用于核酸单克隆簇的产生和测序的方法和阵列与流程
本申请要求2014年11月11日提交的美国临时申请号62/078,346和2014年12月23日提交的美国临时申请号62/096,464的优先权，这些申请以其整体并入本文。
领域
本公开内容涉及分子生物学领域，并且更具体地涉及用于在固体表面上捕获和扩增靶多核苷酸的方法。
背景
下一代测序已经使得能够进行全基因组测序和全基因组分析。下一代测序方法通常依赖于基因组片段的通用扩增，其首先配备通用扩增区域，并且然后在固体表面上通过通用捕获引物不加选择地捕获。通用捕获引物介导多核苷酸捕获和桥式扩增二者，这是下一代测序方法中的有用元素(参见，例如，wo2011/025477a1、us2011/0172119a1)。
虽然许多现有的方法能够有效地支持整个基因组的测序，但它们通常不允许特定多核苷酸的靶向捕获，并且因此通常不支持例如部分基因组的靶向测序。然而，对促进例如生物体外显子或转录组的特定部分的靶向测序的方法存在日益增长的需求。这种需求部分由成本驱动，但也受数据处理的考虑驱动。
因此，对使得能够实现部分基因组的靶向下一代测序的新方法存在需求。本公开内容通过提供用于修饰表面上的固定的捕获引物的方法来满足这种需求。还提供了相关优势。
概述
本文提供了修饰固定的捕获引物的微阵列和方法。
在一方面，本文提供了一种微阵列，所述微阵列包括：a)基底，所述基底包括至少一个孔、围绕孔的表面和内部孔表面；b)第一层，所述第一层覆盖内部孔表面并包含至少一种第一捕获引物对；以及c)第二层，所述第二层覆盖第一层和围绕孔的表面。
在一些实施方案中，孔的直径小于约1μm。
在一些实施方案中，孔的直径是约400nm。
在一些实施方案中，至少一种第一捕获引物对是多种第一捕获引物对。
在一些实施方案中，至少一种第一捕获引物对的引物包含通用捕获区域。
在一些实施方案中，至少一种第一捕获引物对的引物还包含测序引物结合位点(sbs)。
在一些实施方案中，第二层包含至少一种第二捕获引物对。
在一些实施方案中，至少一种第二捕获引物对是多种第二捕获引物对。
在一些实施方案中，至少一种第二捕获引物对的引物在3’-末端被封闭。
在一些实施方案中，至少一种第二捕获引物对的引物为3’-磷酸封端的(3’-phosphate-terminated)。
在一些实施方案中，至少一种第二捕获引物对的3’-磷酸封端的引物包含通用捕获区域。
在一些实施方案中，至少一种第二捕获引物对的引物在3’-末端不被封闭。
在一些实施方案中，至少一种第二捕获引物对的引物包含通用捕获区域。
在一些实施方案中，多种第一捕获引物对的多种捕获引物各自被附接至靶多核苷酸。
在一些实施方案中，多种靶多核苷酸在至少一个孔中形成靶多核苷酸的单克隆群体。
在一些实施方案中，至少一个孔包括多个孔，并且其中多个孔的两个或更多个孔包含靶多核苷酸的单克隆群体。
在一些实施方案中，多个孔的两个或更多个孔包含相同靶多核苷酸的单克隆群体。
在一些实施方案中，多个孔的两个或更多个孔包含两种或更多种不同靶多核苷酸的单克隆群体。
在一些实施方案中，至少一种第一捕获引物对是多种第一捕获引物对，并且至少一种第二捕获引物对是多种第二捕获引物对，并且其中多种第一捕获引物对和多种第二捕获引物对中的多种引物被附接至多种靶多核苷酸。
在一些实施方案中，多种靶多核苷酸在至少一个孔中形成靶多核苷酸的单克隆群体。
在一些实施方案中，至少一个孔是多个孔，并且其中多个孔的两个或更多个孔包含靶多核苷酸的单克隆群体。
在一些实施方案中，多个孔的两个或更多个孔包含相同靶多核苷酸的单克隆群体。
在一些实施方案中，多个孔的两个或更多个孔包含两种或更多种不同靶多核苷酸的单克隆群体。
在另一方面，本文提供了一种微阵列，所述微阵列包括：a)基底，所述基底包括至少一个孔、围绕孔的表面和内部孔表面；和b)层，所述层覆盖内部孔表面并包含至少一种第一捕获引物对和至少一种第二捕获引物对。
在一些实施方案中，如权利要求38所述的微阵列，其中所述孔的直径为约1μm或更大。
在一些实施方案中，至少一种第一捕获引物对是多种第一捕获引物对。
在一些实施方案中，至少一种第二捕获引物对是多种第二捕获引物对。
在一些实施方案中，至少一种第一捕获引物对的引物包含通用捕获区域。
在一些实施方案中，至少一种第二捕获引物对的引物包含通用捕获区域和sbs。
在一些实施方案中，至少一种第一捕获引物对是多种第一捕获引物对，并且至少一种第二捕获引物对是多种第二捕获引物对，并且其中多种第一捕获引物对和多种第二捕获引物对中的多种引物被附接至多种靶多核苷酸。
在一些实施方案中，多种靶多核苷酸在至少一个孔中形成靶多核苷酸的单克隆群体。
在一些实施方案中，至少一个孔是多个孔，并且其中多个孔的两个或更多个孔包含靶多核苷酸的单克隆群体。
在一些实施方案中，多个孔的两个或更多个孔各自包含相同靶多核苷酸的单克隆群体。
在一些实施方案中，多个孔的两个或更多个孔包含两种或更多种不同靶多核苷酸的单克隆群体。
在另一方面，本文提供了一种用于扩增核酸的方法，所述方法包括：a)在基底上产生第一层，其中基底包括至少一个孔、围绕孔的表面和内部孔表面，其中第一层覆盖内部孔表面；b)在第一层中沉积至少一种第一捕获引物对；c)在基底上产生第二层，所述第二层覆盖第一层和围绕孔的表面；d)使包含多种靶多核苷酸的样品与基底在足以使靶多核苷酸与至少一种第一捕获引物对的捕获引物杂交的条件下接触，以及e)进行第一动力学排除测定(kea)以从孔内的靶多核苷酸产生扩增子的克隆群体，从而扩增靶多核苷酸。
在一些实施方案中，使包含多种靶多核苷酸的样品与基底在足以使每孔单个靶多核苷酸(singletargetpolynucleotideperwell)与至少一种第一捕获引物对的捕获引物杂交的条件下接触。
在一些实施方案中，第一kea从与至少一个孔中的捕获引物杂交的单个靶多核苷酸产生扩增子的单克隆群体。
在一些实施方案中，至少一个孔是多个孔，并且从多个孔的两个或更多个孔中的单个靶多核苷酸产生扩增子的单克隆群体。
在一些实施方案中，从多个孔的两个或更多个孔中的相同单个靶多核苷酸产生扩增子的单克隆群体。
在一些实施方案中，从多个孔的两个或更多个孔中的两种或更多种单个靶多核苷酸产生扩增子的单克隆群体。
在一些实施方案中，至少一种第一捕获引物对是多种第一捕获引物对。
在一些实施方案中，该方法还包括在第二层中沉积至少一种第二捕获引物对。
在一些实施方案中，至少一种第二捕获引物对是多种第二捕获引物对。
在一些实施方案中，在进行第一kea之前沉积至少一种第二捕获引物对。
在一些实施方案中，至少一种第一捕获引物对的引物包含通用捕获区域。
在一些实施方案中，多种靶多核苷酸侧翼为一个或更多个互补的通用捕获区域。
在一些实施方案中，至少一种第二捕获引物对的引物在3’-末端被封闭。
在一些实施方案中，3’-封闭的引物包含通用捕获区域。
在一些实施方案中，该方法还包括在进行第一kea之后使至少一种第二捕获引物对的引物去封闭。
在一些实施方案中，使用t4-激酶使至少一种第二捕获引物对的引物去封闭。
在一些实施方案中，该方法还包括进行桥式扩增或第二kea以扩大靶多核苷酸扩增子的克隆群体。
在一些实施方案中，第一捕获引物对的引物还包含sbs。
在一些实施方案中，多种靶多核苷酸侧翼为一个或更多个互补sbs。
在一些实施方案中，至少一种第二捕获引物对的引物在3’-末端是未封闭的。
在一些实施方案中，至少一种第二引物对的引物包含通用捕获区域。
在一些实施方案中，第一kea进行延长的时间段以扩大扩增子的克隆群体超出至少一个孔。
在一些实施方案中，在进行第一kea之后沉积至少一种第二捕获引物对。
在一些实施方案中，至少一种第一捕获引物对和至少一种第二捕获引物对的引物包含通用捕获区域。
在一些实施方案中，该方法还包括进行桥式扩增或第二kea以扩大靶多核苷酸扩增子的克隆群体超出至少一个孔。
在另一方面，本文提供了一种用于扩增核酸的方法，所述方法包括：a)在基底上产生第一层，其中基底包括至少一个孔、围绕孔的表面和内部孔表面，其中第一层至少部分地覆盖内部孔表面；b)在第一层中沉积至少一种第一捕获引物对，其中第一捕获引物对包括多种第一捕获引物和多种第二捕获引物，所述多种第一捕获引物包含含
在另一方面，本文提供了一种用于扩增核酸的方法，所述方法包括：a)在基底上产生第一层，其中基底包括至少一个孔、围绕孔的表面和内部孔表面，其中第一层至少部分地覆盖内部孔表面；b)在第一层中沉积至少一种第一捕获引物对，其中第一捕获引物对包括多个至少一种第一捕获引物和多个至少一种第二捕获引物，所述多个至少一种第一捕获引物包含含
在另一方面，本文提供了一种用于扩增核酸的方法，所述方法包括：a)在基底上产生第一层，其中基底包括至少一个孔、围绕孔的表面和内部孔表面，其中第一层至少部分地覆盖内部孔表面；b)在第一层中沉积至少一种第一捕获引物对，其中第一引物对包括多种第一捕获引物和多种第二捕获引物，所述多种第一捕获引物包含含
在另一方面，本文提供了一种用于扩增核酸的方法，所述方法包括：a)在基底上产生层，其中基底包括至少一个孔、围绕孔的表面和内部孔表面，其中孔具有约1μm或更大的直径，并且其中层至少部分地覆盖内部孔表面；b)在层中沉积至少一种第一捕获引物对和至少一种第二捕获引物对，其中至少一种第一捕获引物对的引物密度高于所述至少第二引物对的引物密度；c)使包含多种靶多核苷酸的样品与基底在足以使每孔的单个靶多核苷酸与第二引物杂交的条件下接触，以及d)进行kea以从与孔内的第二引物杂交的单个靶多核苷酸产生扩增子的单克隆群体，从而扩增单个靶多核苷酸。
在另一方面，本文提供了一种用于修饰固定的捕获引物的方法，所述方法包括：a)使包含多种固定的捕获引物的基底与多种模板核酸在足以杂交的条件下接触以产生一种或更多种固定的模板核酸，其中，多种固定的捕获引物包括第一多种引物和第二多种引物，所述第一多种引物包含5’-末端通用捕获区域y，所述第二多种引物包含3’-末端通用捕获区域z，并且其中每一种模板核酸侧翼为5’-末端和3’-末端通用捕获区域y或z，并且包含一个或更多个限制性位点和在5’-末端通用捕获区域和一个或更多个限制性位点之间或在3’-末端通用捕获区域和一个或更多个限制性位点之间的靶特异性捕获区域，以及b)延伸一种或更多种固定的捕获引物以产生与一种或更多种模板核酸互补的一种或更多种固定的延伸产物。
在一些实施方案中，每一种模板核酸的靶特异性捕获区域位于5’-末端通用捕获区域和一个或更多个限制性位点之间。
在一些实施方案中，每一种模板核酸包含两个限制性位点和在两个限制性位点之间的间隔区域。
在一些实施方案中，两个限制性位点是sapi位点。
在一些实施方案中，间隔区域包括约150个碱基。
在一些实施方案中，基底是包括多个垫的图案化流通池。
在一些实施方案中，每一个垫包括第一多种固定的通用捕获引物和第二多种固定的通用捕获引物，所述第一多种固定的通用捕获引物包含3’-末端通用捕获区域y，所述第二多种固定的通用捕获引物包含3’-末端通用捕获区域z。
在一些实施方案中，多个垫的每个垫产生单个固定的延伸产物。
在一些实施方案中，每个垫产生的单个固定的延伸产物与多个垫的所有垫中的相同模板核酸互补。
在一些实施方案中，每个垫产生的单个固定的延伸产物与多个垫的两个或更多个垫中的两种或更多种不同的模板核酸互补。
在一些实施方案中，每个垫产生的单个固定的延伸产物与多个垫的垫的至少1％、至少3％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的每一个中的不同模板核酸互补。
在一些实施方案中，单个固定的延伸产物在多于1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的垫中产生。
在一些实施方案中，单个固定的延伸产物在小于100％、95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％或1％的垫中产生。
在一些实施方案中，该方法还包括通过聚合酶链式反应(pcr)扩增一种或更多种固定的延伸产物以产生固定的双链模板核酸的一种或更多种单克隆簇。
在一些实施方案中，通过pcr扩增包括桥式扩增或kea。
在一些实施方案中，该方法还包括使固定的双链模板核酸的一种或更多种单克隆簇与限制性酶接触以切割多种固定的双链模板核酸中的一个或更多个限制性位点以产生多种固定的双链嵌合捕获引物(immobilizeddouble-strandedchimericcaptureprimer)和多种双链固定的再生通用捕获引物(double-strandedimmobilizedregenerateduniversalcaptureprimers)，所述多种固定的双链嵌合捕获引物包含通用捕获区域和靶特异性捕获区域。
在一些实施方案中，该方法还包括热变性多个固定的双链嵌合捕获引物和双链固定的再生通用捕获引物以产生多种单链固定的嵌合捕获引物和单链固定的再生通用捕获引物。
