相关申请的交叉引用本申请要求2014年9月11日提交的美国临时专利申请no.62/049,306的优先权，该临时专利申请的全部内容以引用方式并入本文。背景蛋白质错折叠病症(pmd)包括：阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、2型糖尿病、亨延顿氏舞蹈病、肌萎缩性侧索硬化、系统性淀粉样变性、朊病毒病等。不同蛋白质的错折叠聚集体可形成并且积聚。除了其他效应外，错折叠聚集体可诱发细胞功能障碍和组织损伤。例如，阿尔茨海默氏病(ad)和帕金森氏病(pd)是无有效治疗或准确临床前诊断的退行性脑障碍。在ad中，例如，迄今的证据表明，淀粉样-β蛋白(aβ)的错折叠、聚集和脑沉积可为ad病状的触发因素。虽然aβ斑块最初被认为是疾病的标志，但当前的研究表明，可溶性aβ低聚物可能是引起ad中神经变性的关键突触-毒性物质。因为大脑的再生能力低，所以pmd的早期诊断对于允许在发生不可逆神经病理变化之前进行干预而言是至关重要的。若干条证据表明，错折叠和低聚过程可以在临床症状和实质性脑损伤发作前的几年或几十年开始。缺乏广泛接受的早期、灵敏以及客观的实验室诊断对于罹患pmd患者的护理而言仍然是主要问题。本申请意识到，对蛋白质错折叠进行检测(例如)以诊断相关疾病可能是一项充满挑战性的工作。概述在一个实施方案中，提供了一种用于确定样品中可溶性错折叠蛋白质的存在的方法。所述方法可包括使样品与单体折叠蛋白质接触以形成孵育混合物。所述方法可包括进行孵育循环两次或更多次以有效形成错折叠蛋白质的扩增部分。每个孵育循环可包括对孵育混合物进行孵育以在可溶性错折叠蛋白质的存在下有效引起单体折叠蛋白质的至少一部分的错折叠和/或聚集。每个孵育循环可包括物理地破坏孵育混合物以有效分解所存在的任何蛋白质聚集体的至少一部分，例如以释放可溶性错折叠蛋白质。所述方法可包括通过检测可溶性错折叠蛋白质的至少一部分来确定样品中可溶性错折叠蛋白质的存在。可溶性错折叠蛋白质可包括下列的一种或多种：可溶性错折叠单体和可溶性错折叠聚集体。错折叠蛋白质的扩增部分可包括下列的一种或多种：可溶性错折叠单体的扩增部分、可溶性错折叠聚集体的扩增部分以及不溶性错折叠聚集体。单体折叠蛋白质和可溶性错折叠蛋白质可排除朊病毒蛋白质(prp)及其同种型。在另一个实施方案中，提供了一种用于确定样品中可溶性错折叠蛋白质的存在的方法。所述方法可包括使样品与硫磺素t和摩尔过量的单体折叠蛋白质接触以形成孵育混合物。所述摩尔过量可大于样品中的可溶性错折叠蛋白质中所包括的蛋白质单体的量。所述方法可包括进行孵育循环两次或更多次以有效形成错折叠蛋白质的扩增部分。每个孵育循环可包括对孵育混合物进行孵育以在可溶性错折叠蛋白质的存在下有效引起单体折叠蛋白质的至少一部分的错折叠和/或聚集，从而形成错折叠蛋白质的扩增部分。每个孵育循环可包括振荡孵育混合物以有效分解所存在的任何蛋白质聚集体的至少一部分，例如以释放可溶性错折叠蛋白质。所述方法还可包括通过检测与可溶性错折叠蛋白质对应的硫磺素t的荧光来确定样品中可溶性错折叠蛋白质的存在。可溶性错折叠蛋白质可包括下列的一种或多种：可溶性错折叠单体和可溶性错折叠聚集体。错折叠蛋白质的扩增部分可包括下列的一种或多种：可溶性错折叠单体的扩增部分、可溶性错折叠聚集体的扩增部分以及不溶性错折叠聚集体。单体折叠蛋白质和可溶性错折叠蛋白质排除朊病毒蛋白质(prp)及其同种型。在一个实施方案中，提供了一种用于确定样品中可溶性错折叠蛋白质的存在的方法。所述方法可包括从样品中捕获可溶性错折叠蛋白质。所述方法可包括使捕获的可溶性错折叠蛋白质与摩尔过量的单体折叠蛋白质接触以形成孵育混合物。所述摩尔过量可大于捕获的可溶性错折叠蛋白质中所包括的蛋白质单体的量。所述方法可包括进行孵育循环两次或更多次以有效形成错折叠蛋白质的扩增部分。每个孵育循环可包括对孵育混合物进行孵育以在捕获的可溶性错折叠蛋白质的存在下有效引起单体折叠蛋白质的至少一部分的错折叠和/或聚集，从而形成错折叠蛋白质的扩增部分。每个孵育循环可包括物理地破坏孵育混合物以有效分解所存在的任何蛋白质聚集体的至少一部分，例如以释放可溶性错折叠蛋白质。所述方法还可包括通过检测可溶性错折叠蛋白质的至少一部分来确定样品中可溶性错折叠蛋白质的存在。可溶性错折叠蛋白质可包括下列的一种或多种：可溶性错折叠单体和可溶性错折叠聚集体。捕获的可溶性错折叠蛋白质可包括下列的一种或多种：捕获的可溶性错折叠单体和捕获的可溶性错折叠聚集体。错折叠蛋白质的扩增部分可包括下列的一种或多种：可溶性错折叠单体的扩增部分、可溶性错折叠聚集体的扩增部分以及不溶性错折叠聚集体。单体折叠蛋白质和可溶性错折叠蛋白质排除朊病毒蛋白质(prp)及其同种型。在另一个实施方案中，提供了一种用于确定样品中可溶性错折叠蛋白质的存在的试剂盒。所述试剂盒可包括已知量的单体折叠蛋白质和已知量的可溶性错折叠蛋白质的指示剂中的一种或多种。所述试剂盒可包括说明书。说明书可指导用户使样品与已知量的单体折叠蛋白质和已知量的可溶性错折叠蛋白质的指示剂中的一种或多种接触以形成孵育混合物。说明书可指导用户进行孵育循环两次或更多次以有效形成错折叠蛋白质的扩增部分。每个孵育循环可包括对孵育混合物进行孵育以在可溶性错折叠蛋白质的存在下有效引起单体折叠蛋白质的至少一部分的错折叠和/或聚集，从而形成错折叠蛋白质的扩增部分。每个孵育循环可包括物理地破坏孵育混合物以有效分解所存在的任何蛋白质聚集体的至少一部分，例如以释放可溶性错折叠蛋白质。说明书可指导用户通过检测可溶性错折叠蛋白质来确定样品中可溶性错折叠蛋白质的存在。可溶性错折叠蛋白质可包括下列的一种或多种：可溶性错折叠单体和可溶性错折叠聚集体。错折叠蛋白质的扩增部分可包括下列的一种或多种：可溶性错折叠单体的扩增部分、可溶性错折叠聚集体的扩增部分以及不溶性错折叠聚集体。单体折叠蛋白质和可溶性错折叠蛋白质可排除朊病毒蛋白质(prp)及其同种型。本文公开的用于确定样品中可溶性错折叠蛋白质的存在的方法和试剂可以有效地确定样品中可溶性错折叠蛋白质的不存在。附图简述包含在说明书中并构成本说明书一部分的附图示出示例性的方法和结果，并且仅用于示出示例性实施方案。图1a示出在孵育的0h、5h、10h和24h获取的电子显微照片。图1b为可溶性低聚aβ蛋白质聚集体的蛋白质印迹。图2a为示出通过tht荧光测量的非扩增淀粉样蛋白质形成作为时间的函数的图，所述非扩增淀粉样蛋白质形成是由各种浓度的实施例1的合成的可溶性低聚aβ蛋白质播种。图2b为示出通过tht荧光测量的扩增循环加速的淀粉样蛋白质形成作为时间的函数的图，所述淀粉样蛋白质形成是由各种浓度的实施例1的合成的可溶性低聚aβ蛋白质播种。图3a为根据tht荧光标记测量的淀粉样蛋白质形成相对于时间的图，该图示出由来自ad组、nnd组和nand组的5个代表性样品的csf播种的aβ聚集的平均动力学。图3b为在来自ad组、nnd组和nand组的样品的存在下针对aβ聚集的延滞期时间(h)的图。图3c为示出在180个aβ-pmca循环(即90h孵育(p90))之后，在来自ad患者、nnd患者和nand患者的csf样品的存在下所获得的淀粉样蛋白质形成的程度的图。图4a为针对使用图3b中所示延滞期值的不同截留点的真阳性率(敏感性)作为假阳性率(特异性)的函数的图线，为ad相对于nand。图4b为针对使用图3b中所示延滞期值的不同截留点的真阳性率(敏感性)作为假阳性率(特异性)的函数的图线，为ad相对于nnd。图4c为针对使用图3b中所示延滞期值的不同截留点的真阳性率(敏感性)作为假阳性率(特异性)的函数的图线，为ad相对于对照样品。图4d为针对使用图3b中所示延滞期值的不同截留点的真阳性率(敏感性)作为假阳性率(特异性)的函数的图线，并且估计图4a-4c的不同组的组比较的最可靠截留点。图5表1示出对aβ-pmca试验的敏感性、特异性和预测值的估计，其中使用延滞期数值进行计算。图6为在300个aβ-pmca循环(即150h孵育(p90))之后，在来自ad患者和对照患者的csf样品的存在下所获得的样品的延滞期时间(h)的图。图7a为示出使用掺入人csf中的合成制备的aβ低聚物的免疫耗竭结果的蛋白质印迹。图7b为示出由对照样品和免疫耗竭的csf样品播种的aβ聚集的动力学的图。图7c为示出由对照样品和免疫耗竭的csf样品播种的aβ聚集的动力学的图，其中所述样品仅用a11构象抗体进行耗竭。图8a为用于从复杂生物样品中捕获aβ低聚物的elisa固相法的示意图。图8b为用于从复杂生物样品捕获aβ低聚物的磁珠固相法的示意图。图9表2示出特异性抗体捕获aβ低聚物的能力。图10为淀粉样蛋白质形成相对于时间的图，该图示出通过掺入人血浆的不同量的合成低聚物的存在而导致的aβ聚集的加速。图11为示出在来自ad患者和对照的血浆样品的存在下，在aβ-pmca测定中达到50％聚集的时间的图。图12为示出在不同量的合成aβ低聚物的存在下通过孵育/超声处理的循环而导致的aβ聚集的扩增结果的蛋白质印迹，所述结果是在蛋白酶消化后通过蛋白质印迹来监测。图13a为硫磺素t荧光相对于时间的图，该图示出通过pd-pmca对αs种子的检测。图13b达到50％聚集的时间被绘制作为指示量的αs种子的函数的图。图14示出通过pd-pmca对来自人pd患者的csf样品中的αs种子的检测，相对于患有阿尔茨海默氏病(ad)或非神经变性疾病(nnd)的对照。图15表3示出不同的序列或构象抗体捕获αs低聚物的能力。图16a为用于捕获αs低聚物的elisa固相法的示意图。图16b为用于捕获αs低聚物的磁珠固相法的示意图。