和总数进行比较。进行合适的统计学分析以确定转基因水稻植物是否产生比阴性对照植物明显更多的生物质和/或种子。实施例10-测试盐和高pH耐受性如实施例11所述,使用表16所列载体来转化水稻(Oryzasativacv.Kitaake)。所得的水稻植物在温室环境中生长。这些水稻植物用水刺激,如表19所述。该表显示了其水稻植物培养区间所列的各种离子的平均浓度以及这段时间上的平均pH。该水中的高pH、高Na+、高S、高SO42-、和高Cl-含量明显在一般用于对植物进行浇水的范围以外。表19-用于TF-表达水稻植物的水的离子含量用表16所列载体转化的所有水稻植物在营养生长期间显示表型正常。然而,在到达繁殖阶段之后,许多植物无法产生有活力的种子。表20总结了用表16所述的载体转化的水稻植物的种子产生。表20-转基因水稻植物的种子产生如表20所示,这些转基因水稻品系中的大部分在用表19所示的水刺激时不能产生有活力的种子。用130024、130026、和130028构建体转化的转基因水稻品系则是例外。这些植物中的许多都成功自花授粉并且产生有活力的种子。将由表达感兴趣TF的水稻植物产生的种子种植到土壤中以培养T1-代水稻。T1-代水稻植物在正常条件以及高盐和/或高pH条件下与空分离子和/或野生型阴性对照植物一起生长。在成熟之后,植物进行自花授粉以产生种子。由水稻植物产生的生物质与种子一起收获并干燥。测量有水稻植物产生的生物质的重量、产生的种子的数量、和产生的种子的重量,并且进行合适的统计学分析以比较由TF-表达水稻植物的生物质和种子产生与阴性对照植物的生物质和种子产生。序列表<110>T·P·布鲁特内尔(Brutnell,ThomasP.)B·N·格雷(Gray,BenjaminN.)T·C·莫克勒(Mockler,ToddChristopher)王林(Wang,Lin)<120>用于增加植物生长和产量的方法和组合物<130>061808/464578<150>62/022,925<151>2014-07-10<160>52<170>FastSEQforWindowsVersion4.0<210>1<211>621<212>DNA<213>玉米(Zeamays)<220><221>misc_feature<222>(1)...(641)<223>基因标识符:GRMZM2G143718<400>1atgaggaccatctgcgacgtgtgcgagtccgccccggccgtgctcttctgcgccgccgac60gaggccgccctctgcaggccgtgcgacgagaaggtgcacatgtgcaacaagctcgcctcc120aggcacgtgagggtgggcctcgccgacccgaacaagctcgtgaggtgcgacatctgcgag180aactccccggccttcttctactgcgagatcgacggcacctccctctgcctctcctgcgac240atgaccgtgcacgtgggcggcaagaggacccacggcaggtacctcctcctcaggcagagg300gtggagttcccgggcgacaagccgggccacatggacgacgtgccgatggagatccaggac360ccggagaaccagagggaccagaagaagccgccgaaggagcagaccgccaaccaccacaac420ggcgacgacccggccaccgacggcaactgcgacgaccagggcaacatcgactccaagatg480atcgacctcaacatgaggccggtgaggacccacggccaggagtccaactcccagacccag540ggcgtgggcctctccgtgaacaaccacgactccccgggcgtggtgccgacctccaactcc600gagagggacacctccaagtga621<210>2<211>206<212>PRT<213>玉米(Zeamays)<220><221>结构域<222>(1)...(206)<223>基因标识符:GRMZM2G143718<400>2MetArgThrIleCysAspValCysGluSerAlaProAlaValLeuPhe151015CysAlaAlaAspGluAlaAlaLeuCysArgProCysAspGluLysVal202530HisMetCysAsnLysLeuAlaSerArgHisValArgValGlyLeuAla354045AspProAsnLysLeuValArgCysAspIleCysGluAsnSerProAla505560PhePheTyrCysGluIleAspGlyThrSerLeuCysLeuSerCysAsp65707580MetThrValHisValGlyGlyLysArgThrHisGlyArgTyrLeuLeu859095LeuArgGlnArgValGluPheProGlyAspLysProGlyHisMetAsp100105110AspValProMetGluIleGlnAspProGluAsnGlnArgAspGlnLys115120125LysProProLysGluGlnThrAlaAsnHisHisAsnGlyAspAspPro130135140AlaThrAspGlyAsnCysAspAspGlnGlyAsnIleAspSerLysMet145150155160IleAspLeuAsnMetArgProValArgThrHisGlyGlnGluSerAsn165170175SerGlnThrGlnGlyValGlyLeuSerValAsnAsnHisAspSerPro180185190GlyValValProThrSerAsnSerGluArgAspThrSerLys195200205<210>3<211>258<212>DNA<213>玉米(Zeamays)<220><221>misc_feature<222>(1)...