在一些实施方案中，该方法还包括使多个固定的双链嵌合捕获引物和双链固定的再生通用捕获引物与5’-3’双链脱氧核糖核酸(dsdna)外切核酸酶接触以产生多种单链固定的嵌合捕获引物和单链固定的再生通用捕获引物。
在一些实施方案中，基底是包括多个垫的图案化流通池。
在一些实施方案中，每一个垫包括第一多种捕获引物和第二多种通用捕获引物，所述第一多种捕获引物包含3’-末端通用捕获区域y，所述第二多种通用捕获引物包含3’-末端通用捕获区域z。
在一些实施方案中，在多个垫中的一个或更多个垫中，多于1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的包含3’-末端通用捕获区域y的捕获引物被转化为单链固定的嵌合捕获引物。
在一些实施方案中，在多个垫中的一个或更多个垫中，多于1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的包含3’末端通用捕获区域z的捕获引物被转化为单链固定的嵌合捕获引物。
在一些实施方案中，在多个垫中的一个或更多个垫中，多于1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的包含3’-末端通用捕获区域y的捕获引物被转化为单链固定的嵌合捕获引物，且多于1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的包含3’末端通用捕获区域z的捕获引物被转化为单链固定的嵌合捕获引物。
在另一方面，本文提供了一种用于修饰固定的捕获引物的方法，所述方法包括：a)使包含多种固定的捕获引物的基底与多种模板核酸在足以杂交的条件下接触以产生一种或更多种固定的模板核酸，其中多种固定的捕获引物包括第一多种引物和第二多种引物，所述第一多种引物包含3’-末端
在另一方面，本文提供了一种用于修饰固定的捕获引物的方法，所述方法包括：a)使包含多种固定的捕获引物的基底与多种模板核酸在足以杂交的条件下接触以产生一种或更多种固定的模板核酸，其中多种固定的捕获引物包括第一多种引物和第二多种引物，所述第一多种引物包含3’-末端通用捕获区域y，所述第二多种引物包含3’-末端通用捕获区域z，并且其中每一种种模板核酸侧翼为5’-末端和3’-末端通用捕获区域y或z，并且包含一个或更多个限制性位点和在一个或更多个限制性位点和3’-末端通用捕获区域之间的靶特异性捕获区域；b)延伸一种或更多种固定的捕获引物以产生与一种或更多种模板核酸互补的一种或更多种固定的延伸产物；c)通过pcr扩增一种或更多种固定的延伸产物以产生固定的双链模板核酸的一种或更多种单克隆簇；d)使固定的双链模板核酸的一种或更多种单克隆簇与限制性酶接触以切割多种固定的双链模板核酸中的一个或更多个限制性位点以产生多种固定的双链嵌合捕获引物和多种固定的双链再生通用捕获引物，所述多种固定的双链嵌合捕获引物包含通用捕获区域z和靶特异性捕获区域，所述多种固定的双链再生通用捕获引物包含通用捕获区域y。
在一些实施方案中，扩增一种或更多种固定的延伸产物包括桥式扩增或kea。
在一些实施方案中，该方法还包括使多个固定的双链嵌合捕获引物和多个固定的双链再生通用捕获引物变性以形成多种单链固定的嵌合捕获引物和多个单链固定的再生通用捕获引物。
在一些实施方案中，模板核酸还包含在靶特异性部分和3’部分之间的sbs。
在一些实施方案中，多种固定的再生的通用捕获引物包含3’-末端部分限制性位点(3’-terminalpartialrestrictionsite)。
在一些实施方案中，该方法还包括从多种固定的再生的通用捕获引物中去除3’-末端部分限制性位点。
在一些实施方案中，多种固定的再生的通用捕获引物包含预先确定的裂解位点。
在一些实施方案中，预先确定的裂解位点包括二醇连接体(linker)、8-氧代鸟嘌呤(8-氧代-g)、尿嘧啶碱基、核糖核苷酸、甲基化核苷酸或肽。
在一些实施方案中，去除部分限制性位点包括非酶促化学裂解。
在一些实施方案中，非酶促化学裂解包括高碘酸盐处理、稀土金属离子处理、碱处理或光化学反应。
在一些实施方案中，去除3’-末端部分限制性位点包括酶促裂解。
在一些实施方案中，酶促裂解包括尿嘧啶-dna糖基化酶裂解、内切核酸酶裂解、核糖核酸酶(rna酶)处理、限制性酶裂解或蛋白酶裂解。
在一些实施方案中，去除3’-末端部分限制性位点包括使反向互补寡核苷酸与单链固定的再生通用捕获引物杂交以形成双链通用捕获区域y。
在一些实施方案中，该方法还包括使反向互补寡核苷酸与单链固定的嵌合捕获引物杂交以形成双链固定的嵌合捕获引物。
在一些实施方案中，该方法还包括使基底与核酸酶接触以去除3’-末端部分限制性位点。
在一些实施方案中，核酸酶是外切核酸酶i。
在一些实施方案中，固定的双链嵌合捕获引物的3’-末端靶特异性捕获区域是截短的。
在一些实施方案中，每一种模板核酸包含5’-末端通用捕获区域y、3’-末端通用捕获区域z、包含第一和第二限制性位点以及在第一和第二限制性位点之间的间隔区域的中心部分、以及在中心部分和3’-末端通用捕获区域z之间的靶特异性捕获区域。
在一些实施方案中，每一种模板核酸还包含在靶特异性区域和3’-末端通用捕获区域z之间的sbs。
在一些实施方案中，该方法还包括：e)使包含多种靶多核苷酸的核酸样品与至少一种引物在足以杂交的条件下接触，所述至少一种引物包含衔接子；f)通过pcr扩增所述多种靶多核苷酸以产生多种扩增子；g)使多种固定的嵌合捕获引物与所述多种扩增子在足以杂交的条件下直接接触以产生第一多种固定的扩增子；h)延伸多种固定的嵌合捕获引物以产生与所述靶多核苷酸互补的多种固定的延伸产物，以及i)通过pcr扩增所述多种固定的延伸产物以产生第二多种固定的扩增子，其中所述固定的扩增子群体包括85％或更大的均匀性。
在另一方面，本文提供了一种用于修饰固定的捕获引物的方法，所述方法包括：a)使固定在基底上的多种通用捕获引物与多种模板核酸在足以杂交的条件下接触以产生一种或更多种固定的模板核酸，其中多种通用捕获引物包括第一多种引物和第二多种引物，所述第一多种引物包含3’-末端通用捕获区域y，所述第二多种引物包含3’-末端通用捕获区域z，其中每一种模板核酸包含5’-末端通用捕获区域y、3’-末端通用捕获区域z、靶特异性捕获区域、在5’-末端通用捕获区域y和靶特异性捕获区域之间的限制性位点、和在3’-末端通用捕获区域z和靶特异性捕获部分之间的sbs；b)延伸一种或更多种通用捕获引物以产生与一种或更多种固定的模板核酸互补的一种或更多种固定的延伸产物；c)通过桥式扩增或kea扩增一种或更多种固定的延伸产物以产生固定的延伸产物的一种或更多种单克隆扩增子；d)使固定的延伸产物的一种或更多种单克隆簇与限制性酶接触以产生多种固定的嵌合捕获引物和多种固定的再生通用捕获引物，所述多种固定的嵌合捕获引物包含通用捕获区域z和靶特异性捕获区域，所述多种固定的再生通用捕获引物包含通用捕获区域y和部分限制性位点。
在另一方面，本文提供了一种用于修饰固定的捕获引物的方法，所述方法包括：a)使固定在基底上的多种通用捕获引物与多种模板核酸在足以杂交的条件下接触以产生一种或更多种固定的模板核酸，其中多种通用捕获引物包括第一多种引物和第二多种引物，所述第一多种引物包含3’-末端通用捕获区域y和第一预先确定的裂解位点，所述第二多种引物包含3’-末端通用捕获区域z和包含第二预先确定的裂解位点的5’-部分，其中每一种模板核酸包含5’-末端通用捕获区域y、3’-末端通用捕获区域z、靶特异性捕获区域、在5’-末端通用捕获区域y和靶特异性捕获区域之间的限制性位点和在3’-末端通用捕获区域z和靶特异性捕获区域之间的sbs；b)延伸一种或更多种通用捕获引物以产生与一种或更多种模板核酸互补的一种或更多种固定的延伸产物；c)通过桥式扩增或kea扩增一种或更多种固定的延伸产物以产生固定的延伸产物的一种或更多种单克隆扩增子；d)使固定的延伸产物的一种或更多种单克隆扩增子与限制性酶接触以产生多种固定的嵌合捕获引物和多种固定的再生通用捕获引物，所述多种固定的嵌合捕获引物包含通用捕获区域z和靶特异性捕获区域，所述多种固定的再生通用捕获引物包含通用捕获区域y和部分限制性位点；e)通过在第一预先确定的裂解位点处裂解从多种固定的再生的通用捕获引物中去除部分限制性位点。
在一些实施方案中，第一预先确定的裂解位点包括尿嘧啶碱基，且第二预先确定的裂解位点包括二醇连接体。
在另一方面，本文提供了一种用于修饰固定的捕获引物的方法，所述方法包括：a)使固定在基底上的多种通用捕获引物与多种模板核酸在足以杂交的条件下接触以产生一种或更多种固定的模板核酸，其中多种通用捕获引物包括第一多种引物和第二多种引物，所述第一多种引物包含3’-末端通用捕获区域y，所述第二多种引物包含3’-末端通用捕获区域z，其中每一种模板核酸包含5’-末端通用捕获区域y、3’-末端通用捕获区域z、包含第一和第二限制性位点以及在第一和第二限制性位点之间的间隔区域的中心部分、以及在中心部分和3’-末端通用捕获区域z之间的靶特异性区域；b)延伸多种通用捕获引物中的一种或更多种通用捕获引物以产生与一种或更多种模板核酸互补的一种或更多种固定的延伸产物；c)通过桥式扩增或kea扩增一种或更多种固定的延伸产物以产生固定的延伸产物的一种或更多种单克隆扩增子，以及d)使固定的延伸产物的一种或更多种单克隆扩增子与限制性酶接触以产生多种固定的嵌合捕获引物和多种固定的再生通用捕获引物，所述多种固定的嵌合捕获引物包含通用捕获区域z和靶特异性捕获区域，所述多种固定的再生通用捕获引物包含通用捕获区域y。
在另一方面，本文提供了一种用于修饰固定的捕获引物的方法，所述方法包括：a)使固定在基底上的多种通用捕获引物与多种模板核酸在足以杂交的条件下接触以产生一种或更多种固定的模板核酸，其中多种通用捕获引物包括第一多种引物和第二多种引物，所述第一多种引物包含3’-末端通用捕获区域y，所述第二多种引物包含3’-末端通用捕获区域z，其中每一种模板核酸包含5’-末端通用捕获区域y、3’-末端通用捕获区域z、靶特异性捕获区域和5’-末端通用捕获区域y和靶特异性捕获区域之间的限制性位点；b)延伸多种通用捕获引物的一种或更多种通用捕获引物以产生与一种或更多种模板核酸互补的一种或更多种固定的延伸产物；c)通过桥式扩增或kea扩增一种或更多种固定的延伸产物以产生固定的延伸产物的一种或更多种单克隆扩增子；d)使固定的延伸产物的一种或更多种单克隆扩增子与限制性酶接触以产生多种双链固定的嵌合捕获引物和多种双链固定的再生通用捕获引物，所述多种双链固定的嵌合捕获引物包含通用捕获区域z和靶特异性捕获区域，所述多种双链固定的再生通用捕获引物包含通用捕获区域y和单链部分限制性位点；e)使多种双链固定的嵌合捕获引物和多个双链固定的再生通用捕获引物变性以产生多种单链固定的嵌合捕获引物和多个单链固定的再生通用捕获引物；f)使反向互补寡核苷酸与多种单链固定的嵌合捕获引物和多个单链固定的再生通用捕获引物杂交以形成双链通用捕获区域和双链靶特异性区域，以及g)使表面与外切核酸酶i接触以从多个双链固定的再生通用捕获引物中去除单链部分限制性位点。
在另一方面，本文提供了一种用于修饰固定的捕获引物的方法，所述方法包括：a)使固定在基底上的多种通用捕获引物与多种模板核酸在足以杂交的条件下接触以产生一种或更多种固定的模板核酸，其中多种通用捕获引物包括第一多种引物、和第二多种引物和第三多种引物，所述第一多种引物包含3’-末端通用捕获区域y，所述第二多种引物包含3’-末端通用捕获区域z，所述第三多种引物包含3’-末端区域x和包含预先确定的裂解位点的5'部分，其中每一种模板核酸包含5’-末端区域x、3’-末端通用捕获区域z、靶特异性捕获区域、以及区域x和靶特异性捕获区域之间的限制性位点；b)延伸一种或更多种通用捕获引物以产生与一种或更多种模板核酸互补的一种或更多种固定的延伸产物；c)通过桥式扩增或kea扩增一种或更多种固定的延伸产物以产生固定的延伸产物的一种或更多种单克隆扩增子；d)使固定的延伸产物的一种或更多种单克隆扩增子与限制性酶接触以产生多种固定的嵌合捕获引物和多种固定的再生通用捕获引物，所述多种固定的嵌合捕获引物包含通用捕获区域z和靶特异性捕获区域，所述多种固定的再生通用捕获引物包含区域x和部分限制性位点的，以及e)通过在预先确定的裂解位点处裂解，从基底去除包含区域x的多个固定的再生捕获引物。
在另一方面，本文提供了一种寡核苷酸二聚体，所述寡核苷酸二聚体包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含5’-末端通用捕获区域y或z、限制性位点和3’-末端二聚化区域dr，所述第二寡核苷酸包含5’-末端通用捕获区域y或z和3’-末端二聚化区域dr。
在一些实施方案中，第一寡核苷酸的3’-末端dr和第二寡核苷酸的3’-末端dr包含靶特异性捕获区域。
在一些实施方案中，第一寡核苷酸的3’-末端dr和第二寡核苷酸的3’-末端dr包含sbs。