图17a为示出使用n-19αs抗体的来自人血浆的αs低聚物的免疫沉淀/聚集结果的图。图17b为示出使用211αs抗体的来自人血浆的αs低聚物的免疫沉淀/聚集结果的图。图17c为示出使用c-20αs抗体的来自人血浆的αs低聚物的免疫沉淀/聚集结果的图。图18a为示出对照样品中对csf样品中的αs种子的检测结果的图。图18b为示出pd患者中对csf样品中的αs种子的检测结果的图。图18c为示出患有多系统萎缩(msa)的患者中对csf样品中的αs种子的检测结果的图。详述提供了用于检测样品中的错折叠蛋白质，包括用于诊断蛋白质错折叠病症(pmd)的方法和试剂盒。不同蛋白质的错折叠聚集体可形成并且积聚。除了其他效应外，错折叠聚集体可诱发细胞功能障碍和组织损伤。例如，pmd可包括：淀粉样变性例如阿尔茨海默氏病(ad)或系统性淀粉样变性；突触核蛋白病例如帕金森氏病(pd)、路易体痴呆；多系统萎缩；和突触核蛋白相关的神经轴性营养不良；2型糖尿病；三联体重复病症(tripletrepeatdisorder)例如亨延顿氏舞蹈病(hd)；肌萎缩性侧索硬化(als)；等等。不同蛋白质的错折叠聚集体可形成并且积聚。除了其他效应外，错折叠聚集体可诱发细胞功能障碍和组织损伤。在一些实施方案中，pmd可排除传染性朊病毒病，例如传染性海绵状脑病(tse)。此类传染性海绵状脑病(tse)是一组影响人和动物的传染性神经变性疾病。例如，人tse疾病可包括：克劳伊氏病(creutzfeldt-jakobdisease)及其变体(cjd,vcjd)、库鲁病，格-史氏病(gerstmann-straussler-scheikerdisease，gss)和致死性家族性失眠症(ffi)。动物tse疾病包括绵羊和山羊(瘙痒症)；牛(牛海绵状脑病，bse)；麋鹿、白尾鹿、骡鹿和马鹿(慢性消耗性疾病，cwd)；水貂(传染性貂脑病，tme)；猫(猫科海绵状脑病，fse)；尼牙薮羚和大捻角羚(外来有蹄类脑病，eue)；等等。如本文所用，“单体蛋白质”和“可溶性错折叠蛋白质”排除朊病毒蛋白质(prp)及其同种型。如本文所用，“朊病毒”是已知引起tse的错折叠蛋白质。朊病毒蛋白质(prp)可与以下若干同种型相关联：正常的、常见的或细胞同种型(prpc)；蛋白酶抗性同种型(prpres)；传染性或“瘙痒症”同种型(prpse)；等等。蛋白质错折叠循环扩增(pmca)的方法可通过对体外错折叠和聚集过程进行人工加速和扩增来提供对错折叠聚集体的超灵敏检测。pmca的基本概念先前已有公开(soto等，wo2002/04954；estrada等，美国专利申请公布no.20080118938，其各自以引用的方式完全并入本文)。然而，在本文件的提交日之前，没有专利公布能够使pcma用于扩增和检测样品中的可溶性错折叠蛋白质(除了朊病毒之外)，包括用于诊断pmd。本文件公开了能够使pmca技术用于检测如在pmd患者中所发现的可溶性错折叠蛋白质的具体实施例和细节。在各种实施方案中，提供了用于确定样品中可溶性错折叠蛋白质的存在的方法。如本文所述，用于确定样品中可溶性错折叠蛋白质的存在的方法和试剂盒可有效确定样品中可溶性错折叠蛋白质的不存在。本文所述的可溶性错折叠蛋白质可为例如引起或导致与pmd相关联的多种神经病状的致病蛋白质。所述方法可包括使样品与单体折叠蛋白质接触以形成孵育混合物。所述方法可包括进行孵育循环两次或更多次以有效形成错折叠蛋白质的扩增部分。每个孵育循环可包括对孵育混合物进行孵育以在可溶性错折叠蛋白质的存在下有效引起单体折叠蛋白质的至少一部分的错折叠和/或聚集，例如从而形成错折叠蛋白质的扩增部分。每个孵育循环可包括物理地破坏孵育混合物以有效分解所存在的任何蛋白质聚集体的至少一部分，例如以释放可溶性错折叠蛋白质。所述方法可包括通过检测可溶性错折叠蛋白质的至少一部分来确定样品中可溶性错折叠蛋白质的存在。可溶性错折叠蛋白质可包括下列的一种或多种：可溶性错折叠单体和可溶性错折叠聚集体。错折叠蛋白质的扩增部分可包括下列的一种或多种：可溶性错折叠单体的扩增部分、可溶性错折叠聚集体的扩增部分以及不溶性错折叠聚集体。单体折叠蛋白质和可溶性错折叠蛋白质可排除朊病毒蛋白质(prp)及其同种型。如本文所用，“aβ”或“β淀粉样蛋白”是指通过淀粉样前体蛋白(app)的顺序裂解形成的肽。各种aβ同种型可包括38-43个氨基酸残基。当app被呈任何组合形式的β-分泌酶和/或γ-分泌酶处理时可形成aβ蛋白质。aβ可为罹患或疑似患有ad的个体的大脑中的淀粉样蛋白斑块的组成部分。各种aβ同种型可包括并且不限于abeta40和abeta42。各种aβ肽可与和ad有关的神经元损害相关联。如本文所用，“αs”或“α-突触核蛋白”是指全长的140个氨基酸α-突触核蛋白蛋白质，例如“αs-140”。其他同种型或片段可包括例如由于外显子3的丧失而缺少残基41-54的“αs-126”(α-突触核蛋白-126)，和例如由于外显子5的丧失而缺少残基103-130的“αs-112”(α-突触核蛋白-112)。αs可存在于罹患pd或怀疑患有pd的个体的大脑中。各种αs同种型可包括并且不限于αs-140、αs-126和αs-112。各种αs肽可与和pd有关的神经元损害相关联。如本文所用，“tau”是指这样的蛋白质，其为从单个基因选择性剪接的产物，例如人的mapt(微管相关蛋白tau)。tau蛋白质包括任何tau同种型的全长形式和截短形式。各种同种型包括但不限于已知存在于人脑组织中的六个tau同种型，这些同种型对应于tau基因的外显子2、3和10中的选择性剪接。三个同种型具有三个结合域，另外三个同种型具有四个结合域。错折叠tau可存在于罹患ad或怀疑患有ad或其他tau疾病的个体的大脑中。如本文所用，“错折叠蛋白质”是指这样的蛋白质，当涉及到其在生物系统内的典型非致病正常功能时，该蛋白质不再包含其存在时的蛋白质结构构象的全部或一部分。错折叠蛋白质可聚集。错折叠蛋白质可定位在蛋白质聚集体中。错折叠蛋白质可为非功能性蛋白质。错折叠蛋白质可为蛋白质的致病性构象异构体。单体折叠蛋白质组合物可以天然的非致病性构象提供，其对于和种子相关联的错折叠、低聚和聚集不具有催化活性。单体折叠蛋白质组合物可以无种子形式提供。如本文所用，“单体折叠蛋白质”是指单个蛋白质分子。“可溶性聚集错折叠蛋白质”是指保留在溶液中的单体错折叠蛋白质的聚集物。可溶性错折叠蛋白质的例子可包括任何数目的蛋白质单体，只要该错误折叠蛋白仍然是可溶的即可。例如，可溶性错折叠蛋白质可包括介于2个单位和约50个单位之间的单体蛋白质的单体或聚集体。单体和/或可溶性错折叠蛋白质可聚集形成不溶性聚集体和/或更高级低聚物。例如，aβ蛋白质的聚集可导致可以在ad受试者中观察到的初原纤维、原纤维以及最终的淀粉样蛋白斑。“种子”或“核”是指可溶性错折叠蛋白质或短的片段化的原纤维，特别是对进一步错折叠、低聚和聚集具有催化活性的可溶性错折叠蛋白质。此类成核依赖性聚集的特征可在于缓慢延滞期，在该缓慢延滞期内可形成聚集体核，该聚集体核可随后催化另外的聚集体和较大聚合物的快速形成。可通过加入预形成的核或种子来最小化或去除延滞期。可提供对于和种子相关联的错折叠和聚集不具有催化活性的单体蛋白质组合物。单体蛋白质组合物可以无种子形式提供。如本文所用，“可溶性”物质可在生理条件下在生物流体中形成溶液，而“不溶性”物质可在生理条件下在生物流体中以沉淀、原纤维、沉积物、缠结物或其他未溶解形式存在。此类生物流体可包括例如下列的流体或由下列的一种或多种表达的流体：羊水；胆汁；血液；脑脊液；耳垢；皮肤；渗出液；排泄物；胃液；淋巴；乳汁；粘液，如鼻腔分泌物；粘膜，例如鼻粘膜；腹膜液；血浆；胸膜腔积液；脓液；唾液；皮脂；精液；汗液；滑液；泪液；尿液；等等。不溶性物质可包括例如aβ、αs、tau等的原纤维。在生理条件下溶解于非生物流体而非上述生物流体之一中的物质可以被认为是不溶性的。例如，aβ、αs、tau等的原纤维可在生理条件下溶解于例如表面活性剂如十二烷基硫酸钠(sds)在水中的溶液中，但仍不溶于上述生物流体中的一种或多种中。在一些实施方案中，样品可排除错折叠蛋白质如aβ、αs或tau的不溶性物质，这些不溶性物质可为在生理条件下在所述生物流体中的一种或多种中不溶的沉淀、原纤维、沉积物、缠结物、斑块或其他形式。例如，样品可排除呈原纤维形式的αs和tau。样品可排除呈不溶性形式的错折叠aβ、αs和/或tau蛋白质，例如样品可排除作为沉淀、原纤维、沉积物、缠结物、斑块或其他形式(例如原纤维形式)的错折叠aβ、αs和/或tau蛋白质。本文所述的方法可包括通过下述方式制备样品：排除呈不溶性形式的错折叠aβ和tau蛋白质，例如从样品中排除作为沉淀、原纤维、沉积物、缠结物、斑块或其他不溶性形式(例如原纤维形式)的错折叠aβ和tau蛋白质。本文所述的试剂盒可包括说明书，该说明书指导用户通过从样品中排除作为沉淀、原纤维、沉积物、缠结物、斑块或其他不溶性形式(例如原纤维形式)的错折叠aβ、αs和/或tau蛋白质来制备样品。所述错折叠蛋白质的此类不溶性形式从样品中的排除可为基本上的或完全的。如本文所用，可溶性错折叠蛋白质的聚集体是指蛋白质(包括可溶性错折叠蛋白质)的非共价缔合物。可溶性错折叠蛋白质的聚集体可被“解聚集”或破坏以分解或释放可溶性错折叠蛋白质。集合的可溶性错折叠蛋白质种子的催化活性可至少部分地随混合物中种子的数目而改变。因此，为释放可溶性错折叠蛋白质种子而使混合物中的可溶性错折叠蛋白质破坏或聚集可导致针对单体蛋白质低聚的催化活性增加。