(258)<223>基因标识符:GRMZM2G117497<400>3atgtccgcctcacgcagctcctctcccaactccatctcacagtggagccagaaagagaac60aagatgtttgaagaggcactcgcatactacggcgagggcacatccaaccggtgggacaag120gtgtccagagccatgggaggcatcaagtctgctgaggaggtgcgctgccactatgaagat180cttgactatgacgtcaagatgattgaatcaggccacgtgccgtaccccaagtacaagaca240catggattctggacctga258<210>4<211>85<212>PRT<213>玉米(Zeamays)<220><221>结构域<222>(1)...(85)<223>基因标识符:GRMZM2G117497<400>4MetSerAlaSerArgSerSerSerProAsnSerIleSerGlnTrpSer151015GlnLysGluAsnLysMetPheGluGluAlaLeuAlaTyrTyrGlyGlu202530GlyThrSerAsnArgTrpAspLysValSerArgAlaMetGlyGlyIle354045LysSerAlaGluGluValArgCysHisTyrGluAspLeuAspTyrAsp505560ValLysMetIleGluSerGlyHisValProTyrProLysTyrLysThr65707580HisGlyPheTrpThr85<210>5<211>264<212>DNA<213>玉米(Zeamays)<220><221>misc_feature<222>(1)...(264)<223>基因标识符:GRMZM2G158117<400>5atgtctgcctcgcggagctcctctcccaactccatgtcacagtggagccagaaagagaac60aagatgtttgaagaggcactcgcctactatggcgagggcacacccaaccggtgggacaag120gtgtccagcgccatgggaggcatcaagtctgccgaggaggtgcgctgccactatgaaaat180cttgattacgacgtcaagatgattgagtcaggcaatgtgccgtaccccaagtacaagaca240cagggattctggacccgaggttaa264<210>6<211>87<212>PRT<213>玉米(Zeamays)<220><221>结构域<222>(1)...(87)<223>基因标识符:GRMZM2G158117<400>6MetSerAlaSerArgSerSerSerProAsnSerMetSerGlnTrpSer151015GlnLysGluAsnLysMetPheGluGluAlaLeuAlaTyrTyrGlyGlu202530GlyThrProAsnArgTrpAspLysValSerSerAlaMetGlyGlyIle354045LysSerAlaGluGluValArgCysHisTyrGluAsnLeuAspTyrAsp505560ValLysMetIleGluSerGlyAsnValProTyrProLysTyrLysThr65707580GlnGlyPheTrpThrArgGly85<210>7<211>282<212>DNA<213>玉米(Zeamays)<220><221>misc_feature<222>(1)...(282)<223>基因标识符:GRMZM2G150260<400>7atggcgtctatgtcgctgagctcgtcgagggcgcagtggacggcgaagcagaacaagctg60ttcgagcaggcgttggcggtgtacgacagggacacgccggaccgctggcacaacatcgcg120cgcgccgtgggtggcaagtcggcggacgaggtcaggcgctactacgagctgctggtgaag180gacttggagcacatcgaggccggcaaggtggccttccccgcgtacaggtgccccggcggc240tacgacgacgccgacagcgacaggctgaagcacctgacctga282<210>8<211>93<212>PRT<213>玉米(Zeamays)<220><221>结构域<222>(1)...(93)<223>基因标识符:GRMZM2G150260<400>8MetAlaSerMetSerLeuSerSerSerArgAlaGlnTrpThrAlaLys151015GlnAsnLysLeuPheGluGlnAlaLeuAlaValTyrAspArgAspThr202530ProAspArgTrpHisAsnIleAlaArgAlaValGlyGlyLysSerAla354045AspGluValArgArgTyrTyrGluLeuLeuValLysAspLeuGluHis505560IleGluAlaGlyLysValAlaPheProAlaTyrArgCysProGlyGly65707580TyrAspAspAlaAspSerAspArgLeuLysHisLeuThr8590<210>9<211>1689<212>DNA<213>玉米(Zeamays)<220><221>misc_feature<222>(1)...(1689)<223>基因标识符:GRMZM2G165042<400>9atgaaccagttcgtccctgattggagcaacatgggagacacctccaggccgctcggcgaa60gaagacgacctcatcgagctgctatggtgcaacggccatgtcgtcatgcagagccagagc120caccggaaggtgccgccgaggccggagaaggcggcggcagtggcggctccaccagccccc180gcgtccgtgccgcaggaagacgagggcggcctgtggttccccttcgcgctggccgactcg240ctggacaaggacatcttctcggagt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