在另一方面，本文提供了一种用于修饰固定的捕获引物的方法，所述方法包括：a)使包含多种固定的捕获引物的基底与多种不同的种子核酸(seednucleicacid)在足以杂交的条件下接触核酸以产生多种不同的固定的种子核酸；b)延伸两种或更多种固定的捕获引物以产生与多种不同的固定的种子核酸中的两种或更多种互补的多种不同的固定的延伸产物；c)活化多种不同的固定的延伸产物的一种固定的延伸产物，以形成活化的捕获引物，以及d)任选地扩增活化的捕获引物以产生固定的修饰的捕获引物的单克隆簇。
在一些实施方案中，活化固定的延伸产物包括靶向活化。在一些实施方案中，靶向活化包括用多种不同标记物标记多种不同种子核酸以产生多种不同标记的种子核酸的初始步骤。在一些实施方案中，靶向活化还包括形成多种不同标记的固定的种子核酸。在一些实施方案中，靶向活化还包括形成多种不同标记的固定的延伸产物。在一些实施方案中，靶向活化还包括使多种不同标记的固定的延伸产物与一种或更多种标记物特异性触发分子接触以活化一种固定的延伸产物。
在一些实施方案中，初始标记步骤包括多种不同种子核酸的随机标记。在一些实施方案中，初始标记步骤包括多种不同种子核酸的靶向标记。在一些实施方案中，靶向标记是序列特异性标记。在一些实施方案中，多种不同的种子核酸用小于50种、小于45种、小于40种、小于35种、小于30种、小于25种、小于20种、小于18种、小于16种、小于14种、小于12种、小于10种、小于8种、小于6种、小于4种或小于2种不同的标记物标记。在一些实施方案中，多种不同的种子核酸用20种、18种、16种、14种、12种、10种、8种、6种、4种或2种不同的标记物标记。在一些实施方案中，多种不同的种子核酸用10种或更多种、20种或更多种、30种或更多种、40种或更多种、50种或更多种、60种或更多种、80种或更多种、90种或更多种、100种或更多种、150种或更多种、200种或更多种、250种或更多种、300种或更多种、400种或更多种、500种或更多种、600种或更多种、700种或更多种、800种或更多种、900种或更多种、或1,000种或更多种不同标记物标记。在一些实施方案中，不同的标记物是具有不同核酸序列的不同引物。在一些实施方案中，初始标记步骤包括将多种不同的引物连接至多种不同的种子核酸。
在一些实施方案中，触发分子是包含触发区域的核酸。在一些实施方案中，触发区域包含靶特异性捕获区域。在一些实施方案中，触发区域包含通用捕获区域。在一些实施方案中，通用捕获区域包括
在一些实施方案中，活化多种不同固定的延伸产物中的一种固定的延伸产物包括随机活化。在一些实施方案中，随机活化包括使具有多种固定的捕获引物的基底与具有发夹结构的多种不同的种子核酸接触，以产生包含发夹结构的多种不同的固定的种子核酸。在一些实施方案中，随机活化还包括延伸多种固定的捕获引物的两种或更多种以产生包括发夹结构的多种不同的固定的延伸产物。在一些实施方案中，随机活化还包括用裂解试剂活化包含发夹结构的多种固定的延伸产物之一。在一些实施方案中，多种不同种子核酸中的一种或更多种不同的种子核酸包含可裂解的碱基。
在一些实施方案中，裂解试剂是核酸酶。在一些实施方案中，核酸酶是内切核酸酶。在一些实施方案中，裂解试剂是在扩增试剂混合物中。在一些实施方案中，当扩增多个活化的单克隆固定的捕获引物时，存在裂解试剂。
在一些实施方案中，多种不同的固定的延伸产物包含通用捕获区域。在一些实施方案中，多种不同的固定的延伸产物中的发夹结构掩蔽(mask)了通用捕获区域。
在一些实施方案中，多种不同的种子核酸不包含触发区域。在一些实施方案中，随机活化包括用包含触发区域的嵌合引物扩增多种不同种子核酸之一的初始步骤。在一些实施方案中，在用嵌合引物扩增多种不同种子核酸之一的初始步骤中，一种或更多种种子核酸以相对于嵌合引物多于5倍、多于10倍、多于25倍、多于50倍、多于100倍、多于250倍、多于500倍、多于1,000倍、多于2,500倍、多于5,000倍、多于10,000倍、多于25,000倍，多于50,000倍或多于100,000倍过量存在。在一些实施方案中，触发区域包含靶特异性捕获区域。在一些实施方案中，触发区域包含通用捕获区域。在一些实施方案中，嵌合引物包含触发区域和sbs。
在一些实施方案中，随机活化包括a)使具有多种固定的捕获引物的基底与多种不同的种子核酸在足以杂交的条件下接触以产生多种不同的固定的种子核酸，其中每一种不同的种子核酸包含一个或更多个修饰的核苷酸。在一些实施方案中，随机活化还包括b)延伸两种或更多种固定的捕获引物以产生与多种不同的固定的种子核酸互补的多种不同的固定的延伸产物，其中多种不同的固定的延伸产物的每一种包含一个或更多修饰的核苷酸。在一些实施方案中，随机活化还包括c)活化多种不同的固定的延伸产物之一以形成活化的捕获引物，其中活化的捕获引物不包含修饰的核苷酸。在一些实施方案中，修饰的核苷酸包括异鸟嘌呤(isog)或异胞嘧啶(isoc)。
在一些实施方案中，随机活化包括使具有多种固定的捕获引物的基底与各自具有结合的封闭试剂(boundblockingreagent)的多种不同的种子核酸在足以杂交的条件下接触，以产生各自具有结合的封闭剂(boundblockingagent)的多种不同的固定的种子核酸，并使封闭剂与去封闭剂接触。在一些实施方案中，封闭剂是核酸结合蛋白，并且去封闭剂是蛋白酶。在一些实施方案中，封闭剂是珠。
在一些实施方案中，扩增活化的捕获引物以产生固定的修饰的捕获引物的单克隆簇，包括kea或桥式扩增。
在一些实施方案中，表面是包括多个孔的图案化流通池。在一些实施方案中，不同的固定的延伸产物在多个孔的两个或更多个孔中形成。在一些实施方案中，活化的捕获引物在多个孔的两个或更多个孔的每一个中形成。在一些实施方案中，活化的捕获引物在多个孔的至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的孔的每一个中形成。在一些实施方案中，在多个孔的两个或更多个孔的每一个中形成的活化的捕获引物是在至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的孔中的不同的活化的捕获引物。在一些实施方案中，固定的修饰的捕获引物的单克隆簇在多个孔的两个或更多个孔的每一个中形成。在一些实施方案中，固定的修饰的捕获引物的单克隆簇在多个孔的至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的孔中形成。在一些实施方案中，在多个孔的两个或更多个孔的每一个中形成的固定的修饰的捕获引物的单克隆簇是在至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的孔中的不同的固定的修饰的捕获引物的单克隆簇。
附图简述
图1是示出通过图案化簇的双重扩增在图案化基底上扩增核酸的方法的一个实施方案的示意图。图案化基底具有多个间距为1.5μm的400nm孔(1)。首先用聚(n-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺(poly(n-(5-azidoacetamidylpentyl)acrylamide-co-acrylamide)(pazam)层覆盖图案化表面，然后抛光图案化表面以从孔之间的表面去除pazam层，同时保留在孔内的pazam层，并且将通用捕获引物例如通用
图2是示出用捕获引物通过一步扩增在图案化基底上扩增核酸的方法的一个实施方案的示意图。图案化基底具有多个间距为1.5μm的400nm孔(1)。首先用pazam层覆盖图案化表面；然后抛光图案化表面以从孔之间的表面去除pazam层，同时保留在孔内的pazam层，并且将具有通用捕获区域和测序引物结合位点(sbs)的嵌合捕获引物例如
图3是示出通过扩增-接枝-扩增在图案化基底上扩增核酸的方法的一个实施方案的示意图。图案化基底具有多个间距为1.5μm的400nm孔(1)。首先用聚(n-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺(pazam)层覆盖图案化表面，抛光图案化表面以从孔之间的表面去除pazam层，同时保留在孔内的pazam层，并且将通用捕获引物例如通用
图4是示出使用大孔中的混合引物在图案化基底上扩增核酸的方法的一个实施方案的示意图。图案化基底具有多个间距为1.5μm的1.0μm孔(1)。首先用pazam层覆盖图案化表面，抛光图案化表面以从孔之间的表面去除pazam层，同时保留在孔内的pazam层，以及将通用捕获引物例如通用
图5示出了用本文提供的双层引物接枝方法获得的示例性结果。顶图显示了以第一层(pazam)涂覆图案化流通池、抛光表面、沉积第一捕获引物(sbs3-p5)并用四氯荧光素(tet)寡核苷酸探针探测第一捕获引物之后获得的结果。中图显示了用第二层(sfa)进一步涂覆图a的图案化流通池并用tet寡核苷酸探针再次探测第一捕获引物之后获得的结果。底图显示了在第二层中进一步沉积第二捕获引物(p5/p7)并用tet寡核苷酸探针探测第二捕获引物之后获得的结果。
图6示出了说明模板核酸的示例性结构的示意图。模板核酸可以侧翼为3’-末端和/或5’-末端的通用捕获区域。通用捕获区域可以具有例如
图7显示了示出本文提供的用于修饰固定的捕获引物的方法的示意图。图7a示出了模板核酸与固定的捕获引物经由通用捕获区域杂交。杂交的捕获引物的延伸导致形成与模板核酸互补的固定的延伸产物。延伸产物的3’-末端可以与具有互补的3’-末端通用捕获区域的另一个固定的捕获引物杂交，从而形成桥结构。一轮或更多轮kea导致形成固定的模板核酸的单克隆簇。图7b示出了用限制性酶裂解固定的模板核酸。图7c示出了由图7b中的限制性酶裂解产生的固定的嵌合捕获引物。嵌合捕获引物各自具有通用捕获区域和靶特异性捕获区域。限制性酶裂解进一步产生固定的再生通用捕获引物。图7d示出了，在图案化流通池上，可以产生嵌合捕获引物的多个单克隆群体，使得图案化流通池的每一个孔具有嵌合捕获引物的单克隆群体，藉此群体中的所有嵌合捕获引物具有相同的靶特异性捕获区域。图案化流通池的不同孔可以具有嵌合捕获引物的单克隆群体，该嵌合捕获引物的单克隆群体具有相同靶特异性捕获区域或不同靶特异性捕获区域。
图8显示了示出使用修饰的捕获引物靶特异性捕获靶多核苷酸的示例性方法的示意图。图8a示出了来自dna样品例如基因组dna样品的测序文库的制备。在多重pcr反应中，富集靶多核苷酸，并将衔接子添加至富集的靶多核苷酸的一端。图8b示出了使图8a的靶多核苷酸与具有包含通用捕获区域和靶特异性捕获区域的固定的嵌合捕获引物的下一代测序(ngs)流通池接触的步骤。图8c示出了与靶多核苷酸杂交以掺入靶多核苷酸的互补序列及其衔接子序列的嵌合捕获引物的初始延伸。图8c还示出了延伸的捕获引物的随后桥式扩增。
图9显示了示出当试图进行靶多核苷酸的靶特异性捕获时面临的挑战的图。图9a和b示出了包括靶多核苷酸在流通池上经由其末端通用捕获区域的初始捕获的ngs方案。图9c示出了包括通过具有靶特异性捕获区域的固定的捕获引物在流通池上初始捕获靶多核苷酸的ngs方案。
图10显示了示出用于在图案化流通池上产生单克隆捕获垫、以及用于靶特异性捕获和延伸靶多核苷酸并且在图案化流通池的每一个垫中产生靶多核苷酸的单克隆群体的示例性方法的图。
图11显示了示出本文提供的用于修饰固定的通用捕获引物的示例性方法的图。
图12a和b显示了示出本文提供的用于修饰固定的通用捕获引物的示例性方法的图。
图13显示了示出本文提供的用于修饰固定的通用捕获引物的示例性方法的图。
图14显示了示出本文提供的用于修饰固定的通用捕获引物的示例性方法的图。
图15显示了示出本文提供的用于修饰固定的通用捕获引物的示例性方法的图。
图16显示了示出部分模板核酸的示例性二聚体的图。二聚体具有第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含在其5’-末端的第一通用捕获区域(p5)、限制性位点(sapi)(seqidno:9和10)、以及在其3’-末端的靶特异性捕获区域(cp)。二聚体模板核酸具有第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包含在其3’末端的互补靶特异性捕获区域(cp’)、测序引物结合位点(sbs)和在其5’-末端的第二通用捕获区域(p7)。
图17显示了示出计算机模拟的结果的图，描述图案化流通池上的孔的单克隆占有率可以如何根据初始接种条件(例如，通过单次接种循环之后占据的位置的百分比，x轴)和接种事件的数目而变化(建模了2至16个事件：菱形：2个事件；方形：3个事件；三角形：4个事件；十字形：16个事件)。
图18显示了示出本文提供的用于使用可溶性触发分子在图案化流通池上靶向活化固定的延伸产物的示例性方法的图。不同的固定的延伸产物被标记为a、b和c。