如本文所用，“错折叠蛋白质”是指这样的蛋白质，当涉及到其在生物系统内的典型正常功能时，该蛋白质不再包含其存在时的蛋白质结构构象的全部或一部分。错折叠蛋白质可聚集。错折叠蛋白质可定位在蛋白质聚集体中。错折叠蛋白质可为非功能性蛋白质。错折叠蛋白质可为致病性同种型。在各种实施方案中，提供了用于确定样品中可溶性错折叠蛋白质的存在的方法。所述方法可包括使样品与硫磺素t和摩尔过量的单体折叠蛋白质接触以形成孵育混合物。所述摩尔过量可大于样品中的可溶性错折叠蛋白质中所包括的蛋白质单体的量。所述方法可包括进行孵育循环两次或更多次以有效形成错折叠蛋白质的扩增部分。每个孵育循环可包括对孵育混合物进行孵育以在可溶性错折叠蛋白质的存在下有效引起单体折叠蛋白质的至少一部分的错折叠和/或聚集，从而形成错折叠蛋白质的扩增部分。每个孵育循环可包括振荡孵育混合物以有效分解所存在的任何蛋白质聚集体的至少一部分，例如以释放可溶性错折叠蛋白质。所述方法还可包括通过检测与可溶性错折叠蛋白质对应的硫磺素t的荧光来确定样品中可溶性错折叠蛋白质的存在。可溶性错折叠蛋白质可包括下列的一种或多种：可溶性错折叠单体和可溶性错折叠聚集体。捕获的可溶性错折叠蛋白质可包括下列的一种或多种：捕获的可溶性错折叠单体和捕获的可溶性错折叠聚集体。错折叠蛋白质的扩增部分可包括下列的一种或多种：可溶性错折叠单体的扩增部分、可溶性错折叠聚集体的扩增部分以及不溶性错折叠聚集体。在一些实施方案中，单体折叠蛋白质和可溶性错折叠蛋白质可排除朊病毒蛋白质(prp)及其同种型。在各种实施方案中，提供了用于确定样品中可溶性错折叠蛋白质的存在的方法。所述方法可包括从样品中捕获可溶性错折叠蛋白质。所述方法可包括使捕获的可溶性错折叠蛋白质与摩尔过量的单体折叠蛋白质接触以形成孵育混合物。所述摩尔过量可大于捕获的可溶性错折叠蛋白质中所包括的蛋白质单体的量。所述方法可包括进行孵育循环两次或更多次以有效形成错折叠蛋白质的扩增部分。每个孵育循环可包括对孵育混合物进行孵育以在捕获的可溶性错折叠蛋白质的存在下有效引起单体折叠蛋白质的至少一部分的错折叠和/或聚集，从而形成错折叠蛋白质的扩增部分。每个孵育循环可包括物理地破坏孵育混合物以有效分解所存在的任何蛋白质聚集体的至少一部分，例如以释放可溶性错折叠蛋白质。所述方法还可包括通过检测可溶性错折叠蛋白质的至少一部分来确定样品中可溶性错折叠蛋白质的存在。可溶性错折叠蛋白质可包括下列的一种或多种：可溶性错折叠单体和可溶性错折叠聚集体。捕获的可溶性错折叠蛋白质可包括下列的一种或多种：捕获的可溶性错折叠单体和捕获的可溶性错折叠聚集体。错折叠蛋白质的扩增部分可包括下列的一种或多种：可溶性错折叠单体的扩增部分、可溶性错折叠聚集体的扩增部分以及不溶性错折叠聚集体。在一些实施方案中，单体折叠蛋白质和可溶性错折叠蛋白质可排除朊病毒蛋白质(prp)及其同种型。如本文所用，对可溶性错折叠蛋白质的提及可包括分布在样品中的任何形式的可溶性错折叠蛋白质、孵育混合物等。例如，对可溶性错折叠蛋白质的提及可包括可溶性错折叠蛋白质，例如，来自罹患pmd的受试者的样品中的可溶性错折叠蛋白质。对可溶性错折叠蛋白质的提及可包括，例如，如孵育混合物中的错折叠蛋白质的扩增部分。对可溶性错折叠蛋白质的提及可包括捕获的可溶性错折叠蛋白质，例如使用可溶性错折叠蛋白质特异性抗体从样品捕获的可溶性错折叠蛋白质。在一些实施方案中，所述方法可包括使可溶性错折叠蛋白质的指示剂与孵育混合物接触。可溶性错折叠蛋白质的指示剂的特征可为在存在可溶性错折叠蛋白质时的指示状态以及在不存在可溶性错折叠蛋白质时的非指示状态。确定样品中可溶性错折叠蛋白质的存在可包括检测可溶性错折叠蛋白质的指示剂的指示状态。指示剂的指示状态和指示剂的非指示状态的特征可为荧光的差异。确定样品中可溶性错折叠蛋白质的存在可包括检测荧光的差异。在若干实施方案中，所述方法可包括使摩尔过量的可溶性错折叠蛋白质的指示剂与孵育混合物接触。所述摩尔过量可大于孵育混合物中的单体折叠蛋白质和可溶性错折叠蛋白质中所包括的蛋白质单体的总摩尔量。在各种实施方案中，可溶性错折叠蛋白质的指示剂可包括下列的一种或多种：硫磺素t、刚果红、m-i-均二苯代乙烯、柯胺g、pib、bf-227、x-34、tzdm、fddnp、meo-x-04、impy、niad-4、发光共轭聚噻吩、与荧光蛋白例如绿荧光蛋白和黄荧光蛋白的融合物、其衍生物等。在一些实施方案中，确定样品中可溶性错折叠蛋白质的存在可包括确定样品中可溶性错折叠蛋白质的量。相较于对照样品可确定样品中可溶性错折叠蛋白质的量。样品中可溶性错折叠蛋白质的量可以下列中至少约一个或多个的敏感性来检测：80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％。检测到的样品中可溶性错折叠蛋白质的量可小于下列中的约一个或多个：100nmol、10nmol、1nmol、100pmol、10pmol、1pmol、100fmol、10fmol、3fmol、1fmol、100attomol、10attomol和1attomol。样品中可溶性错折叠蛋白质的量可以与样品中所含的单体折叠蛋白质的摩尔比率来检测。摩尔比率可小于下列中的约一个或多个：1:100、1:10,000、1:100,000和1:1,000,000。在各种实施方案中，样品中的可溶性错折叠蛋白质可以下列中至少约一个或多个的特异性来检测：80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％。在一些实施方案中，孵育混合物可包括浓度或浓度范围为下列中一个或多个的单体折叠蛋白质：介于约1nm和约2mm之间；介于约10nm和约200μm之间；介于约100nm和约20μm；或介于约1μm和约10μm之间；和约2μm。在若干实施方案中，孵育混合物可包括缓冲组合物。缓冲组合物可有效地制备或维持如本文所述的孵育混合物的ph，例如介ph5和ph9之间。缓冲组合物可包括下列中的一种或多种：tris-hcl、pbs、mes、pipes、mops、bes、tes和hepes等。缓冲液浓度可为介于约1μm和约1m之间的总浓度。例如，缓冲液可为浓度为0.1m的tris-hcl。在各种实施方案中，孵育混合物可包括盐组合物。盐组合物可有效地提高孵育混合物的离子强度。盐组合物可包括下列中的一种或多种：nacl、kcl等。孵育混合物可包括总浓度介于约1μm和约500mm之间的盐组合物。在若干实施方案中，孵育混合物的特征可为用下列中一个或多个的ph值或ph范围制备或维持在孵育混合物的特征可为用下列中一个或多个的ph值或ph范围下：介于约5和约9之间；介于约6和约8.5之间；介于约7和约8；和约7.4。在一些实施方案中，孵育混合物的孵育温度(℃)可为下列中的约一个或多个：4℃、6℃、8℃、10℃、12℃、14℃、16℃、18℃、20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、35℃、36℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃和60℃，例如约22℃，或介于任意前述两个值之间的温度范围，例如，下列中的一个或多个：介于约4℃和约60℃之间；介于约4℃和约35℃之间；介于约8℃和约50℃之间；介于约12℃和约40℃之间；介于约18℃和约30℃之间；介于约18℃和约26℃之间；等等。在若干实施方案中，检测可溶性错折叠蛋白质可包括下列中的一种或多种：蛋白质印迹测定、斑点印迹测定、酶联免疫吸附测定(elisa)、硫磺素t结合测定、刚果红结合测定、沉淀测定、电子显微术、原子力显微术、表面等离子体共振和光谱法。elisa可包括双面夹心elisa。光谱法包括下列的一种或多种：准光散射光谱法、多光谱紫外光谱法、共焦双色荧光相关光谱法、傅里叶变换红外光谱法、毛细管电泳与光谱检测、电子自旋共振光谱法、核磁共振光谱法和荧光共振能量转移(fret)光谱法等。在各种实施方案中，检测可溶性错折叠蛋白质可包括使孵育混合物与蛋白酶接触。可使用抗错折叠蛋白质抗体以下列的一种或多种测定来检测可溶性错折叠蛋白质：蛋白质印迹测定、斑点印迹测定和elisa。在一些实施方案中，所述方法可包括提供呈标记形式的单体折叠蛋白质。呈标记形式的单体折叠蛋白质可包括下列的一种或多种：共价结合的放射性氨基酸、共价结合的同位素标记的氨基酸和共价结合的荧光团。检测可溶性错折叠蛋白质包括检测掺入错折叠蛋白质的扩增部分的呈标记形式的单体折叠蛋白质。在若干实施方案中，样品可从受试者获取。所述方法可包括根据样品中可溶性错折叠蛋白质的存在来确定或诊断受试者中pmd的存在。相较于从对照受试者获取的对照样品可确定样品中可溶性错折叠蛋白质的存在。在一些实施方案中，pmd可包括下列的至少一种：淀粉样变性；突触核蛋白病；三联体重复病症；或肌萎缩性侧索硬化。pmd可包括淀粉样变性，例如下列的至少一种：阿尔茨海默氏病或系统性淀粉样变性。pmd可包括突触核蛋白病，例如下列的至少一种：帕金森氏病、路易体痴呆；多系统萎缩；或突触核蛋白相关的神经轴性营养不良。pmd可包括亨延顿氏舞蹈病。在各种实施方案中，检测可包括检测样品中可溶性错折叠蛋白质的量。所述方法可包括通过将样品中可溶性错折叠蛋白质的量与预定阈值量进行比较来确定或诊断受试者中pmd的存在。在若干实施方案中，样品可从根据认知测试未表现出痴呆临床征象的受试者获取。所述方法可包括根据样品中可溶性错折叠蛋白质的存在来确定或诊断受试者中pmd的存在。在一些实施方案中，样品可从根据β淀粉样蛋白对比成像未表现出皮质斑块或缠结的受试者获取。