图19显示了示出本文提供的用于使用固定的触发分子在图案化流通池上靶向活化固定的延伸产物的示例性方法的图。不同的固定的延伸产物被标记为a、b和c。图案化流通池的垫已经接种有带有不同末端的三个分子，并且少量的嵌合p5/b’引物被固定在每个垫中。分子b可以与嵌合引物的互补b’末端杂交，所述嵌合引物可以被延伸并开始垫的扩增。其他垫可以具有带有不同末端的嵌合引物(例如，p5/a’引物或p5/c’引物)。
图20显示了示出本文提供的用于使用可裂解发夹随机活化固定的延伸产物的示例性方法的图。
图21显示了本文提供的用于使用具有触发序列的少量可溶性引物来随机活化固定的延伸产物，以扩增少部分缺乏触发序列的种子核酸的方法的示例性结果。
详述
下一代测序(ngs)技术依赖于固定在表面上的单个靶多核苷酸的高度平行测序，或者由单个靶多核苷酸例如通过桥式扩增产生的靶核苷酸的克隆群体的测序。测序靶多核苷酸的克隆群体产生比测序单个靶多核苷酸高得多的信噪比(snr)，改进了测序反应的灵敏度和准确性，并允许在测序仪器中使用低成本光学元件。
本公开内容部分地基于以下认识：通过增加靶多核苷酸的固定的克隆群体的尺寸和密度可以进一步改进ngs的数据质量和经济性，这进一步改进了测序反应的snr。
在ngs中，靶多核苷酸可以被捕获在基底例如流通池(fc)上，使得单独靶多核苷酸在空间上彼此分离并在随后的测序循环中可区分。本领域已知的捕获方法本质上通常是随机的，并且至少部分地依赖于实验条件的精确控制以实现基底上固定的靶多核苷酸的最佳密度。不适当的条件可导致过度拥挤，使得单独靶多核苷酸不可区分，或者可选地，可导致高空位率(vacancyrate)，这可以减少每测序运行获得的信息，从而浪费昂贵的测序试剂。
最近，已经开发了图案化流通池，其使得比许多商业上可获得的流通池上的克隆靶多核苷酸群体更大并且以更高的密度排列的固定的靶多核苷酸的克隆群体的有序生长成为可能(参见，例如，us2013/0096034a1；
原则上，动力学排除测定(kea)允许在图案化流通池上扩增每孔单个靶多核苷酸，并且在一个或更多个孔中产生单克隆靶多核苷酸群体(参见，例如，us2013/0338042a1)。在kea中，相对于靶多核苷酸转运和捕获的慢得多的速率，孔内第一捕获的靶多核苷酸的扩增速率快得多。捕获在孔中的第一靶多核苷酸可以被快速扩增并填充整个孔，阻止在同一孔中捕获另外的靶多核苷酸。
本公开内容部分地基于以下认识：kea关于在图案化流通池的纳米孔中生产单克隆靶多核苷酸群体的有效性随着纳米孔的尺寸增加而降低。第一捕获的靶多核苷酸的扩增和用靶多核苷酸的单克隆群体填充孔在较大的孔中比在较小的孔中更慢，而第二靶多核苷酸的捕获在较大的孔中比在较小的孔中更快。因此，在纳米孔内捕获和扩增多于一种靶多核苷酸的可能性随着纳米孔的尺寸而增加。来自孔的测序数据质量对于靶多核苷酸的单克隆群体是最佳的。随着除第一固定的靶多核苷酸以外的靶多核苷酸的份额增加，来自孔的数据质量降低。
因此，需要新的方法来促进图案化流通池的大纳米孔中单克隆靶多核苷酸群体的产生。
本公开内容提供了用于修饰固定的捕获引物的方法和试剂盒。在一个有用的实施方案中，本公开内容使得能够在图案化流通池的孔中产生靶多核苷酸的单克隆群体。具体地，本公开内容促进产生与用本领域已知的通常使用的ngs方法产生的靶多核苷酸的克隆群体相比，尺寸扩大并以更高密度排列的靶多核苷酸的克隆群体。本公开内容的方法促进以更高的通量收集高质量的ngs数据，特别是在针对部分基因组的靶向测序的应用中。用本公开内容的方法实现的更高的snr可以使得能够使用简单的光学和检测仪器，减少测定成本。高数据质量和改进的样品通量可以例如在疾病诊断和预后中为靶特异性ngs开辟广泛的新应用领域。因此，通过促进可靠的早期检测罕见遗传突变，预期本公开内容将有益于例如患有包含罕见基因突变的疾病的患者例如癌症患者。早期的疾病检测可以转化为更多的治疗选择和改进的治疗结果。
本公开内容进一步部分地基于以下认识：许多图案化流通池的孔具有成对的通用捕获引物，这使得能够桥式扩增具有互补通用捕获区域的核酸，但不能靶特异性捕获感兴趣的单独多核苷酸。虽然图案化流通池的有用方面是由于高特征密度而增加的ngs反应的通量，并且由于已知的垫位置而更容易地进行聚簇配准，图案化流通池的缺点是需要合成单克隆垫(孔)，其中在特定的垫上的dna簇仅来自单个dna分子。多克隆垫使得碱基调用变得困难(如果不是不可能)(低％pf)。
本公开内容还部分地基于以下认识：包括靶多核苷酸的靶特异性捕获的ngs方案可以比包括使用通用捕获区域捕获靶多核苷酸的ngs方案产生更低质量的测序数据。参见，例如，图9。图9a和b示出了包括经由通用捕获区域在流通池上初始捕获靶多核苷酸的ngs方案。图9c示出了包括通过固定的靶特异性捕获引物初始捕获靶多核苷酸的ngs方案的方面。因为在许多ngs流通池上，具有靶特异性捕获区域的固定的捕获引物比固定的通用捕获引物的频率要低得多(以允许捕获的靶多核苷酸的有效桥式扩增和靶多核苷酸簇的分离)，并且因为特异性靶多核苷酸可以例如，在基因组dna片段的群体中是罕见的，靶特异性接种速率可以比基于通用捕获区域的接种速率慢得多。因此，当尝试靶特异性捕获时，竞争性副反应和不规则扩增事件比在依赖于通用捕获的方案中更可能发生，这可以最终降低遵循靶特异性捕获的ngs测序反应的数据质量。
本文提供了用于在图案化流通池的单独孔中修饰(例如，通用)捕获引物的方法，使得感兴趣的单独多核苷酸可以在图案化流通池的一个或更多个孔中被靶特异性捕获。在本文提供的方法的一些实施方案中，产生具有靶向特异性捕获区域的捕获引物的高密度单克隆群体的单克隆捕获垫。在一些实施方案中，单克隆捕获垫可以增加靶多核苷酸的靶特异性接种速率并抑制竞争性副反应和不规则扩增事件，从而改进ngs数据质量。例如，在图10中示出了本文提供的方法的示例性图示。然后，靶特异性捕获的感兴趣的多核苷酸的桥式扩增可以用于在图案化流通池的一个或更多个孔中形成靶多核苷酸扩增子的单克隆群体。根据本文提供的方法，包括靶特异性捕获序列的单个模板核酸最初可以经由它们的通用捕获区域接种到图案化流通池的单独垫上，并且随后对单个模板核酸的扩增排除来自相同的垫的另外的模板核酸，导致形成单克隆捕获垫。
必须注意，除非上下文另外清楚地指示，如在说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指示物。因此，例如，提及“生物标志物”包括两种或更多种生物标志物的混合物等。
术语“约”，特别是提及给定数量，意在包括正负百分之五的偏差。
如本文使用的，术语“包括(includes)”、“包括(including)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“包含(contains)”、“包含(containing)”、及其任何变形旨在覆盖非排除性包容物，以使得包括(includes)、包括(includes)或包含(contains)元素或一列元素的方法(process)、方法(method)、方法限定的产品或物质的组合物不仅包括那些元素，还可以包括此类方法(process)、方法(method)、方法限定的产品或物质的组合物未明确列出或非固有的其他元素。
如本文使用的，术语“基底”旨在指固体支持物。术语包括可以用作用于产生用于沉积生物聚合物(包括核酸、多肽和/或其他聚合物)的特征诸如孔的固体或半固体基础的任何材料。本发明的基底通过本领域技术人员熟知的多种方法进行例如修饰，或可以被修饰以适应生物聚合物的附接。基底材料的示例性类型包括玻璃、修饰的玻璃(modifiedglass)、官能化玻璃、无机玻璃、微球(包括惰性和/或磁性颗粒)、塑料、多糖、尼龙、硝酸纤维素、陶瓷、树脂、二氧化硅(silica)、基于二氧化硅的材料、碳、金属、光学纤维或光学纤维束、除以上例示的那些以外的多种聚合物和多孔微量滴定板。具体类型的示例性塑料包括丙烯酸树脂、聚苯乙烯、苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯和teflontm。示例性基于二氧化硅的材料的具体类型包括硅和多种形式的改性硅(modifiedsilicon)。
本领域技术人员将知道或理解，本发明的基底的组成和几何形状可以根据预期用途和使用者的偏好而变化。因此，尽管参考用于说明的微阵列在本文中示例了平面基底诸如载玻片、芯片或晶片，考虑到本文提供的教导和指导，本领域技术人员将理解，本文所示例的或本领域熟知的多种其他基底也可以用于本发明的方法和/或组合物中。
在一些实施方案中，固体支持物包括图案化表面。“图案化表面”指不同区域在固体支持物的暴露层中或暴露层上的排列。例如，区域中的一个或更多个可以是其中存在一个或更多个扩增引物的特征。特征可被其中不存在扩增引物的间隙区域分开。在一些实施方案中，图案可以是呈行和列的x-y格式的特征。在一些实施方案中，图案(pattern)可以是特征和/或间隙区域的重复排列。在一些实施方案中，图案可以是特征和/或间隙区域的随机排列。可以用于本文提出的方法和组合物中的示例性图案化表面描述于美国序号13/661,524或美国专利申请公布号2012/0316086a1，其每一个通过引用并入本文。
在一些实施方案中，固体支持物包括表面中的孔或凹(depression)的阵列。如本领域普遍所知的，这可以使用多种技术被制造，所述多种技术包括但不限于光刻术(photolithography)、冲压技术、塑模技术和显微蚀刻技术。如将被本领域人员理解的，使用的技术将取决于阵列基底的组成和形状。
图案化表面中的特征可以是在具有图案化、共价连接的凝胶的玻璃、硅、塑料或其他合适的固体支持物上的孔阵列(例如，微孔或纳米孔)中的孔，所述凝胶诸如聚(n-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(pazam，参见，例如，美国临时专利申请系列号61/753,833，其通过引用并入本文)。该方法产生用于测序的凝胶垫，其可以经具有大量循环的测序运行稳定。聚合物与孔的共价连接有助于在多种用途期间在结构化基底的整个寿命期间将凝胶保持在结构特征中。然而，在许多实施方案中，凝胶不需要与孔共价连接。例如，在一些情况下，不共价附接至结构化基底的任何部分的无硅烷丙烯酰胺(sfa，参见，例如，美国专利申请公布号2011/0059865a1，其通过引用并入本文)可以用作凝胶材料。
在具体实施方案中，可以通过用孔(例如微孔或纳米孔)将固体支持材料图案化，用凝胶材料(例如，pazam、sfa或其化学修饰的变体，诸如叠氮化形式的sfa(叠氮-sfa))涂覆图案化的支持物，并且例如经由化学或机械抛光来抛光凝胶涂覆的支持物，从而将凝胶保留在孔中，但从结构化基底表面上孔之间的间隙区域中去除或灭活基本上所有的凝胶。引物核酸可以附接至凝胶材料上。然后可以使靶核酸(例如，片段化的人类基因组)的溶液与抛光的基底接触，使得单独靶核酸将经由与附接至凝胶材料的引物的相互作用而使单独孔接种；然而，由于凝胶材料的不存在或无活性，靶核酸将不占据间隙区域。靶核酸的扩增将被限制在孔中，因为间隙区域中凝胶的不存在或无活性阻止了生长中的核酸集群(colony)的向外迁移。该方法是方便地可制造的，可扩大规模并利用常规的微米或纳米制造方法。
图案化基底可以包括例如刻蚀到载玻片或芯片中的孔。只要这些特征在物理上或功能上可彼此分离，孔的蚀刻图案和几何形状可以具有多种不同的形状和尺寸。具有此类结构特征的特别有用的基底是能够选择固体支持物颗粒诸如微球的尺寸的图案化基底。具有这些特征的示例性图案化基底是与beadarray技术(illumina，inc.，sandiego，calif.)结合使用的蚀刻基底。其他实例在美国专利号6,770,441中描述，其通过引用并入本文。
如本文使用的，术语“固定的”当用于提及核酸时旨在指经由共价或非共价键直接或间接附接至固体支持物。在本发明的某些实施方案中，可以使用共价附接，但不可或缺的是，核酸在预期使用支持物的条件下保持固定或附接至支持物，例如在需要核酸扩增和/或测序的应用中。待用作捕获引物或扩增引物的寡核苷酸可以被固定，使得3’末端可用于酶促延伸，并且该序列的至少一部分能够与互补序列杂交。固定可以经由与表面附接的寡核苷酸的杂交发生，在这种情况下，固定的寡核苷酸或多核苷酸可以是3’-5’取向。可选地，固定可以通过除碱基配对杂交以外的方法发生，诸如以上列出的共价附接。