所述方法还可包括根据样品中可溶性错折叠蛋白质的存在来确定或诊断受试者中pmd的存在。在各种实施方案中，样品可从根据认知测试表现出痴呆临床征象的受试者获取。所述方法还可包括根据样品中可溶性错折叠蛋白质的存在来确定或诊断作为受试者的痴呆临床征象的促成因素的pmd的存在。在一些实施方案中，样品可包括下列的一种或多种：羊水；胆汁；血液；脑脊液；耳垢；皮肤；渗出液；排泄物；胃液；淋巴；乳汁；粘液，如鼻腔分泌物；粘膜，例如鼻粘膜；腹膜液；血浆；胸膜腔积液；脓液；唾液；皮脂；精液；汗液；滑液；泪液；尿液；等等。在若干实施方案中，所述方法可包括从受试者获取样品。受试者可为下列之一：人、小鼠、大鼠、狗、猫、牛、马、鹿、麋鹿、绵羊、山羊、猪或非人灵长类动物。非人类动物可以是野生的或驯养的。受试者可处于下列的一种或多种情况：处于pmd风险；患有pmd；处于针对pmd的治疗；处于具有与错折叠蛋白质的失调、错折叠、聚集或沉积相关联的疾病的风险；具有与错折叠蛋白质的失调、错折叠、聚集或沉积相关联的疾病；处于针对与错折叠蛋白质的失调、错折叠、聚集或沉积相关联的疾病的治疗；等等。在各种实施方案中，所述方法可包括通过将样品中可溶性错折叠蛋白质的量与相较于该样品在不同的时间从受试者获取的比较样品中的错折叠蛋白质的量进行比较来确定或诊断受试者的pmd的进展或稳态。在各种实施方案中，样品可从经历pmd疗法的患者获取。可采用pmca测定来确定哪些患者可用疗法来治疗。例如，通过多种机制来靶向aβ稳态的若干种新颖疗法目前正在开发中。可采用针对aβ低聚物的pmca测定来确定哪些患者可用pmd疾病调节疗法来治疗。在如通过pmca法所检测的aβ低聚物的水平上表现出变化如降低或增加的患者可归类为aβ调节疗法的“响应者”，并且可用降低aβ低聚物水平的疗法来治疗。缺乏异常aβ稳态的患者可归类为“无响应者”并且可能无法治疗。可因此鉴别出可受益于旨在调节aβ稳态的疗法的患者。另外，例如，通过多种机制来靶向αs稳态的若干种新颖疗法目前正在开发中。靶向αs稳态的治疗性方法可包括主动免疫如pd01a+或pd03a+或被动免疫如prx002。可采用针对αs低聚物的pmca测定来确定哪些患者可用αs调节疗法来治疗。在如通过pmca法所检测的αs低聚物的水平上表现出变化如降低或增加的患者可归类为αs调节疗法的“响应者”，并且可用降低αs低聚物水平的疗法来治疗。缺乏异常αs稳态的患者可归类为“无响应者”并且可能无法治疗。可因此鉴别出可受益于旨在调节αs稳态的疗法的患者。另外，例如，可使用pmca来测量来自患者的样品中的可溶性错折叠蛋白质的量。具有高的可溶性错折叠蛋白质测量值的患者可用调节可溶性错折叠蛋白质稳态的疗法来治疗。具有正常可溶性错折叠蛋白质测量值的患者可能无法治疗。可随访患者对旨在调节可溶性错折叠蛋白质稳态的疗法的响应。例如，可在疗法干预开始时测量患者样品中的可溶性错折叠蛋白质水平。在将患者的治疗进行临床上有意义的时段之后，可获得另一患者样品并且可测量可溶性错折叠蛋白质水平。在疗法干预之后表现出可溶性错折叠蛋白质水平的变化的患者可被认为对治疗有响应。表现出不变的可溶性错折叠蛋白质水平的患者可被认为是无响应的。所述方法可包括检测患者样品中包含可妨碍pmca反应的组分的可溶性错折叠蛋白质聚集体。在一些实施方案中，受试者可用pmd调节疗法来治疗。所述方法可包括将样品中可溶性错折叠蛋白质的量与比较样品中可溶性错折叠蛋白质的量进行比较。可在可溶性错折叠蛋白质调节疗法下的时段中的不同时间从受试者获取样品和比较样品。所述方法可包括确定或诊断受试者具有下列情况之一：根据所述时段中可溶性错折叠蛋白质的变化对可溶性错折叠蛋白质调节疗法有响应，或根据所述时段中可溶性错折叠蛋白质的稳态对可溶性错折叠蛋白质调节疗法无响应。所述方法可包括用可溶性错折叠蛋白质调节疗法来治疗经确定对可溶性错折叠蛋白质调节疗法有响应的受试者。对于ad，例如，pmd调节疗法可包括施用下列的一种或多种：bace1(β-分泌酶1)的抑制剂；γ分泌酶的抑制剂；和aβ稳态的调节剂，例如，aβ稳态的免疫调节剂。aβ调节疗法可包括施用下列的一种或多种：e2609；mk-8931；ly2886721；azd3293；司马西特(semagacestat)(ly-450139)；阿加西特(avagacestat)(bms-708163)；索拉珠单抗(solanezumab)；克雷内治单抗(crenezumab)；贝平珠单抗(bapineuzumab)；biib037；cad106；8f5或5598或针对aβ球聚体的其他抗体，例如barghorn等，“globularamyloidβ-peptide1-42oligomer--ahomogenousandstableneuropathologicalproteininalzheimer’sdisease”j.neurochem.,2005,95,834-847所述，该文献的全部教导内容据此以引用的方式并入本文；acc-001；v950；affitropead02；等等。对于pd，例如，pmd调节疗法可包括主动免疫如pd01a+或pd03a+、被动免疫如prx002等。pmd调节疗法还可包括使用下列药剂的治疗：gdnf(胶质细胞系衍生的神经营养因子)、肌苷、钙通道阻断剂，特别是cav1.3通道阻滞剂如伊拉地平(isradipine)、烟碱和烟碱受体激动剂、gm-csf、谷胱甘肽、ppar-γ激动剂如吡格列酮，和多巴胺受体激动剂，包括d2/d3多巴胺受体激动剂和lrrk2(富亮氨酸重复激酶2)抑制剂。在若干实施方案中，可使用pmca来测量来自患者的样品中的错折叠蛋白质的量。具有高的错折叠蛋白质测量值的患者可用针对pmd的疾病调节疗法来治疗。具有正常错折叠蛋白质测量值的患者可能无法治疗。可随访患者对疾病调节疗法的响应。例如，可在疗法干预开始时测量患者样品中的错折叠蛋白质水平。在将患者的治疗进行临床上有意义的时段之后，可获得另一患者样品并且可测量错折叠蛋白质水平。在疗法干预之后表现出错折叠蛋白质水平的变化的患者可被认为对治疗有响应。表现出不变的错折叠蛋白质水平的患者可被认为是无响应的。所述方法可包括检测患者样品中包含可妨碍pmca反应的组分的错折叠蛋白质聚集体。在若干实施方案中，所述方法可包括选择性地浓缩样品和孵育混合物的一种或多种中的可溶性错折叠蛋白质。所述选择性地浓缩可溶性错折叠蛋白质可包括在形成孵育混合物之前预处理样品。所述选择性地浓缩可溶性错折叠蛋白质可包括在对孵育混合物进行孵育之前预处理孵育混合物。所述选择性地浓缩可溶性错折叠蛋白质可包括使一种或多种特异性抗体与可溶性错折叠蛋白质接触以形成捕获的可溶性错折叠蛋白质。例如，对于ad，一种或多种可溶性错折叠蛋白质特异性抗体可包括下列的一种或多种：6e10、4g8、82e1、a11、x-40/42、16adv；等等。此类抗体可如下获得：6e10和4g8(covance,princeton,nj)；82e1(iblamerica,minneapolis,mn)；a11(invitrogen,carlsbad,ca)；x-40/42(mybiosource,inc.,sandiego,ca)；和16adv(acumenpharmaceuticals,livermore,ca)。另外，对于pd，例如，一种或多种可溶性错折叠蛋白质特异性抗体可包括pd特异性抗体，包括下列的一种或多种：α/β-突触核蛋白n-19；α-突触核蛋白c-20-r；α-突触核蛋白211；α-突触核蛋白syn204；α-突触核蛋白2b2d1；α-突触核蛋白lb509；α-突触核蛋白spm451；α-突触核蛋白3g282；α-突触核蛋白3h2897；α/β-突触核蛋白syn202；α/β-突触核蛋白3b6；α/β/γ-突触核蛋白fl-140；等等。在一些实施例中，一种或多种可溶性错折叠蛋白质特异性抗体可包括下列的一种或多种：α/β-突触核蛋白n-19；α-突触核蛋白c-20-r；α-突触核蛋白211；α-突触核蛋白syn204；等等。此类抗体可如下获得：α/β-突触核蛋白n-19(目录号sc-7012,santacruzbiotech,dallas,tx)；α-突触核蛋白c-20-r(sc-7011-r)；α-突触核蛋白211(sc-12767)；α-突触核蛋白syn204(sc-32280)；α-突触核蛋白2b2d1(sc-53955)；α-突触核蛋白lb509(sc-58480)；α-突触核蛋白spm451(sc-52979)；α-突触核蛋白3g282(sc-69978)；α-突触核蛋白3h2897(sc-69977)；α/β-突触核蛋白syn202(sc-32281)；α/β-突触核蛋白3b6(sc-69699)；或α/β/γ-突触核蛋白fl-140(sc-10717)。另外，一种或多种可溶性错折叠蛋白质特异性抗体可包括下列的一种或多种：对可溶性错折叠蛋白质的氨基酸序列具有特异性的抗体，和对可溶性错折叠蛋白质的构象具有特异性的抗体。一种或多种可溶性错折叠蛋白质特异性抗体可偶联至固相。固相可包括磁珠和多孔板中的一种或多种。例如，可通过用于从患者样品捕获可溶性错折叠蛋白质的抗体来涂覆elisa板。可用患者样品孵育抗体涂覆的elisa板，可洗掉未结合的材料，并且可进行pmca反应。抗体还可偶联至珠粒。可用珠粒孵育患者样品并用于将可溶性错折叠蛋白质-抗体复合物与患者样品的其余部分分离。在各种实施方案中，使样品与单体折叠蛋白质接触以形成孵育混合物可包括使摩尔过量的单体折叠蛋白质与包括捕获的可溶性错折叠蛋白质的样品接触。单体折叠蛋白质的摩尔过量可大于捕获的可溶性错折叠蛋白质中所包括的蛋白质单体的总摩尔量。对孵育混合物进行孵育可在捕获的可溶性错折叠蛋白质的存在下有效引起单体折叠蛋白质的至少一部分的错折叠和/或聚集，从而形成错折叠蛋白质的扩增部分。在一些实施方案中，蛋白质聚集体可包括下列的一种或多种：单体蛋白质、可溶性错折叠蛋白质以及可溶性错折叠蛋白质的捕获形式。在若干实施方案中，物理地破坏孵育混合物可包括下列的一种或多种：超声处理、搅拌、振荡、冷冻/解冻、激光辐照、高压釜孵育、高压、均质化等。例如，振荡可包括循环搅动。循环搅动可以约50转/分钟(rpm)至10,000rpm进行。循环搅动可以约200rpm至约2000rpm进行。循环搅动可以约500rpm进行。在各种实施方案中，物理地破坏孵育混合物可在每个孵育循环中进行介于约5秒和约10分钟之间、介于约30秒和约1分钟之间、介于约45秒和约1分钟之间、约1分钟等。例如，物理地破坏孵育混合物可在每个孵育循环中通过振荡进行下列的一个或多个时间：介于约5秒和约10分钟之间、介于约30秒和约1分钟之间、介于约45秒和约1分钟之间、约1分钟等。对孵育混合物进行孵育可在每个孵育循环中独立地进行以下时间：介于约5分钟和约5小时之间、介于约10分钟和约2小时之间、介于约15分钟和约1小时之间、介于约25分钟和约45分钟等。每个孵育循环可包括将孵育混合物独立地孵育且物理地破坏下列的一个或多个时间：孵育介于约5分钟和约5小时之间且物理地破坏介于约5秒和约10分钟之间；孵育介于约10分钟和约2小时之间且物理地破坏介于约30秒和约1分钟之间；孵育介于约15分钟和约1小时之间且物理地破坏介于约45秒和约1分钟之间；孵育介于约25分钟和约45分钟之间且物理地破坏介于约45秒和约1分钟之间；以及孵育约1分钟且物理地破坏约1分钟。进行孵育循环可重复介于约2次和约1000次之间、介于约5次和约500次之间、介于约50次和约500次之间、介于约150次和约250次之间等。对孵育混合物进行孵育可在每个孵育循环中在下列温度(℃)下独立地进：约15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃或任意两个前述值之间的范围，例如，介于约15℃和约50℃之间。在若干实施方案中，使样品与单体折叠蛋白质接触以形成孵育混合物可在生理条件下进行。使样品与单体折叠蛋白质接触以形成孵育混合物可包括使样品与摩尔过量的单体蛋白质接触。所述摩尔过量可大于样品中的可溶性错折叠蛋白质中所包括的蛋白质单体的总摩尔量。单体折叠蛋白质和/或可溶性错折叠蛋白质可包括例如由单体折叠蛋白质和/或可溶性错折叠蛋白质的蛋白水解裂解所形成的一种或多种肽。例如，对于ad，单体折叠蛋白质和/或可溶性错折叠蛋白质可包括经由淀粉样前体蛋白质的β-或γ-分泌酶裂解所形成的一种或多种肽。例如，对于ad，单体折叠蛋白质和/或可溶性错折叠蛋白质可包括下列的一种或多种：abeta40和abeta42。另外，例如，对于pd，单体折叠蛋白质和/或可溶性错折叠蛋白质可包括经由αs-140的蛋白水解裂解所形成的一种或多种肽。单体αs蛋白质和/或可溶性低聚αs蛋白质可包括下列的一种或多种：αs-140、αs-126、αs-112等。如本文所用，“αs-140”是指全长140个氨基酸α-突触核蛋白蛋白质。其他同种型可包括例如由于外显子3的丧失而缺少残基41-54的“αs-126”(α-突触核蛋白-126)，和例如由于外显子5的丧失而缺少残基103-130的“αs-112”(α-突触核蛋白-112)。在各种实施方案中，单体折叠蛋白质可由下列之一产生：化学合成、重组产生或从非重组生物样品提取。可溶性错折叠蛋白质可基本上为可溶性错折叠聚集体。错折叠蛋白质的扩增部分基本上为下列的一种或多种：可溶性错折叠聚集体的扩增部分和不溶性错折叠聚集体。在各种实施方案中，提供了用于确定样品中可溶性错折叠蛋白质的存在的试剂盒。所述试剂盒可包括已知量的单体折叠蛋白质和已知量的可溶性错折叠蛋白质的指示剂中的一种或多种。所述试剂盒可包括说明书。说明书可指导用户进行任何本文所述的方法。例如，说明书可指导用户使样品与已知量的单体折叠蛋白质和已知量的可溶性错折叠蛋白质的指示剂中的一种或多种接触以形成孵育混合物。说明书可指导用户进行孵育循环两次或更多次以有效形成错折叠蛋白质的扩增部分。每个孵育循环可包括对孵育混合物进行孵育以在可溶性错折叠蛋白质的存在下有效引起单体折叠蛋白质的至少一部分的错折叠和/或聚集，从而形成错折叠蛋白质的扩增部分。每个孵育循环可包括物理地破坏孵育混合物以有效分解所存在的任何蛋白质聚集体的至少一部分，例如以释放可溶性错折叠蛋白质。说明书可指导用户通过检测可溶性错折叠蛋白质来确定样品中可溶性错折叠蛋白质的存在。可溶性错折叠蛋白质可包括可溶性错折叠蛋白质和错折叠蛋白质的扩增部分。在各种实施方案中，所述试剂盒可包括已知量的单体折叠蛋白质和已知量的可溶性错折叠蛋白质的指示剂。所述试剂盒可包括下列的一种或多种：多壁微量滴定板；微流体板；振荡装置、孵育装置；和荧光测量装置；它们以单独的板或装置中的一个或多个被包括、或以组合装置被包括，等等。例如，振荡微板读数器可用于在实验过程中进行孵育和振荡循环并且自动测量tht荧光发射(例如fluostaroptima,bmglabtechinc.,cary,nc)。在试剂盒的若干实施方案中，可溶性错折叠蛋白质的指示剂的指示状态和非指示状态的特征可为荧光的差异。说明书可指导用户通过荧光光谱法来确定样品中可溶性错折叠蛋白质的存在。在试剂盒的一些实施方案中，可溶性错折叠蛋白质的指示剂可包括下列的一种或多种：硫磺素t、刚果红、m-i-均二苯代乙烯、柯胺g、pib、bf-227、x-34、tzdm、fddnp、meo-x-04、impy、niad-4、发光共轭聚噻吩、与荧光蛋白例如绿荧光蛋白和黄荧光蛋白的融合物、其衍生物等。单体折叠蛋白质可包括下列的一种或多种：共价结合的放射性氨基酸、共价结合的同位素标记的氨基酸和共价结合的荧光团等。在试剂盒的各种实施方案中，说明书可指导用户进行任何本文所述的方法。例如，说明书可包括指导用户确定样品中可溶性错折叠蛋白质的量的指南。说明书可指导用户通过进行下列的一种或多种来检测可溶性错折叠蛋白质：蛋白质印迹测定、斑点印迹测定、酶联免疫吸附测定(elisa)、硫磺素t结合测定、刚果红结合测定、沉淀测定、电子显微术、原子力显微术、表面等离子体共振、光谱法等。说明书可指导用户通过使孵育混合物与蛋白酶接触来检测可溶性错折叠蛋白质；以及使用抗错折叠蛋白质抗体以下列的一种或多种测定来检测可溶性错折叠蛋白质：蛋白质印迹测定、斑点印迹测定和elisa。在试剂盒的若干实施方案中，说明书可指导用户从受试者获取样品。说明书可包括指导用户根据样品中可溶性错折叠蛋白质的存在来确定受试者中pmd的存在。相较于从对照受试者获取的对照样品可确定样品中可溶性错折叠蛋白质的存在。说明书可指导用户通过将样品中可溶性错折叠蛋白质的量与预定阈值量进行比较来确定受试者中pmd的存在。说明书可指导用户获得样品，包括下列的一种或多种：羊水；胆汁；血液；脑脊液；耳垢；皮肤；渗出液；排泄物；胃液；淋巴；乳汁；粘液，如鼻腔分泌物；粘膜，例如鼻粘膜；腹膜液；血浆；胸膜腔积液；脓液；唾液；皮脂；精液；汗液；滑液；泪液；尿液；等等。说明书可指导用户通过将样品中可溶性错折叠蛋白质的量与相较于该样品在不同的时间从受试者获取的比较样品中的错折叠蛋白质的量进行比较来确定受试者的pmd的进展或稳态。说明书可指导用户选择性地浓缩样品和孵育混合物的一种或多种中的可溶性错折叠蛋白质。例如，所述试剂盒可包括被配置来选择性地浓缩或捕获可溶性错折叠蛋白质的一种或多种可溶性错折叠蛋白质特异性抗体。一种或多种可溶性错折叠蛋白质特异性抗体可包括下列的一种或多种：对可溶性错折叠蛋白质的氨基酸序列具有特异性的抗体，和对可溶性错折叠蛋白质的构象具有特异性的抗体。说明书可指导用户通过使一种或多种可溶性错折叠蛋白质特异性抗体与可溶性错折叠蛋白质接触以形成捕获的可溶性错折叠蛋白质来选择性地浓缩可溶性错折叠蛋白质。可提供一种或多种可溶性错折叠蛋白质特异性抗体来偶联至固相。固相可包括磁珠和多孔板中的一种或多种。在试剂盒的各种实施方案中，物理地破坏孵育混合物的说明书可指导用户采用下列的一种或多种：超声处理、搅拌、振荡、冷冻/解冻、激光辐照、高压釜孵育、高压、均质化等。说明书可指导用户根据本文所述的任一rpm范围，例如介于约50rpm和10,000rpm之间，来进行循环搅动。说明书可指导用户在每个孵育循环中根据本文所述的任一时间范围，例如介于约5秒和约10分钟之间，来进行物理破坏。说明书可指导用户在每个孵育循环中根据本文所述的任一时间范围，例如介于约5分钟和约5小时之间，来对孵育混合物进行孵育。用于进行孵育循环的说明书可指导用户将孵育循环进行本文所述的任意重复次数，例如，介于约2次和约1000次之间。用于进行孵育循环的说明书可包括让用于在介于约15℃和约50℃之间的温度下进行孵育的指南。在试剂盒的各种实施方案中，单体折叠蛋白质可由下列之一产生：化学合成、重组产生或从非重组生物样品提取。可溶性错折叠蛋白质可基本上为可溶性错折叠聚集体。错折叠蛋白质的扩增部分基本上为下列的一种或多种：可溶性错折叠聚集体的扩增部分和不溶性错折叠聚集体。实施例实施例1：合成aβ低聚物的制备在耶鲁大学(yaleuniversity)的w.keckfacility使用固相n-叔丁氧羰基化学物质来合成aβ1-42并且通过反相hplc进行纯化。将最终产物冻干并且通过氨基酸分析和质谱法来表征。