如本文使用的，术语“阵列”指可以根据相对位置彼此区分的位点群体。在阵列的不同位点处的不同分子可以根据在阵列中的位点的位置彼此区分。阵列的单独位点可以包含一个或更多个特定类型的分子。例如，一个位点可以包含具有特定序列的单个靶核酸分子，或一个位点可以包含具有相同序列(和/或其互补序列)的若干核酸分子。阵列的位点可以是位于相同基底上的不同特征。示例性特征包括但不限于，基底中的孔、基底中或基底上的珠(或其他颗粒)、基底的突起部分、基底上的脊(ridges)或基底里的通道。阵列的位点可以是各自携带不同分子的独立的基底。附接至独立的基底的不同分子可以根据基底在与该基底联系(associatedwith)的表面上的位置或根据基底在液体或凝胶中的位置被鉴定出。其中独立的基底位于表面上的示例性阵列包括但不限于在孔里具有珠的那些。
如本文使用的，术语“多个(plurality)”旨在指两个或更多个不同成员的群体。多个的尺寸范围可以从小、中、大、至非常大。小的多个的尺寸范围可以例如从几个成员至数十个成员。中等尺寸的多个范围可以例如从数十个成员至约100个成员或数百个成员。大的多个范围可以例如从约数百个成员至约1000个成员，至数以千计的成员和多达数以万计的成员。非常大的多个范围可以例如从数万个成员至约几十万、一百万、数百万、数千万和多达或大于数以亿计的成员。因此，多个的尺寸范围可以从两个至远超一亿成员，以及如通过成员数目测量的，在以上示例性范围之间的和大于以上示例性范围的所有尺寸。微阵列内的特征的示例性数目包括在1.28cm2内约500,000个或更多个的多个离散特征。示例性多个核酸包括例如约1×105、5×105和1×106或更多个不同核酸种类的群体。因此，该术语的定义旨在包括大于2的所有整数值。可以例如通过本发明的核酸样品中的核苷酸序列的理论多样性来设定本发明的多个的上限。
如本文使用的，术语“核酸”旨在指在任何情况下呈现的核糖核酸或脱氧核糖核酸或其类似物，包括核酸分析物；例如探针、靶或引物。本发明的核酸的特定形式包括在生物体中发现的所有类型的核酸、以及合成核酸，诸如通过化学合成产生的多核苷酸。适用于通过掺入通过本发明方法产生的微阵列进行分析的核酸的特定实例包括基因组dna(gdna)、表达的序列标签(est)、拷贝的信使rna的dna(dnacopiedmessengerrna)(cdna)、拷贝的信使rna的rna(rnacopiedmessengerrna)(crna)、线粒体dna或基因组、rna、信使rna(mrna)和/或其他rna群体。这些示例性核酸的片段和/或部分也被包括在如在本文使用的术语的含义内。
如本文使用的，术语“双链”当提及核酸分子使用时，意指核酸分子中基本上所有核苷酸都氢键键合至互补核苷酸。部分双链核酸的核苷酸可以具有至少10％、25％、50％、60％、70％、80％、90％或95％与互补核苷酸氢键键合。
如本文使用的，术语“单链”当提及核酸分子使用时，意指核酸分子中的核苷酸基本上都未与互补核苷酸氢键键合。
如本文使用的，术语“靶多核苷酸”旨在指作为分析或作用的对象的多核苷酸。分析或作用包括使多核苷酸经历拷贝、扩增、测序和/或用于核酸询问(interrogation)的其他程序。靶多核苷酸可以包括除了待被分析的靶序列以外的核苷酸序列。例如，靶多核苷酸可以包含一个或更多个衔接子，所述衔接子包括在待被分析的靶多核苷酸序列的侧翼作为引物结合位点发挥作用的衔接子。与捕获寡核苷酸或捕获引物杂交的靶多核苷酸可以包含延伸超出捕获寡核苷酸的5’或3’末端的核苷酸，以此方式使得并不是所有的靶多核苷酸都适于延伸。在特定实施方案中，如下文进一步详细列出的，多种靶多核苷酸包括不同种类，所述不同种类在其靶多核苷酸序列方面不同但具有对于两种或更多种不同种类是相同的衔接子。可以位于特定靶多核苷酸序列侧翼的两个衔接子可以具有相同的序列，或者两个衔接子可以具有不同的序列。因此，多种不同的靶多核苷酸可以在靶多核苷酸序列的每一个末端处具有相同的衔接子序列或两个不同的衔接子序列。因此，多种靶多核苷酸中的种类可以包括位于待通过例如测序来评价的未知序列的区域侧翼的已知序列区域。在靶多核苷酸在单一末端携带衔接子的情况下，衔接子可以位于靶多核苷酸的3’末端或5’末端。可以使用靶多核苷酸而无需任何衔接子，在这种情况下，引物结合序列可以直接来自靶多核苷酸中发现的序列。
如本文使用的，术语“捕获引物”旨在指具有能够在例如扩增或测序反应的引物退火步骤中遇到的条件下与待分析或经历核酸询问的单链多核苷酸序列特异性退火的核苷酸序列的寡核苷酸。术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”在本文中可互换使用。除非另有特别说明，否则不同的术语并不旨在表示尺寸、序列或其他属性中的任何特定差异。为了描述的清楚，当描述包括几种核酸种类的特定方法或组合物时，术语可用于区分一种核酸与另一种核酸。
本文使用的术语“靶特异性”当提及捕获引物或其他寡核苷酸使用时，旨在指包含对靶多核苷酸序列特异性的核苷酸序列，即能够与靶多核苷酸的鉴定区域选择性退火的核苷酸序列的捕获引物或其他寡核苷酸。靶特异性捕获引物可以具有单一种类的寡核苷酸，或者其可以包括具有不同序列的两种或更多种种类。因此，靶特异性捕获引物可以是两种或更多种序列，包括3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种或更多种不同序列。靶特异性捕获寡核苷酸可以包括靶特异性捕获引物序列和通用捕获引物序列。其他序列诸如测序引物序列等也可以被包括在靶特异性捕获引物中。
相比之下，当提及捕获引物或其他寡核苷酸序列使用时，术语“通用”旨在指具有多种捕获引物中的共同核苷酸序列的捕获引物或其他寡核苷酸。共同的序列可以是例如与相同衔接子序列互补的序列。通用捕获引物适用于询问多种不同的多核苷酸，而不必区分不同的种类，而靶特异性捕获引物适用于区分不同的种类。
如本文使用，术语“扩增子”当提及核酸使用时，意指拷贝核酸的产物，其中该产物具有与核酸的核苷酸序列的至少一部分相同或互补的核苷酸序列。可以通过使用核酸或其扩增子作为模板的多种扩增方法中的任何一种产生扩增子，所述多种扩增方法包括例如聚合酶延伸、聚合酶链式反应(pcr)、滚环扩增(rca)、连接延伸或连接链式反应。扩增子可以是具有特定核苷酸序列的单拷贝(例如pcr产物)或核苷酸序列的多个拷贝(例如rca的多联体(concatameric)产物)的核酸分子。靶核酸的第一扩增子可以是互补拷贝。随后的扩增子是在产生第一扩增子之后从靶核酸或从第一扩增子产生的拷贝。随后的扩增子可以具有与靶核酸基本上互补或与靶核酸基本上相同的序列。
可以通过适当修改扩增反应来调节可以产生的模板拷贝数或扩增子的数目，所述修改包括例如改变扩增循环运行的数目，扩增反应中使用不同持续性的聚合酶，和/或改变扩增反应运行的时间长度，以及本领域已知的影响扩增产率的其他条件的修改。核酸模板的拷贝数可以是至少1个、10个、100个、200个、500个、1000个、2000个、3000个、4000个、5000个、6000个、7000个、8000个、9000个和10,000个拷贝，并且可以根据具体应用改变。
如本文使用的，术语“克隆群体”指相对于特定核苷酸序列是均质的核酸群体。均质序列可以是至少10个核苷酸长，或更长，例如至少50个、100个、250个、500个或1000个核苷酸长。克隆群体可以源自单个靶核酸或模板核酸。克隆群体中的基本上所有核酸具有相同的核苷酸序列。应当理解，克隆群体中可能会出现少量突变(例如由于扩增假象(artifact))而不会偏离克隆性(clonality)。
如本文使用的，除非上下文另外指明，否则当提及项目的集合使用时术语“每一个(each)”旨在鉴定集合中的单独项目而不必指集合中的每个(every)项目。
如本文使用的，当提及覆盖基底表面的层使用时，术语“直接”旨在指该层覆盖基底的表面而无需显著的中间层，诸如粘合剂层。直接覆盖表面的层可以通过任何化学或物理相互作用(包括共价键或非共价粘附)附接至该表面。
本文提供了用于扩增固定在基底上的核酸的微阵列、方法和试剂盒，以及用于修饰固定的捕获引物的方法。
本文提供的方法可以包括在孔或特征中的第一层中使用第一对捕获引物对图案化流通池的每孔或特征单个靶多核苷酸进行初始捕获和固定。初始靶多核苷酸捕获之后可以是单个靶多核苷酸的初始扩增，以在孔或特征内例如通过kea产生靶多核苷酸扩增子的单克隆群体。参见，例如，图1-4。随后可以通过例如通过kea或pcr扩大靶多核苷酸扩增子的单克隆群体超出孔或特征的极限，以增加随续测序反应中特征或孔的亮度、信号强度或snr。
扩大靶多核苷酸扩增子的单克隆群体超出孔或特征可以根据本文提供的方法，例如通过在围绕该孔或特征的包含靶多核苷酸扩增子的单克隆群体的第二层中接枝3’-封闭的通用引物来实现。参见，例如，图1.4和1.5。在使3’-封闭的通用引物脱保护之后，扩增子扩大可以例如通过pcr或kea发生。参见，例如，图1.6和1.7。
在本文提供的一些方法中，靶多核苷酸在孔或特征内的初始捕获通过使用识别靶多核苷酸作为多核苷酸文库的成员的捕获引物(例如，sbs3或sbs8引物)发生。参见，例如，图2.2和2.6。单克隆靶多核苷酸扩增子的随后扩大使用接枝在围绕孔或特征的层并且识别单克隆靶多核苷酸扩增子的靶多核苷酸的通用捕获引物(例如，p5或p7引物)发生。参见，例如，图2.4和2.6。
在本文提供的一些方法中，靶多核苷酸在孔或特征内的初始捕获使用位于孔或特征内的第一层中的第一对捕获引物发生，并且随后扩增孔内的捕获的靶多核苷酸以产生靶多核苷酸扩增子的单克隆群体。参见，例如，图3.1-3.4。随后将第二对捕获引物接枝在围绕该孔的层中，并且使用第二对捕获引物通过pcr或kea实现靶多核苷酸扩增子的单克隆群体的扩大。参见，例如，图3.5和3.6。
在本文提供的一些方法中，靶多核苷酸的初步捕获、其扩增和所得的靶多核苷酸扩增子的群体的扩大发生在图案化流通池的包含通用捕获引物(例如，p5和p7引物)以及识别多核苷酸文库的靶多核苷酸的捕获引物(例如，p5-sbs3和p7-sbs8引物)的混合物的扩大的孔或特征(例如，直径>1.0μm)内。参见，例如，图4。
本文提供的方法可以通过使得能够在图案化流通池上以高密度产生靶多核苷酸扩增子的扩大的单克隆群体来增加靶特异性ngs反应的通量、灵敏度和数据质量。本文提供的方法可以增加测序反应的通量、灵敏度和数据质量(例如，较低的测序误差率)，并允许使用相对简单的光学和经济的仪器。
本文提供的微阵列包括具有一个或更多个孔的基底和覆盖孔的内表面和/或围绕孔的表面的一个或更多个层。
本文提供的一些微阵列具有多个孔，每一个孔具有固定的靶多核苷酸的单克隆群体。参见，例如，图1.5、2.6、3.4和4.3。多个孔的不同孔可以具有相同靶多核苷酸或不同靶多核苷酸的单克隆群体。
本文提供的一些微阵列具有一个或更多个层和在一个或更多个层的每一个中具有一种或更多种捕获引物对。参见，例如，图1.2、1.4、2.2、2.4、3.2、3.3和4.2。这些微阵列允许在微阵列的孔中形成固定的靶多核苷酸的单克隆群体。参见，例如，图1.5、2.6、3.4和4.3。一些微阵列具有尺寸设为(dimensioned)促进固定的靶多核苷酸的动力学排除扩增(kea)和在孔的范围内形成固定的靶多核苷酸的单克隆群体的孔(例如，孔直径<1μm)。参见例如图1.5、2.6(中图)和3.4。在第二扩增步骤中，微阵列还可以使得单克隆靶多核苷酸群体能够扩大超出孔的范围。参见，例如，图1.7、2.6(底图)和3.6。允许形成靶多核苷酸的单克隆群体的其他微阵列具有不利于动力学排除的扩大的孔(例如，孔直径>1μm)。参见，例如，图4。在一些实施方案中，不利于动力学排除的扩大的孔具有至少两对捕获引物(例如，p5/p7捕获引物对)。参见，例如，图4.2。
在一些实施方案中，等温扩增可以使用动力学排除扩增(kea)进行，也称为排除扩增(examp)。本公开内容的核酸文库可以使用包括使扩增试剂反应以产生多个扩增位点的步骤的方法来制备，所述多个扩增位点各自包括来自已经接种位点的单独靶核酸的扩增子的基本上克隆的群体(substantiallyclonalpopulation)。在一些实施方案中，扩增反应进行直到产生足够数目的扩增子以填充相应扩增位点的容量。以这种方式将已经接种的位点填充至容量抑制靶核酸在该位点降落和扩增，从而在该位点产生扩增子的克隆群体。在一些实施方案中，即使扩增位点在第二靶核酸到达位点之前未被填充至容量，也可以实现表观克隆性(apparentclonality)。在一些条件下，第一靶核酸的扩增可以进行至足够数目的拷贝被产生以有效地胜过或压倒从被转运至该位点的第二靶核酸的拷贝产生的点。例如在对直径小于500nm的圆形特征使用桥式扩增方法的实施方案中，已经确定，在第一靶核酸的指数扩增的14次循环之后，在相同位点来自第二靶核酸的污染将产生不足以对illumina测序平台上的边合成边测序(sequencing-by-synthesis)分析产生不利影响的数目的污染扩增子。