为了制备不含聚集的错折叠aβ蛋白质的储液，将聚集体溶解(高ph)并且通过30kda截留过滤器过滤以去除剩余的聚集体。为了制备不同类型的聚集体，在0.1mtris-hcl(ph7.4)中在25℃下将无种子aβ1-42(10μm)的溶液在搅动下孵育不同的时间。此制备物包含aβ单体与原纤维、初原纤维和可溶性错折叠aβ蛋白质的根据孵育时间呈不同比例的混合物。聚集程度可通过下列来表征：tht荧光发射、负染色后的电子显微术、通过a11构象抗体的斑点印迹研究以及在凝胶电泳后使用4g8抗-aβ抗体的蛋白质印迹。不同大小的aβ低聚物的混合物在原纤维形成的过程中产生。具体地讲，通过在25℃下将单体合成aβ1-42(10μm)在搅拌下进行孵育来制备可溶性错折叠aβ蛋白质。在5h孵育后，在负染色后通过电子显微术观察到外观呈球状的大量可溶性错折叠aβ蛋白质，其中仅观察到少量的初原纤维和原纤维。在10h时主要为初原纤维，在24h时观察到大量的长原纤维。图1a示出在孵育的0h、5h、10h和24h获取的电子显微照片。根据kayed等“commonstructureofsolubleamyloidoligomersimpliescommonmechanismofpathogenesis,”science2003,300,486-489中的方法，使用a11抗低聚体特异性抗体测得可溶性错折叠aβ蛋白质聚集体为阳性。在10h和24h的进一步孵育后，观察到初原纤维结构和原纤维结构。在sds-page分离之后通过经由限定孔尺寸的过滤器的过滤和蛋白质印迹来确定聚集体的大小。将通过孵育5h所形成的可溶性错折叠aβ蛋白质保持在30kda截留过滤器中并且通过1000kda截留过滤器。图1b为可溶性错折叠aβ蛋白质聚集体的蛋白质印迹。此可溶性错折叠aβ蛋白质的电泳分离显示，大部分材料迁移为～170kda抗sds聚集体，其中次要带在17kda。实施例2：aβ-pmca检测合成aβ低聚物实施例2a.在硫磺素t的存在下采用或不采用不同量的合成的可溶性错折叠aβ蛋白质(对照(无aβ低聚物)；或合成的可溶性错折叠aβ蛋白质中3、80、300和8400飞摩尔(femtomolar))孵育无种子aβ1-42的溶液来研究aβ聚集的播种。aβ-pmca一般工序：将2μm无聚集体aβ1-42在0.1mtris-hclph7.4(200μl总体积)中的溶液置于不透明的96孔板并且单独孵育或在合成aβ聚集体(如实施例1中所述历经5h孵育而制备)或40μlcsf等分试样的存在下孵育。将样品在5μm硫磺素t(tht)的存在下孵育并且使用eppendorf热混合器在22℃的恒温下使其经受循环搅动(以500rpm进行1min，然后在无振荡的情况下进行29min)。在各时间点，在以435nm激发后，使用板荧光分光光度计测量板中485nm下的tht荧光。图2a为如通过硫磺素t荧光测量的淀粉样蛋白质形成(无循环扩增)相对于时间的图，其中使用指示飞摩尔浓度的合成的可溶性错折叠aβ蛋白质种子。对缓冲液的肽浓度、温度和ph进行监测以控制实验中的延滞期和再现性的程度。在这些条件下，在进行实验期间(125h)没有检测到自发aβ聚集。在0.3至8.4fmol实施例1的合成的可溶性错折叠aβ蛋白质的存在下观察到单体aβ1-42蛋白质的聚集。实施例2b：采用扩增循环、孵育和物理破坏的组合期。将与图2a中相同的样品在循环搅动(以500rpm进行1min，然后在无振荡的情况下进行29min)下进行孵育。使用板荧光分光光度计(激发：435；发射：485nm)，通过与淀粉样蛋白原纤维结合的硫磺素t(tht)来测量随时间推移的聚集。图示出3次重复的平均值和标准误差。估计aβ低聚物的浓度，假定平均分子量为170kda。图2b为示出针对各种浓度的实施例1的合成的可溶性错折叠aβ蛋白质，通过tht荧光测量的扩增循环加速的淀粉样蛋白质形成作为时间的函数的图。在这些条件下，由8400、300、80和3fmol合成的可溶性错折叠aβ蛋白质所诱发的单体aβ1-42蛋白质的聚集显然更快并且更易于与在不存在合成的可溶性错折叠aβ蛋白质时所观察到的聚集体分开。此结果表明这些条件下的检测限为给定样品中有3fmol可溶性错折叠aβ蛋白质或更少。实施例3：aβ-pmca检测ad患者的脑脊液中的错折叠aβ从50例ad患者、39例感染非神经变性疾病(nnd)的认知正常个体和37例感染非ad神经变性疾病(包括其他形式的痴呆)(nand)的患者获得csf的等分试样。测试csf样品从50例被诊断患有由dsm-iv和nincds-adra准则(mckhann等人，1984)所定义的可能性ad的患者获得，并且使用多种试验来确定，包括常规医学检查、神经学评估、神经心理学评价、磁共振成像以及对aβ1-42、总tau和磷酸化-tau的csf水平的测量。ad患者在样品收集时的平均年龄为为71.0±8.1岁(范围49-84)。从39例感染非神经变性疾病(nnd)的患者获得对照csf样品，所述39例患者包括12例正常压力脑积水、7例周围神经病患者、7例各种形式的脑肿瘤患者、2例ictus患者、1例重度头痛患者、3例脑炎患者、1例高血压患者和6例诊断不明患者。从该组患者获取csf样品时的平均年龄为64.6±14.7岁(范围31-83)。还从37名感染非ad神经变性疾病(nand)的个体获取对照csf样品，所述37名个体包括10例额颞痴呆症(5例行为变异，5例语言变异)、6例帕金森氏病患者(包括4例与痴呆相关的患者和1例患有运动神经元疾病的患者)、6例进行性核上性麻痹患者、6例脊髓小脑性共济失调患者(1例与痴呆相关的患者)、4例肌萎缩性侧索硬化患者、2例亨延顿氏舞蹈病患者、1例melas患者、1例路易体痴呆患者和1例血管性痴呆患者。该组在样品收集时的平均年龄为63.8±11.1岁(范围41-80)。在一晚上禁食后，用无创伤针在l4/l5或l3/l4间隙处进行腰椎穿刺，然后将csf样品收集在聚丙烯管中。将样品在4℃下以3,000g离心3min，分成等分试样并在-80℃下保存直至分析。确定csf细胞计数、葡萄糖和蛋白质浓度。通过速率散射比浊法来测量白蛋白。为了评估血脑屏障的完整性和鞘内igg产量，计算白蛋白商(csf白蛋白/血清白蛋白)×103和igg指数(csf白蛋白/血清白蛋白)/(csfigg/血清igg)。研究是根据helsinkideclaration的规定来进行并且由伦理委员会(ethicscommittee)批准。实验以及分析的初始部分设盲进行。图3a为根据tht荧光标记测量的淀粉样蛋白质形成相对于时间的图，该图示出来自ad组、nnd组和nand组的5个代表性样品的aβ聚集的平均动力学。结果表明与对照csf相比，来自ad患者的csf显著加速了aβ聚集(p<0.001)。通过单因素anova来分析在人csf样品存在下的aβ聚集动力学差异的显着性，接着进行tukey多重比较事后检验。将显著性水平设定为p<0.05。ad与来自其他两组的样品之间的差异非常显著，p<0.001(***)。图3b为来自ad组、nnd组和nand组的样品的延滞期时间(h)的图。为了确定各个样品对aβ聚集的效应，对延滞期进行估计，该延滞期被定义为在扣除对照缓冲液样品后达到大于40个任意单位的tht荧光的时间。选择此值是因为其对应于对照缓冲液样品的读数的约5倍。图3c为示出在180个aβ-pmca循环(即90h孵育(p90))之后获得的淀粉样蛋白质形成的程度的图。对实验组间的延滞期和p90的比较显示，ad与来自患有非神经变性疾病或患有非ad神经变性疾病的个体的对照样品之间具有显著性差异。另外，在聚集参数和ad患者年龄之间未检测到相关性，这表明标志物的水平对应于患者csf中的聚集的aβ蛋白质而非患者的年龄。图5表1示出对aβ-pmca试验的敏感性、特异性和预测值的估计，其中使用延滞期数值进行计算。为了研究再现性，独立地进行与图3a-c中所示实验类似的实验，采用的是不同的样品、试剂和一批新的aβ肽(作为aβ-pmca的底物)。测量每个患者的在300个aβ-pmca循环(即150h孵育(p150))后获得的淀粉样蛋白质形成的程度。对照组包括感染其他神经变性疾病的人和非神经性病变患者。每个样品的数据代表重复管的平均值。通过斯氏t检验(student-ttest)来分析统计学差异。图6为在300个aβ-pmca循环(即150h孵育(p90))之后获得的样品的延滞期时间(h)的图。在研究过程中，来自四个位置的整组csf样品完全没有聚集，甚至在掺入高浓度的合成低聚物后也是如此。预期是样品收集期间的试剂污染干扰了测定。通过估计各种动力学参数(包括延滞期、a50和p90)来评估不同样品间的聚集动力学差异。延滞期被定义为达到高于单独缓冲液背景值的5倍的tht荧光所需的时间。a50对应于达到最大聚集的50％的时间。p90对应于聚集在90h时的程度(以tht荧光测量)。使用此数据来确定敏感性、特异性和预测值，其中截留阈值使用medcalc软件(medcalcsoftware,ostend,belgium)通过接收者操作特征曲线(roc)曲线分析来确定。实施例4：针对csf中ad的aβ-pmca检测来确定错折叠aβ的阈值为支持图5表1，使用延滞期数据来确定敏感性、特异性和预测值，其中截留阈值使用medcalc软件(12.2.1.0版,medcalc,belgium)通过接收者操作特征曲线(roc)曲线分析来确定。如图5表1中所示，对由患有非神经变性疾病的年龄匹配个体组成的对照组估计为90.0％的敏感性和84.2％的特异性。