如以上实例所示，在特定实施方案中，阵列中的扩增位点可以是但不一定是完全克隆的。而是，对于一些应用，单独扩增位点可以主要地用来自第一靶核酸的扩增子填充(populated)，并且还可以具有低水平的来自第二靶核酸的污染扩增子。只要污染水平对阵列的随后使用没有不可接受的影响，阵列可以具有一个或更多个具有低水平的污染扩增子的扩增位点。例如，当阵列将用于检测应用中时，可接受的污染水平将不会以不可接受的方式影响检测技术的信噪比或分辨率的水平。因此，表观克隆性通常将与由本文阐述的方法制成的阵列的特定用途或应用相关。在特定应用的单独扩增位点可以接受的示例性污染水平包括但不限于至多0.1％、0.5％、1％、5％、10％或25％的污染扩增子。阵列可以包括具有这些示例性水平的污染扩增子的一个或更多个扩增位点。例如，阵列中多达5％、10％、25％、50％、75％或甚至100％的扩增位点可以具有一些污染扩增子。应当理解，在阵列或其他位点集合中，至少50％、75％、80％、85％、90％、95％或99％或更多的位点可以是克隆的或表观克隆的。
在一些实施方案中，当过程以足够快的速率发生以有效排除另一事件或过程发生时，动力学排除可以发生。以制备核酸阵列为例，其中阵列的位点用来自溶液的靶核酸随机接种，并且在扩增过程中产生靶核酸的拷贝以将每一个接种的位点填充至容量。根据本公开内容的动力学排除方法，接种和扩增过程可以在扩增速率超过播种速率的条件下同时进行。因此，在已经由第一靶核酸接种的位点进行拷贝的相对较快的速率将有效地排除第二核酸接种该位点进行扩增。动力学排除扩增方法可以如美国申请公布号2013/0338042的公开内容中详述的进行，其通过引用以其整体并入本文。
动力学排除可以利用引发扩增的相对较慢的速率(例如，制备靶核酸的第一拷贝的缓慢速率)对比制备靶核酸(或者靶核酸的第一拷贝)的随后拷贝的相对较快的速率。在先前段落的实例中，动力学排除的发生归因于靶核酸接种相对较慢的速率(例如相对较慢的扩散或转运)对比扩增发生以用核酸种子的拷贝填充位点的相对较快的速率。在另一个示例性实施方案中，动力学排除的发生可以归因于已经接种了位点的靶核酸的第一拷贝的形成的延迟(例如，延迟或缓慢活化)对比制备随后拷贝以填充位点的相对较快的速率。在该实例中，单独位点可能已经接种了几种不同的靶核酸(例如，几种靶核酸可以在扩增之前存在于每个位点)。然而，对于任何给定的靶核酸，第一拷贝形成可以被随机活化，使得与产生随后拷贝的速率相比，第一拷贝形成的平均速率相对较慢。在这种情况下，尽管单独位点可能已经接种了几种不同的靶核酸，但动力学排除将仅允许那些靶核酸中的一种被扩增。更具体地，在第一靶核酸被活化用于扩增后，则该位点将快速用其拷贝填充至容量，从而防止第二靶核酸的拷贝在该位点处被制备。
扩增试剂可以包括促进扩增子形成，并且在一些情况下增加扩增子形成的速率的另外组分。一个实例是重组酶。重组酶可以通过允许重复的侵入/延伸来促进扩增子的形成。更具体地，重组酶可以促进靶核酸被聚合酶的侵入，并使用靶核酸作为扩增子形成的模板通过聚合酶延伸引物。该过程可以作为链式反应重复，其中从每一轮侵入/延伸产生的扩增子在随后的一轮中用作模板。因为不要求变性循环(例如经由加热或化学变性)，所以该方法可以比标准pcr更快速地发生。因此，重组酶促进的扩增可以等温进行。通常期望在重组酶促进的扩增试剂中包括atp或其他核苷酸(或在一些情况下为其不可水解的类似物)以促进扩增。重组酶和单链结合(ssb)蛋白的混合物特别有用，因为ssb可进一步促进扩增。用于重组酶促进扩增的示例性制剂包括由twistdx(cambridge，uk)以twistamp试剂盒商业销售的那些。在us5,223,414和us7,399,590中列出了重组酶促进扩增试剂和反应条件的有用组分，其每一个通过引用并入本文。
可以被包括在扩增试剂中以促进扩增子形成并且在一些情况下增加扩增子形成速率的组分的另一个实例是解旋酶。通过允许扩增子形成的链式反应，解旋酶可促进扩增子的形成。因为不要求变性循环(例如经由加热或化学变性)，所以该方法可以比标准pcr更快速地发生。因此，解旋酶促进的扩增可以等温进行。解旋酶和单链结合(ssb)蛋白的混合物是特别有用的，因为ssb可以进一步促进扩增。用于解旋酶促进扩增的示例性制剂包括来自biohelix(beverly，ma)作为isoamp试剂盒商业销售的那些。此外，us7,399,590和us7,829,284中描述了包括解旋酶蛋白的有用制剂的实例，其每一个通过引用并入本文。
可以被包含在扩增试剂中以促进扩增子形成并且在一些情况下增加扩增子形成速率的组分的又另一个实例是起点结合蛋白(originbindingprotein)。
在一方面，本文提供了微阵列，所述阵列包括：a)基底，所述基底包括至少一个孔、围绕孔的表面和内部孔表面；b)第一层，所述第一层覆盖内部孔表面并包括至少一种第一捕获引物对；以及c)第二层，所述第二层覆盖所述第一层和围绕所述孔的表面。
在一些微阵列中，在有利于动力学排除扩增(kea)和在孔内形成靶特异性多核苷酸的单克隆群体的范围内选择孔尺寸(例如，直径)。核酸文库的动力学排除扩增描述在例如美国专利公布号2013/0338042中，其通过引用并入本文。例如，孔尺寸(例如，直径)可在约30nm和约1μm之间、约50nm和约800nm之间、约70nm和约600nm之间、或在100nm和约400nm之间变化。在一些实施方案中，孔具有约400nm的直径。参见，例如，图1.1。在一些实施方案中，孔具有小于约1μm的直径。示例性的微阵列包括在
在另一方面，本文提供了微阵列，所述微阵列包括a)基底，所述基底包括至少一个孔、围绕孔的表面和内部孔表面，其中孔的直径为约1μm或更大；和b)层，所述层覆盖所述内部孔表面并包括至少一种第一捕获引物对和至少一种第二捕获引物对。
本文提供的微阵列可以例如如美国专利公布号2013/0096034中所述制备。
在一些微阵列中，孔可以具有约1μm和约10μm之间、约1μm和约8μm之间、约1μm和约6μm之间、约1μm和约4μm之间、或约1μm和约2μm之间的直径。在一些实施方案中，孔具有约1.5μm的直径。参见，例如图4.1。在一些实施方案中，孔具有大于约1μm的直径。参见，例如图4.1。
基底可以由本领域已知的可用于生产核酸微阵列的任何材料制成。例如，基底可以是硅或其他二氧化硅或硅酸盐、玻璃、塑料、多糖、尼龙、硝酸纤维素树脂、碳和金属或其他固体支持物。在美国专利公布号2013/0096034中提供了示例性的基底材料，其通过引用并入本文。
微阵列可以具有两个或更多个孔(多个孔)。多个孔的孔可以以相同的距离或不同的距离间隔开。孔的间隔可以表示为例如，如两个孔之间的间隙距离(interspacialdistance)或“间距”(pitch)，其包括两个孔之间的间隙距离和一个孔的直径。参见，例如，图1.1(两孔之间的间隙距离为700nm；间距为1.5μm)。
在一些实施方案中，微阵列具有约100,000和约5,000,000个孔/mm2之间、约250,000和约4,500,000个孔/mm2之间、约500,000和约4,000,000个孔/mm2之间、约750,000和约35,000,000个孔/mm2之间、约1,000,000和约3,000,000个孔/mm2之间、约1,250,000和约2,500,000个孔/mm2之间、约1,500,000和约2,500,000个孔/mm2之间、约1,750,000和约2,250,000个孔/mm2之间、或约2,000,000和约2,250,000个孔/mm2之间。在一些实施方案中，微阵列具有约2,100,000个孔/mm2(例如，
在一些实施方案中，微阵列具有约10,000和约1,000,000个孔/mm2之间、约50,000和约900,000个孔/mm2之间、约100,000和约800,000个孔/mm2之间、约200,000和约700,000个孔/mm2之间、约300,000和约600,000个孔/mm2之间、或约400,000和约500,000个孔/mm2之间。在一些实施方案中，微阵列具有约450,000个孔/mm2(例如，
微阵列孔可以被间隔开以优化孔密度，同时允许其稳健的光学分辨率。例如，多个孔的两个孔可以间隔在约10nm和10μm之间、约50nm和8μm之间、约100nm和约6μm之间、约200nm和约4μm之间、约300nm和约2μm之间、约400nm和约1μm之间、约500nm和约900nm之间、或约600nm和约800nm之间的间隙距离。在一些实施方案中，多个孔的两个或更多个孔以约700nm的距离隔开。参见，例如，图1.1。在一些实施方案中，多个孔的两个或更多个孔以小于约1μm的距离隔开。在一些实施方案中，多个孔的两个或更多个孔以大于约1μm的距离隔开。
多个孔的两个或更多个孔可以以约10nm和10μm之间、约50nm和8μm之间、约100nm和约6μm之间、约500nm和约4μm之间、或约1μm和约2μm之间的间距排列。在一些实施方案中，多个孔的两个或更多个孔以约1.5μm的间距排列。参见，例如，图1.1。在一些实施方案中，多个孔的两个或更多个孔以小于约1μm的间距排列。在一些实施方案中，多个孔的两个或更多个孔以大于约1μm的间距间隔。
本文提供的微阵列包括一层或更多层。例如，微阵列可以包括单层、第一层和第二层、第一层、第二层和第三层，等等。
第一层可以覆盖内部孔表面和/或围绕孔的表面。在一些实施方案中，第一层不覆盖围绕孔的表面。第一层可以覆盖孔的整个内表面，包括例如孔的壁的表面和孔的底部的表面。在一些实施方案中，第一层仅部分地覆盖内部孔表面。例如，第一层可以仅覆盖孔的底部的表面，而不覆盖孔的壁的表面。第一层可以覆盖多个孔的所有孔的内表面或仅覆盖多个孔的一部分孔的内表面。例如，第一层可以覆盖多个孔的少于100％、少于99％、少于95％、少于90％、少于85％、少于80％、少于75％、少于70％、少于65％、少于60％、少于55％、少于50％、少于45％、少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％，少于5％、少于2％或少于1％的孔的内表面。在另一个实例中，第一层可以覆盖多个孔的多于1％、多于2％、多于5％、多于10％、多于15％、多于20％、多于25％、多于30％、多于35％、多于40％、多于45％、多于50％、多于55％、多于60％、多于65％、多于70％、多于75％、多于80％、多于85％、多于90％、多于95％、或多于99％的孔的内表面。第一层可以直接或间接地(例如通过一个或更多个中间层)覆盖基底表面，包括内部孔表面。例如，一个或更多个中间层可以用于改进第一层与基底(例如与内部孔表面)的粘附。
第二层可以覆盖第一层和/或围绕孔的表面。在一些实施方案中，第二层仅部分覆盖第一层。例如，第二层可以仅在孔的底部覆盖第一层。在一些实施方案中，第二层不覆盖第一层。第二层可以完全或仅部分地覆盖围绕孔的表面。第二层可以覆盖围绕多个孔的所有孔的表面或仅覆盖多个孔的一部分孔的表面。例如，第二层可以覆盖围绕多个孔的少于100％、少于99％、少于95％、少于90％、少于85％、少于80％、少于75％、少于70％、少于65％、少于60％、少于55％、少于50％、少于45％、少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于2％或少于1％的孔的表面。在另一个实例中，第一层可以覆盖围绕多个孔的多于1％、多于2％、多于5％、多于10％、多于15％、多于20％、多于25％、多于30％、多于35％、多于40％、多于45％、多于50％、多于55％、多于60％、多于65％、多于70％、多于75％、多于80％、多于85％、多于90％、多于95％、或多于99％的孔的表面。第二层可以直接或间接地(例如通过一个或更多个中间层)覆盖第一层和/或围绕孔的表面。例如，一个或更多个中间层可以用于改进第二层和第一层之间和/或在第二层和围绕孔的基底之间的粘附。
层可以包括可以沉积在表面上、对核酸具有亲和力并且可用于沉积核酸的本领域已知的任何材料，诸如引物。可用于沉积核酸的聚合物涂层在本领域是熟知的。可用于沉积核酸的一些聚合物涂层描述在美国专利公布号2014/0079923a1中，其通过引用并入本文。示例性聚合物涂层包括聚(n-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺(pazam)和无硅烷丙烯酰胺(sfa)。
在一些实施方案中，层(layer)包括聚合物涂层(polymercoating)。在一些实施方案中，层中的聚合物涂层包括pazam。在一些实施方案中，第一层中的聚合物涂层包括pazam或sfa。在一些实施方案中，第二层中的聚合物涂层包括pazam或sfa。
层可以包括一种或更多种捕获引物。例如，层可以包括单个捕获引物、第一和第二捕获引物、第一第二和第三捕获引物等等。
两种或更多种捕获引物可以任何比例存在于孔中。例如，第一捕获引物和第二捕获引物可以以约等量或以任何其他比例(例如摩尔比)存在。孔可以具有比第二捕获引物大于1.1x、大于1.2x、大于1.3x、大于1.4x、大于1.5x、大于2.0x、大于2.5x、大于3.0x、大于5.0x、大于10x、大于15x、大于20x、大于20x、大于25x、大于30x、大于50x、大于100x、大于300x、大于500x或大于1,000x过量的第一捕获引物。微阵列中的不同孔可以具有相同比例的两种或更多种捕获引物或不同的比例。
捕获引物可以包含一个或更多个捕获区域。捕获区域可以包含例如通用捕获区域、测序引物结合位点(sbs)、靶特异性捕获区域、预先确定的裂解位点诸如限制性位点和连接体区域，例如分隔两个或更多个限制性位点的连接体区域。一些捕获引物可以包含例如通用捕获区域和sbs。其他捕获引物可以包含通用捕获区域和靶特异性捕获区域。捕获引物可以在3’-末端封闭(3’-封闭)或在3’-末端未封闭(3’-未封闭)。具有封闭的3’-末端的引物可以例如是3’磷酸封端的。具有封闭的3’末端的一些引物可以被去封闭。去封闭可以发生在酶促反应或化学反应中。酶促反应可以例如由激酶或磷酸酶介导。例如，3’磷酸封端的引物可以被激酶诸如t4激酶去封闭。
通用捕获区域可以包含例如具有通用
sbs可以包括例如具有
捕获引物可以具有区域的任何组合，例如
捕获引物可以包括预先确定的(非随机)裂解位点。可能的预先确定的裂解位点公开在例如美国专利号8,715,966b2中，其通过引用并入本文。预先确定的位点处的裂解可以例如作为酶促裂解或非酶促裂解，诸如化学裂解发生。预先确定的位点如限制性位点处的酶促裂解可以由限制性酶诸如限制性内切核酸酶介导。在一些实施方案中，引物中的预先确定的裂解位点可以包括尿嘧啶碱基。裂解可以如下发生：通过用尿嘧啶dna糖基化酶处理含尿嘧啶的引物，在引物中形成无碱基位点(abasicsite)，随后用内切核酸酶、加热或碱处理，以在无碱基位点裂解引物。在一些实施方案中，预先确定的裂解位点包括二醇连接体，其可以通过用高碘酸盐处理来裂解。在一些实施方案中，预先确定的裂解位点包括8-氧代-鸟嘌呤。
预先确定的裂解位点可以包括酶限制性位点。本领域技术人员已知的任何限制性酶或任何酶限制性位点可以用于本文提供的方法或组合物中。例如，限制性内切核酸酶可以是i型酶(ec3.1.21.3)、ii型酶(ec3.1.21.4)、iii型酶(ec3.1.21.5)或iv型酶(ec3.1.21.5)。限制性内切核酸酶可以包括例如但不限于alui、avai、bamhi、bglii、ecop15i、ecori、ecorii、ecorv、haeiii、hgai、hhai、hindiii、hinfi、hpai、kpni、mboi、noti、psti、pvuii、saci、sali、sapi、sau3a、scai、smai、spei、sphi、ssti、stui、taqi、xbai或xmai。限制性内切核酸酶可以是重组限制性酶。重组限制性酶可以包括但不限于包括天然的或工程化的dna结合结构域(例如，锌指结构域、tal效应域)和核酸酶结构域(例如，iis型限制性酶fok1的裂解结构域)的融合蛋白。
在一些实施方案中，限制性酶识别位点包括sapi位点(“5’-gctcttcnvnnn-3’(seqidno：9)。参见，例如，图6d。
限制性酶可以源自表达相应生物分子的任何生物体，包括真核生物(例如，植物、昆虫、哺乳动物)和原核生物。在某些实施方案中，生物分子源自真细菌(例如，革兰氏阳性、革兰氏阴性)、古细菌、酵母、真菌、藻类(algea)。原核生物可以包括，例如，不限于藤黄节杆菌(arthrobacterluteus)、多变鱼腥藻(anabaenavariabilis)、解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)、球芽孢杆菌(bacillusglobigii)、大肠杆菌(escherichiacoli)ry13、大肠杆菌r245、埃及嗜血杆菌(haemophilusaegyptius)、溶血嗜血杆菌(haemophilushaemolyticus)、流感嗜血杆菌rd(haemophilusinflenzae)rd、禽嗜血杆菌(haemophilusgallinarum)、副流感嗜血杆菌(haemophilusparainfluenzae)、肺炎克雷伯杆菌(klebsiellapneumonia)、牛莫拉氏杆菌(moraxellabovis)、耳炎诺卡氏菌(nocardiaotitidis)、普通变形杆菌(proteusvulgaris)、斯氏普鲁威登菌(providenciastuartii)、粘质沙雷菌(serratiamarcescens)、浮游球衣细菌(sphaerotilusnatans)、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、不产色链霉菌(streptomycesachromogenes)、白色链霉菌(streptomycesalbus)g、头状链霉菌(streptomycescaespitosus)、streptomycesstanford、streptomycestubercidicus、产褐色链霉菌(streptomycesphaeochromogenes)、thermophilusaquaticus、xanthomonasbadrii或xanthamonasmalvacearum。
限制性酶可以是野生型或突变体形式。限制性酶可以是重组生物分子。
在一些实施方案中，所述方法还包括使包含部分限制性位点的捕获引物与核酸酶接触，其中部分限制性位点被核酸酶去除。在一些实施方案中，核酸酶是外切核酸酶。在一些实施方案中，外切核酸酶是外切核酸酶i。
捕获引物可以包括捕获引物对。例如，第一捕获引物可以是第一捕获引物对，其包括第一捕获引物对的第一捕获引物和第一捕获引物对的第二引物。在另一个实例中，第二捕获引物可以是第二捕获引物对，其包括第二捕获引物对的第一捕获引物和第二捕获引物对的第二捕获引物。
捕获引物对的捕获引物可以包含任何捕获区域或捕获区域的任何组合。例如，捕获引物对的第一引物可以包含第一通用捕获区域，且捕获引物对的第二引物可以包含第二通用捕获区域。捕获引物对的引物可以还包含sbs。例如，捕获引物对的第一引物可以包含第一通用捕获引物区域和第一sbs，并且捕获引物对的第二引物可以包含第二通用捕获区域和第二sbs。
在一些实施方案中，捕获引物对的第一引物包含
在一些实施方案中，捕获引物对的第一引物包含
在另一个实例中，第一捕获引物对的第一捕获引物可以包含第一通用捕获区域，第一捕获引物对的第二捕获引物可以包含第二通用捕获区域，第二捕获引物对的第一捕获引物可以包含第一通用捕获引物区域和第一sbs，并且第二捕获引物对的第二捕获引物可以包含第二通用捕获区域和第二sbs。
在一些实施方案中，第一捕获引物对的第一捕获引物包含
捕获引物对可以包含单种捕获引物对或多种捕获引物对。例如，第一捕获引物对可以是多种第一捕获引物对。在一些实施方案中，第一捕获引物对是至少一种捕获引物对。在另一个实例中，第二捕获引物对可以是多种第二捕获引物对。在一些实施方案中，第二捕获引物对是至少一种捕获引物对。
捕获引物可以包括单种捕获引物或多种捕获引物。
捕获引物对的第一和第二捕获引物各自可以是多种捕获引物。例如，捕获引物对的第一捕获引物可以是多种第一捕获引物。在另一个实例中，捕获引物对的第二捕获引物可以是多种第二捕获引物。
在一些实施方案中，第一捕获引物对的第一捕获引物包括第一捕获引物对的多种第一捕获引物。在一些实施方案中，第一捕获引物对的第二捕获引物包括第一捕获引物对的多种第二捕获引物。在一些实施方案中，第二捕获引物对的第一捕获引物包括第二捕获引物对的多种第一捕获引物。在一些实施方案中，第二捕获引物对的第二捕获引物包括第二捕获引物对的多种第二捕获引物。
在一些实施方案中，至少一种第一捕获引物对是多种第一捕获引物对。
在一些实施方案中，第二层包含至少一种第二捕获引物对。在一些实施方案中，至少一种第二捕获引物对是多种第二捕获引物对。
本文提供的一些微阵列可以捕获dna测序文库中侧翼为通用捕获区域的靶多核苷酸。这些微阵列可以在第一层中具有第一捕获引物，所述第一捕获引物具有通用捕获区域，并且在其3’-末端未被封闭。这些微阵列中的一些具有具有第二捕获引物的第二层，所述第二捕获引物具有与第一层中的引物相同的通用捕获区域，并且是3’封闭的。参见，例如，图1.4。这些微阵列中的其他一些没有第二捕获引物和/或没有第二层。参见，例如，图3.2和3.3。
在一些实施方案中，至少一种第一捕获引物对的引物包含通用捕获区域。在一些实施方案中，至少一种第一捕获引物对的第一引物包含
在一些实施方案中，第二层包含至少一种第二捕获引物对。在一些实施方案中，至少一种第二捕获引物对是多种第二捕获引物对。
在一些实施方案中，至少一种第二捕获引物对的引物在3’-末端被封闭。在一些实施方案中，至少一种第二捕获引物对的引物为3’-磷酸封端的。在一些实施方案中，至少一种第二捕获引物对的3’-磷酸封端的引物包含通用捕获区域。在一些实施方案中，至少一种第二捕获引物对的第一引物包含
本文提供的一些微阵列可以捕获dna测序文库中侧翼为sbs区域的靶多核苷酸。参见，例如，图2.2。这些微阵列可以在其第一层中具有捕获引物，所述捕获引物具有与sbs组合的通用捕获区域。第二层可以具有捕获引物，所述捕获引物具有通用捕获区域并且是3’未封闭的。在一些实施方案中，dna测序文库可包含侧翼为p5-sbs3和/或p7-sbs8核苷酸序列或其片段的靶多核苷酸。在一些实施方案中，p5-sbs3和/或p7-sbs8核苷酸序列的片段可以比全长p5-sbs3和/或p7-sbs8核苷酸序列短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个核苷酸。
在一些实施方案中，至少一种第一捕获引物对的引物还包括sbs。在一些实施方案中，至少一种第一捕获引物对的第一引物包含
在一些实施方案中，至少一种第二捕获引物对的引物在3’末端不被封闭。在一些实施方案中，至少一种第二捕获引物对的引物包含通用捕获区域。在一些实施方案中，至少一种第二捕获引物对的第一引物包含
本文提供的一些微阵列具有多个孔，从而多个孔的每一个孔具有固定的靶多核苷酸的单克隆群体。固定的靶多核苷酸可以被附接至任何捕获引物，包括例如至少一种第一捕获引物对的任何捕获引物或至少一种第二捕获引物对的任何捕获引物。靶多核苷酸可以被附接至孔内的一些或所有捕获引物。微阵列的任何数目的孔可以具有靶多核苷酸的单克隆群体，包括一个孔、一些孔或全部孔。
靶多核苷酸的一些单克隆群体可以基本上由单个靶多核苷酸的扩增子组成。靶多核苷酸的一些单克隆群体可以包括小部分(smallfractions)一个或更多个另外的多核苷酸。例如，靶多核苷酸的一些单克隆群体可以包括单一主要靶多核苷酸的扩增子和小于30％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％、小于3％、小于2％或小于1％的小部分其他多核苷酸。
靶多核苷酸可以被附接至孔内的一些或所有捕获引物。例如，靶多核苷酸可以被附接至孔内的多于0.5％、多于1％、多于2％、多于3％、多于5％、多于10％、多于15％、多于20％、多于25％、多于30％、多于35％、多于40％、多于45％、多于50％、多于55％、多于60％、多于65％、多于70％、多于75％、多于80％、多于85％、多于90％、多于95％、多于98％、多于99％、多于99.9％、多于99.99％或100％的捕获引物。
在一些微阵列中，多于1％、多于2％、多于3％、多于5％、多于10％、多于15％、多于20％、多于25％、多于30％、更多多于35％、多于40％、多于45％、多于50％、多于55％、多于60％、多于65％、多于70％、多于75％、多于80％、多于85％、多于90％、多于95％、多于98％、或多于99％的孔具有固定的靶多核苷酸的单克隆群体。
不同的孔可以具有相同靶多核苷酸或不同靶多核苷酸的单克隆群体。在一些微阵列中，多于多于1％、多于2％、多于3％、多于5％、多于10％、多于15％、多于20％、多于25％、多于30％、多于35％、多于40％、多于45％、多于50％、多于55％、多于60％、多于65％、多于70％、多于75％、多于80％、多于85％、多于90％、多于95％、多于98％、或多于99％的孔具有相同的固定的靶多核苷酸的单克隆群体。在一些微阵列中，多于多于1％、多于2％、多于3％、多于5％、多于10％、多于15％、多于20％、多于25％、多于30％、多于35％、多于40％、多于45％、多于50％、多于55％、多于60％、多于65％、多于70％、多于75％、多于80％、多于85％、多于90％、多于95％、多于98％、多于99％、多于99.9％或多于99.99％的孔具有不同的固定的靶多核苷酸的单克隆群体。在一些微阵列中，多于1个、多于3个、多于30个、多于100个、多于300个、多于1,000个、多于3,000个、多于10,000个或多于30,000个孔各自具有不同的固定的靶多核苷酸的单克隆群体。