相比之下，对ad与其他神经变性疾病(包括其他形式的痴呆)之间的临床上更具相关性的区别，估计为100％的敏感性和94.6％的特异性。aβ-pmca将ad与其他形式的神经变性疾病区分开的能力是有有临床意义的。考虑所有对照个体，总体敏感性和特异性分别为90％和92％。为了评估aβ-pmca试验将ad患者与对照区分开的性能，针对不同的截留点来绘制真阳性率(敏感性)作为假阳性率(特异性)的函数的图。为了此分析，使用ad相对于nand的延滞期值(图4a)、ad相对于nnd的延滞期值(图4b)以及ad相对于所有对照样品的延滞期值(图4c)。作为曲线下面积估计的试验性能对于ad与nand、nnd和所有所有对照的比较而言分别为0.996±0.0033、0.95±0.020和0.97±0.011。使用medcalcroc曲线分析软件(12.2.1.0版)来进行统计分析，并且结果表明试验可将ad与对照区分开，p<0.0001。为了估计不同组的组比较的最可靠的截留点，针对每个截留值对敏感性(蓝线)和特异性(红线)绘图(图4d)。图示出ad相对于所有对照样品(包括nand和nnd组)的曲线和为95％置信区间。使用这些截留值来估计图5表1中的敏感性、特异性和预测值。实施例5:aβ-低聚物免疫耗竭去除人脑脊液中的aβ种子并且证实aβ-pmca检测到adcsf中的可溶性错折叠aβ蛋白质进行免疫耗竭实验来证实aβ-pmca检测到与存在于csf中的可溶性错折叠aβ蛋白质相关联的播种活性。通过使用合成制备的可溶性错折叠aβ蛋白质对可溶性错折叠aβ蛋白质的有效免疫耗竭的方法进行了首次优化。通过用与特异性识别aβ序列(4g8)的抗体和构象(a11)抗体的混合物共轭的dynabeads孵育来进行免疫耗竭。图7a为示出使用掺入人csf中的合成制备的aβ低聚物的免疫耗竭结果的蛋白质印迹。可溶性错折叠aβ蛋白质通过此免疫耗竭被有效去除。图7a和7b为通过硫磺素t荧光测量的淀粉样蛋白质形成相对于时间的图，该图显示adcsf中的播种活性被可溶性错折叠aβ蛋白质免疫耗竭去除。在用4g8和a11抗体进行免疫耗竭之前或之后的adcsf样品用于在aβ-pmca测定中播种aβ聚集。对3adcsf施加免疫耗竭。图7b为示出对照样品和免疫耗竭的csf样品的动力学的图。图7b示出对于免疫耗竭的adcsf，aβ-pmca反应中的aβ聚集的动力学与在对照csf样品中观察到的动力学相当，这两者与采用免疫耗竭之前的adcsf所观察到的聚集显著不同。图7c为示出对照样品和免疫耗竭的csf样品的动力学的图，其中所述样品仅用a11构象抗体进行耗竭并且通过aβ-pmca测定来监测聚集。图7c示出通过使用由特异性识别错折叠aβ的a11构象抗体免疫耗竭的adcsf所获得的类似结果。这些结果证实aβ-pmca检测到adcsf中的可溶性错折叠β蛋白质。实施例6：固相免疫捕获图8a和图8b为用于从复杂样品例如血浆捕获可溶性错折叠aβ蛋白质的两种固相法的示意图。策略1采用以特异性抗体预涂覆的elisa板，所述特异性抗体结合至elisa板上的固相。将板洗涤后，在相同的板上进行aβ-pmca反应。策略2使用磁珠作为涂覆有特异性抗体的固相。此方法提供了样品的浓度。实施例7：免疫捕获的特异性图9示出表2，示出特异性抗体捕获aβ低聚物的能力。顶图示出在本研究中使用的不同序列的抗体的aβ蛋白质上的表位识别位点的示意图。图9中的表2示出不同序列或构象的抗体捕获aβ低聚物的效率。通过将合成aβ低聚物掺入健康人血浆中并通过aβ-pmca进行检测来测量捕获低聚物的能力。符号指示使用不同抗体的检测限为：<12fmol(+++)；介于10-100fmol(++)；>1pmol(+)以及未显著高于无捕获试剂时的值(-)。实施例8：掺入人血浆的aβ低聚物的检测图10为如通过硫磺素t荧光测量的淀粉样蛋白质形成相对于时间的图，该图示出对掺入人血浆中的可溶性错折叠aβ蛋白质的检测。将预涂覆蛋白质g的elisa板用抗构象抗体(来自acumen的16adv)涂覆。之后，将板用人血浆(100μl)孵育，所述人血浆保持原样(对照)或掺有不同浓度的合成的可溶性错折叠aβ蛋白质。在孵育后，使板在aβ40单体(2μm)和tht(5μm)的存在下经受aβ-pmca(29分钟孵育和30秒振荡)。通过硫磺素荧光来测量淀粉样蛋白质形成。图10示出用3种不同的抗体(以相似的方式起作用)进行的若干实验。实施例9：来自ad患者样品相对于对照的可溶性错折叠aβ的捕获图11为示出在来自ad患者和对照的血浆样品中在aβ-pmca测定中达到50％聚集的时间的图。来自患者的血浆样品感染ad、非ad神经变性疾病(nad)，并且将健康对照用抗-aβ抗体(82e1)涂覆的珠粒来孵育。如实施例2中所述进行aβ-pmca。在每一组的各个患者中记录达到50％聚集所需的时间。差异通过通过单因素anova来分析，接着进行tukey事后检验(post-hoctest)。此数据的roc分析表明82％的敏感性和100％的特异性用于正确地鉴别ad患者和对照。实施例10：超声处理和振荡对各种检测方法均有效图12为示出通过使用超声处理而非振荡作为破碎聚集体的方式而获得的aβ聚集扩增的结果的蛋白质印迹。实验在不同量的合成aβ低聚物的存在下进行。将10μg/ml无种子单体aβ1-42的样品单独孵育(泳道1)，或与300fmol错折叠aβ一起孵育(泳道2)、与30fmol错折叠aβ一起孵育(泳道3)以及与3fmol错折叠aβ一起孵育(泳道4)。将样品冷冻而不扩增(未扩增)或经受96个pmca循环(扩增)，各自包括30分钟孵育，接着20秒超声处理。在将样品用蛋白酶k(pk)处理后通过使用抗-aβ抗体的蛋白质印迹来检测聚集的aβ。在我们的实验中，观察到使用硫磺素t荧光进行检测与超声处理不相容，但与作为物理破坏方法的振荡有非常好的协作。图12示出对于aβ聚集体使用不同的检测方法(在此情况中为蛋白质印迹)，超声处理与振荡一样地起作用。实施例11：作为pmca底物的单体aβ的产生通过尺寸排阻色谱法获得无种子单体aβ。简言之，将在二甲亚砜中制备的1mg/ml肽溶液的等分试样用superdex75柱进行分级，其中用ph7.5的10mm磷酸钠以0.5ml/min进行洗脱。通过220nm下的uv吸光度来检测峰。收集对应于4-10kda分子量的含有aβ的单体/二聚体的峰并且通过氨基酸分析来确定浓度。将样品在-80℃下冻干。实施例12：aβ的产生和纯化使具有pet28groes-ub-aβ42质粒的大肠杆菌细胞在37℃下在luria肉汤(lb)中生长，并且用0.4mmiptg诱发表达。4h后，将细胞收获并在裂解缓冲液(20mmtris-cl,ph8.0,10mmnacl,0.1mmpmsf,0.1mmedta和1mmβ-巯基乙醇)中裂解，然后以18,000rpm离心30min。将包涵体重悬于包含6m脲的重悬缓冲液(50mmtris-cl,ph8.0,150mmnacl和1mmdtt)中。通过以18,000rpm离心30min来去除不溶性蛋白质。将收集包含groes-ub-aβ42融合蛋白质的上清液。为了从融合蛋白质裂解掉aβ42，将融合蛋白质用重悬缓冲液进行2倍稀释，并且在37℃下用重组去泛素化酶(usp2cc)(酶与底物的摩尔比率为1:100)处理2h。之后，将样品加载到c18柱(25mm×250mm,gracevydac,usa)上。将aβ42用溶剂体系缓冲液1(30mm醋酸铵,ph10,2％乙腈)和缓冲液2(70％乙腈)(缓冲液2：20-40％线性梯度)以流速10ml/min使用缓冲液的20-40％线性梯度进行35min纯化。将纯化的aβ42冻干并并在-80℃下保存直至使用。实施例13：通过pd-pmca检测αs种子图13a：通过在硫磺素t的存在下采用或不采用不同量的合成的可溶性低聚αs蛋白质：对照(无αs低聚物)；或1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml和1μg/ml合成的可溶性低聚αs蛋白质种子对无种子αs的溶液进行孵育来研究αs聚集的播种。αs-pmca一般工序：将100μg/mlαs无种子αs在pbs,ph7.4(200μl总体积)中的溶液置于不透明的96孔板并且单独孵育或在指示浓度的合成αs聚集体或40μlcsf等分试样的存在下孵育。将样品在5μm硫磺素t(tht)的存在下孵育并且使用eppendorf热混合器在22℃的恒温下使其经受循环搅动(以500rpm进行1min，然后在无振荡的情况下进行29min)。在各时间点，在以435nm激发后，使用板荧光分光光度计测量板中485nm下的tht荧光。图13a为硫磺素t荧光相对于时间的图，该图示出通过pd-pmca对αs种子的检测，其中使用指示浓度的合成的可溶性低聚αs蛋白质种子。对缓冲液的肽浓度、温度和ph进行监测以控制实验中的延滞期和再现性的程度。在1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml和1μg/ml合成的可溶性低聚αs蛋白质种子的αs的存在下观察到单体αs蛋白质的聚集。图13b：使用实施例1a中的样品来确定作为αs种子的添加量的函数的达到50％聚集的时间。图13b为示出被绘制作为αs种子的添加量的函数的达到50％聚集的时间的图。实施例14：αs-pmca检测pd患者的脑脊液中的低聚αs对来自对照和pd患者的人csf样品中播种活性的检测通过pd-pmca来进行。在来自患有确认的pd、ad或非神经变性疾病(nnd)的人患者的csf的存在下，在37℃下使pbs(ph7.4)中的纯化的无种子α-突触核蛋白(100μg/ml)在振荡下以500rpm聚集。在以435nm激发后，使用板荧光分光光度计通过485nm下的硫磺素荧光来监测聚集程度。csf等分试样得自pd患者、感染非神经变性疾病(nnd)的认知正常的个体以及感染阿尔茨海默氏病(ad)的患者。测试csf样品从被诊断患有由dsm-iv所定义的可能性pd的患者获得，并且使用多种试验来确定，包括常规医学检查、神经学评估、神经心理学评价以及磁共振成像。在一晚上禁食后，用无创伤针在l4/l5或l3/l4间隙处进行腰椎穿刺，然后将csf样品收集在聚丙烯管中。将样品在4℃下以3,000g离心3min，分成等分试样并在-80℃下保存直至分析。确定csf细胞计数、葡萄糖和蛋白质浓度。通过速率散射比浊法来测量白蛋白。为了评估血脑屏障的完整性和鞘内igg产量，计算白蛋白商(csf白蛋白/血清白蛋白)×103和igg指数(csf白蛋白/血清白蛋白)/(csfigg/血清igg)。研究是根据helsinkideclaration的规定来进行并且由伦理委员会(ethicscommittee)批准。实验以及分析的初始部分设盲进行。图14为根据tht荧光标记测量的αs低聚相对于时间的图，该图示出由来自pd组、ad组和nnd组的代表性样品的αs聚集的平均动力学。结果表明与对照csf相比，来自pd患者的csf显著加速了αs聚集(p<0.001)。通过单因素anova来分析在人csf样品存在下的αs聚集动力学差异的显着性，接着进行tukey多重比较事后检验。将显著性水平设定为p<0.05。pd与来自其他两组的样品之间的差异非常显著，p<0.001(***)。实施例15：免疫捕获的特异性图15示出表3，示出不同的序列或构象抗体捕获αs低聚物的能力。通过将合成αs低聚物掺入健康人血浆中并通过αs-pmca进行检测来测量捕获低聚物的能力。第一列示出所测试的各种抗体和相应的商业来源。第二列列出本研究中使用的不同序列的抗体的αs蛋白上的表位识别位点。第三列示出所观察到的特异性抗体捕获αs低聚物的能力。符号指示使用不同抗体的检测限为：<12fmol(+++)；介于10-100fmol(++)；>1pmol(+)以及未显著高于无捕获试剂时的值(-)。α/β-突触核蛋白抗体n-19(n-末端表位)和α-突触核蛋白抗体c-20-r(c-末端表位)显示出最佳结果；并且α-突触核蛋白抗体211(表位：氨基酸121-125)显示出非常好的结果；α-突触核蛋白抗体204(表位：片段1-130)显示出良好的结果；16adv小鼠igg1(构象表位)显示出无结果。实施例16：固相免疫捕获图16a和16b为用于从复杂样品例如血浆捕获可溶性错折叠αs蛋白质的两种固相法的示意图。策略1采用以特异性抗体预涂覆的elisa板，所述特异性抗体结合至elisa板上的固相。将板洗涤后，在相同的板上进行αs-pmca反应。策略2使用磁珠作为涂覆有特异性抗体的固相。此方法提供了样品的浓度。实施例17：用于检测掺入人血浆的α-突触核蛋白低聚物的αs-pmca对来自人血浆的α-突触核蛋白低聚物的免疫沉淀通过抗-α-突触核蛋白抗体涂覆的珠粒(dynabeads)进行，并且播种聚集测定使用作为播种底物的α-突触核蛋白单体以及硫磺素-t以供检测。将抗-α-突触核蛋白涂覆的珠粒(1×107个珠粒)用含有α-突触核蛋白种子(+0.2μg种子)以及不含α-突触核蛋白种子(-种子)的人血浆(500μl)来孵育。在免疫沉淀后，将珠粒重悬于20μl反应缓冲液(1xpbs)中，并将10μl珠粒加入96孔板的每个孔中。通过添加α-突触核蛋白单体(200μg/ml)和硫磺素-t(5μm)来进行聚集测定。通过使用435nm激发和485nm发射以荧光计来监测荧光的增加。图17a示出采用含有或不含种子的血浆中的n-19抗体得到的免疫沉淀/聚集结果。图17b示出采用含有或不含种子的血浆中的211抗体得到的免疫沉淀/聚集结果。图17c示出采用含有或不含种子的血浆中的c-20抗体得到的免疫沉淀/聚集结果。实施例18：αs-pmca以高敏感性和特异性检测感染pd和多系统萎缩的患者的脑脊液中的低聚αs。为了研究αs-pmca对pd和相关α-突触核蛋白病如多系统萎缩(msa)的生化诊断效率，对来自感染这些疾病的许多患者以及感染其他疾病控的对照的csf进行试验。图18a、18b和18c示出使用αs-pmca来检测分别来自对照和感染pd和msa的患者的人csf样品中的播种活性。在来自人患者和对照的csf的存在下，在37℃下使缓冲液mes(ph6.0)中的纯化的无种子α-突触核蛋白(100μg/ml)在振荡下以500rpm聚集。在以435nm激发后，使用板荧光分光光度计通过485nm下的硫磺素t荧光来监测聚集程度。测试csf样品从被诊断患有由dsm-iv所定义的可能性pd和msa的患者获得，并且使用多种试验来确定，包括常规医学检查、神经学评估、神经心理学评价以及磁共振成像。在一晚上禁食后，用无创伤针在l4/l5或l3/l4间隙处进行腰椎穿刺，然后将csf样品收集在聚丙烯管中。将样品在4℃下以3,000g离心3min，分成等分试样并在-80℃下保存直至分析。确定csf细胞计数、葡萄糖和蛋白质浓度。通过速率散射比浊法来测量白蛋白。研究是根据helsinkideclaration的规定来进行并且由伦理委员会(ethicscommittee)批准。实验以及分析的初始部分设盲进行。图18a、18b和18c为根据tht荧光标记测量的αs低聚相对于时间的图，这些图分别示出对照和来自pd组和msa组的两个代表性样品的αs聚集的平均动力学。结果表明与对照csf相比，来自pd患者的csf显著加速了αs聚集(p<0.001)。通过单因素anova来分析在人csf样品存在下的αs聚集动力学差异的显着性，接着进行tukey多重比较事后检验。将显著性水平设定为p<0.05。pd与来自其他两组的样品之间的差异非常显著，p<0.001(***)。全组29个pd或msa样品以及41个对照的结果是为29个pd或msa样品中有26个样品是阳性的，而41个对照样品中有3个样品是阳性的，这对应于90％的敏感性和93％的特异性。就术语“包括”用于说明书或权利要求书的程度而言，其旨在是以与术语“包含”在权利要求书中作为过渡词采用时所被解释的类似的方式是包含性的。另外，就采用术语“或”(例如，a或b)的程度而言，其旨在表示“a或b或两者”。当申请人旨在表示“仅a或b而非两者”时，则将采用术语“仅a或b而非两者”。因此，在本文中使用术语“或”是包含性的，而不是排他性使用。参见bryana.garner,adictionaryofmodernlegalusage624(第2版1995)。另外，就术语“位于……中”或“进入……中”用于说明书或权利要求书中的程度而言，其旨在另外表示“位于……上”或“到……上”。此外，就术语“选择性地”用于说明书或权利要求书中的程度而言，其旨在指部件的一种状况，在该状况下装置的使用者可根据装置使用中的必要或需要而激活或停用该部件的特征或功能。就术语"可操作地连接"用于说明书或权利要求书中的程度而言，其旨在表示所识别的部件是以执行指定功能的方式连接的。就术语"基本上"用于说明书或权利要求书中的程度而言，其旨在表示所识别的部件具有如在本行业中可接受的误差程度指示的关系或量。如说明书和权利要求书中所使用的那样，单数形式"一个"，"一种"和"该/所述"包括复数个指代物，除非单数被明确规定。例如，对“化合物”的提及可包括两种或多种化合物的混合物，以及单个化合物。如本文所用，术语"约"与数字结合使用时旨在包括该数字±10％范围内的数字。换句话说，"约10"可意味着9至11。如本文所用，术语“任选的”和“任选地”表示之后描述的事件可能发生或不发生，使得该说明包括所述事件发生的情况和不发生的情况。此外，在根据马库什组描述公开内容的特征或方面时，本领域技术人员将认识到，该公开内容也由此在马库什组的任何单独的成员或子组成员方面得以描述。如将由本领域技术人员所理解的，出于任何及所有目的，如在提供书面描述方面，本文公开的所有范围也涵盖任何以及所有可能的子范围及其子范围的组合。任何所列出的范围可被容易地认为充分描述了该范围并允许该范围再分成至少相等的两份、三份、四份、五份、十份等。作为非限制性实例，本文讨论的每个范围可容易地再分成下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如将由本领域技术人员所理解的，所有诸如“高达”、“至少”、“大于”、“小于”的语言包括所述及的数值并且指的是这样的范围，该范围可随后如上文所讨论分成子范围。最后，如将由本领域技术人员所理解的，范围包括每个单独的成员。例如，具有1-3个单元的组是指具有1、2或3个单元的组。类似地，具有1-5个单元的组是指具有1、2、3、4或5个单元的组，等等。虽然已在本文中公开了各个方面和实施方案，但其他方面和实施方案对于本领域技术人员将是明显的。如上所述，虽然本申请已通过描述其实施方案来示出，并且虽然实施方案已相当详细地描述，但是申请人不意图将所附权利要求的范围限定或以任何方式限制于此类细节。其他优点和修改对于受益于本申请的本领域技术人员来说是显而易见的。因此，本申请在它的更广泛的方面中，不限于具体细节、所示出的说明性实施例或所涉及的任何装置。可背离此类细节、实施例和装置，但不背离一般发明概念的精神或范围。本文公开的各个方面和实施方案是为了举例说明的目的而不是意在限制，真正的范围和精神由所附权利要求来指定。当前第1页12当前第1页12