在一些实施方案中，将至少一种第一捕获引物对的多种捕获引物附接至靶多核苷酸。在一些实施方案中，多种靶多核苷酸在至少一个孔中形成靶多核苷酸的单克隆群体。在一些实施方案中，至少一个孔包括多个孔，并且其中多个孔的两个或更多个孔包含靶多核苷酸的单克隆群体。在一些实施方案中，多个孔的两个或更多个孔包含相同靶多核苷酸的单克隆群体。在一些实施方案中，多个孔的两个或更多个孔包含两种或更多种不同靶多核苷酸的单克隆群体。
在一些实施方案中，至少一种第一捕获引物对是多种第一捕获引物对，并且至少一种第二捕获引物对是多种第二捕获引物对，并且其中多种第一捕获引物对和多种第二捕获引物对中的多种引物被附接至多种靶多核苷酸。在一些实施方案中，多种靶多核苷酸在至少一个孔中形成靶多核苷酸的单克隆群体。在一些实施方案中，至少一个孔是多个孔，并且其中多个孔的两个或更多个孔包含靶多核苷酸的单克隆群体。在一些实施方案中，多个孔的两个或更多个孔包含相同靶多核苷酸的单克隆群体。在一些实施方案中，多个孔的两个或更多个孔包含两种或更多种不同靶多核苷酸的单克隆群体。
本文提供的用于扩增核酸的方法使得能够在诸如微阵列孔的孔中形成固定的靶多核苷酸的扩大的单克隆群体。一些方法包括两步扩增过程。参见，例如，图1-3。在这两步过程中，首先将靶多核苷酸捕获在尺寸适于kea的孔中，并进行kea以在孔的范围内产生固定的靶多核苷酸的单克隆群体。单个靶多核苷酸可以在孔内捕获和扩增。在第二步中，靶多核苷酸的单克隆群体被扩大到超出孔的极限，例如通过桥式扩增或第二kea。
在另一方面，本文提供了一种用于扩增核酸的方法，所述方法包括：a)在基底上产生第一层，其中基底包括至少一个孔、围绕所述孔的表面和内部孔表面，其中第一层覆盖内部孔表面；b)在第一层中沉积至少一种第一捕获引物对；c)在基底上产生第二层，所述第二层覆盖第一层和围绕孔的表面；d)使包含多种靶多核苷酸的样品与基底在足以使靶多核苷酸与至少一种第一捕获引物对的捕获引物杂交的条件下接触，以及e)进行第一kea以从孔内的靶多核苷酸产生扩增子的单克隆群体，从而扩增靶多核苷酸。此类方法的示例性说明见于，例如，图1中。
在一些实施方案中，使包含多种靶多核苷酸的样品与基底在足以使每孔单个靶多核苷酸与至少一种第一捕获引物对的捕获引物杂交的条件下接触。
在一些实施方案中，第一kea从与至少一个孔中的捕获引物杂交的单个靶多核苷酸产生扩增子的单克隆群体。在一些实施方案中，至少一个孔是多个孔，并且从多个孔的两个或更多个孔中的单个靶多核苷酸产生扩增子的单克隆群体。多个孔的两个或更多个孔可以包括微阵列的例如多于1％、多于2％、多于3％、多于5％、多于10％、多于15％、多于20％、多于25％、多于30％、多于35％、多于40％、多于45％、多于50％、多于55％、多于60％、多于65％、多于70％、多于75％、多于80％、多于85％、多于90％、多于95％、多于98％、多于99％、多于99.9％、多于99.99％或100％的孔。
在一些实施方案中，从多个孔的两个或更多个孔中的相同的单个靶多核苷酸产生扩增子的单克隆群体。在一些实施方案中，从多个孔的两个或更多个孔中的两种或更多种单个靶多核苷酸产生扩增子的单克隆群体。两种或更多种单个靶多核苷酸可以包括例如至少2个、至少3个、至少5个、至少10个、至少30个、至少100个、至少300个、至少1,000个、至少3,000个、至少10,000个、至少30,000个、或至少100,000个单个靶多核苷酸。
可以使用任何怀疑包含感兴趣的靶多核苷酸的样品。样品可以包括dna测序文库。dna测序文库可以从例如固体组织样品或液体活组织检查获得。可以例如从患病受试者或健康受试者获得固体组织样品或活检的液体。患病受试者可以包括例如癌症患者或罹患遗传疾病的患者。健康受试者可以包括例如临床试验的阴性对照组中的受试者或怀疑处于罹患疾病状况风险中的受试者。受试者或患者可以包括人类或动物，包括例如任何哺乳动物(例如，猴、猿、大鼠、小鼠、仓鼠、猫、狗、马、牛、绵羊等)。
在一些实施方案中，该方法还包括在第二层中沉积至少一种第二捕获引物对。
在一些实施方案中，在进行第一kea之前沉积至少一种第二捕获引物对。
在本文提供的一些方法中，在微阵列的孔中产生第一层，并且将第一对通用捕获引物沉积在第一层中。参见，例如，图1.1和1.2。产生覆盖第一层和围绕孔的微阵列表面的第二层，并且将第二对通用捕获引物沉积在第二层中，第二引物对具有与第一对相同的通用捕获区域，但为3’封闭的。参见，例如，图1.3和1.4。在3’-和/或5’-末端具有侧翼通用引物区域的靶多核苷酸被捕获在孔中，第一对的未封闭捕获引物被延长，并且第一轮kea导致在孔内形成靶多核苷酸的单克隆群体。参见，例如，图1.5。第二对通用捕获引物被去封闭，并且随后进行第二轮kea或桥式扩增，以扩大靶多核苷酸的单克隆群体超出孔的范围。参见，例如，图1.6和1.7。
在一些实施方案中，至少一种第一捕获引物对的引物包含通用捕获区域。在一些实施方案中，至少一种第一捕获引物对的第一捕获引物包含
在一些实施方案中，至少一种第二捕获引物对的引物在3’-末端被封闭。在一些实施方案中，通用捕获区域包含
在一些实施方案中，至少一种第二捕获引物对的引物在3’-末端是未封闭的。
在另一方面，本文提供了用于扩增核酸的方法，所述方法包括：a)在基底上产生第一层，其中基底包括至少一个孔、围绕所述孔的表面和内部孔表面，其中第一层至少部分地覆盖内部孔表面；b)在第一层中沉积至少一种第一捕获引物对，其中第一捕获引物对包括多种第一捕获引物和多种第二捕获引物，所述多种第一捕获引物包含含
在另一方面，本文提供了用于扩增核酸的方法，所述方法包括：a)在基底上产生第一层，其中基底包括至少一个孔、围绕所述孔的表面和内部孔表面，其中第一层覆盖内部孔表面；b)在第一层中沉积至少一种第一捕获引物对；c)在基底上产生第二层，所述第二层覆盖第一层和围绕孔的表面；d)使包含多种靶多核苷酸的样品与所述基底在足以使靶多核苷酸与至少一种第一捕获引物对的捕获引物杂交的条件下接触，以及e)进行第一kea以从孔内的靶多核苷酸产生扩增子的单克隆群体，从而扩增靶多核苷酸。
在一些实施方案中，在微阵列的孔中产生第一层，并且将第一对捕获引物沉积在第一层中。参见，例如，图2.1和2.2。第一对捕获引物的捕获引物可以包含通用捕获区域和sbs。产生覆盖第一层和围绕孔的微阵列表面的第二层，并且将第二对捕获引物沉积在第二层中。第二对的捕获引物可以是未封闭的，并且包括与第一对的捕获引物相同的通用捕获区域。参见，例如，图2.3和2.4。在孔中捕获具有侧翼sbs区域的靶多核苷酸，第一对的捕获引物被延伸，并且第一轮kea导致在孔内形成靶多核苷酸的单克隆群体。参见，例如，图1.6(顶图和中图)。允许kea继续，并且继续的kea使用第二层中的第二对捕获引物扩大靶多核苷酸的单克隆群体超出孔。参见，例如，图2.6(底图)。
在一些实施方案中，至少一种第二引物对的引物包含通用捕获区域。在一些实施方案中，至少一种第一捕获引物对的引物还包含sbs。在一些实施方案中，至少一种第一引物对的第一引物包含
在一些实施方案中，第一kea进行延长的时间段以扩大扩增子的克隆群体超出至少一个孔。
在另一方面，本文提供了一种用于扩增核酸的方法，所述方法包括：a)在基底上产生第一层，其中基底包括至少一个孔、围绕孔的表面和内部孔表面，其中第一层至少部分地覆盖内部孔表面；b)在第一层中沉积至少一种第一捕获引物对，其中第一捕获引物对包括多个至少一种第一捕获引物和多个至少一种第二捕获引物，所述多个至少一种第一捕获引物包含含
在本文提供的一些方法中，在微阵列的孔中产生第一层，并且将第一对捕获引物沉积在第一层中。参见，例如，图3.1和3.2。第一对捕获引物的捕获引物包含通用捕获区域。产生覆盖第一层和围绕孔的微阵列表面的第二层。参见，例如，图3.2。具有侧翼通用捕获区域的靶多核苷酸被捕获在孔中，第一对的捕获引物被延伸并且第一轮kea导致在孔内形成靶多核苷酸的单克隆群体。参见，例如，图3.4。在第二层中沉积第二对捕获引物。第二对的捕获引物可以是未封闭的，并且包含与第一对的捕获引物相同的通用捕获区域。参见，例如图3.5。进行第二kea或桥式扩增，以使用第二层中的第二对捕获引物扩大靶多核苷酸的单克隆群体超出孔。参见，例如，图3.6。
在一些实施方案中，在进行第一kea之后沉积至少一种第二捕获引物对。在一些实施方案中，至少一种第一捕获引物对和至少一种第二捕获引物对的引物包含通用捕获区域。在一些实施方案中，通用捕获区域包含
在另一方面，本文提供了用于扩增核酸的方法，所述方法包括：a)在基底上产生第一层，其中基底包括至少一个孔、围绕孔的表面和内部孔表面，其中第一层至少部分地覆盖内部孔表面；b)在第一层中沉积至少一种第一捕获引物对，其中第一引物对包括多种第一捕获引物和多种第二捕获引物，所述多种第一捕获引物包含含
本文提供的方法可以将固定的靶多核苷酸的单克隆群体扩大多于5％、多于10％、多于15％、多于20％、多于25％、多于30％、多于35％、多于40％、多于45％、多于50％、多于55％、多于60％、多于65％、多于70％、多于75％、多于80％、多于85％、多于90％、多于95％、或多于100％。可以测量单克隆群体的尺寸和扩大，例如，依据单克隆群体的直径，依据单克隆群体内的靶多核苷酸扩增子的数目，或依据测序反应期间由单克隆群体产生的相对信号强度。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括在较大孔(其尺寸设为不适于kea)中的一步扩增方法。参见，例如，图4。扩大的孔可以包含用于从dna测序文库捕获靶多核苷酸的低丰度捕获引物和用于扩增捕获的靶多核苷酸的高丰度捕获引物，从而在较大孔的范围内产生固定的靶多核苷酸的单克隆群体。
在另一方面，本文提供了用于扩增核酸的方法，所述方法包括：a)在基底上产生层，其中基底包括至少一个孔、围绕所述孔的表面和内部孔表面，其中层至少部分地覆盖内部孔表面；b)在层中沉积至少一种第一捕获引物对和至少一种第二捕获引物对，其中至少一种第一捕获引物对的引物密度高于至少第二引物对的引物密度；c)使包含多种靶多核苷酸的样品与基底在足以使每孔单个靶多核苷酸与第二引物杂交的条件下接触，以及d)进行kea以从与孔内的第二引物杂交的单个靶多核苷酸产生扩增子的单克隆群体，从而扩增单个靶多核苷酸。此类方法的示例性说明见于，例如，图4。
在一些实施方案中，孔具有约1μm的直径。在一些实施方案中，孔具有约1μm或更大的直径。在一些实施方案中，孔具有约1μm或更小的直径。
在一些实施方案中，足以使每孔单个靶多核苷酸与第二引物杂交的条件包括低浓度的靶多核苷酸或dna测序文库。在一些实施方案中，足以使每孔单个靶多核苷酸与第二引物杂交的条件包括通过kea快速扩增第一捕获的靶多核苷酸。通过kea快速扩增第一捕获的靶多核苷酸可以防止第二靶多核苷酸与捕获引物在与第一捕获的靶多核苷酸相同的孔中的杂交。
在一些实施方案中，多种靶多核苷酸侧翼为sbs，每一个sbs包含
在一些实施方案中，至少一种第一捕获引物对的引物包含通用捕获区域。在一些实施方案中，至少一种第一捕获引物对包括多种第一捕获引物和多种第二捕获引物，所述多种第一捕获引物包含
在一些实施方案中，至少一种第二捕获引物对的引物包含通用捕获区域和sbs。在一些实施方案中，至少一种第二捕获引物对包括多种第一捕获引物和第二多种捕获引物，所述多种第一捕获引物包含
在另一方面，本文提供了用于修饰固定在基底上的捕获引物的方法。具体地，本文提供的方法允许在图案化流通池的孔中修饰通用捕获引物，以在图案化流通池的一个或更多个孔中产生单克隆靶多核苷酸特异性捕获引物，并在图案化的流通池上产生单克隆靶核苷酸特异性捕获孔或垫。参见，例如，图10。该方法可以包括在图案化流通池上排除扩增(通过kea)模板核酸文库。例如在图6和7中示出了本文提供的一些方法的示例性图示。每一种种模板核酸可以包括一个或更多个靶特异性捕获区域。参见，例如，图6a-d。在图案化流通池上的模板核酸文库的排除扩增导致在图案化流通池的一个或更多个孔或垫中形成模板核酸扩增子的单克隆群体。参见，例如，图7a。例如使用限制性酶的模板核酸扩增子的单克隆群体的进一步处理可以产生嵌合捕获引物和再生的通用捕获引物，所述嵌合捕获引物包含通用捕获区域和靶特异性捕获区域。参见，例如，图7b-c。在一些实施方案中，在图案化的流通池上形成多个单克隆靶特异性孔或垫，使得不同的孔或垫可以靶特异性地捕获不同的感兴趣的靶多核苷酸。参见，例如，图7d。
本文提供的方法可以包括使模板核酸与固定的捕获引物杂交。参见，例如，图7a。模板核酸可以包含在其3’-末端和/或5’-末端的侧翼通用捕获区域、靶特异性捕获区域和一个或更多个限制性位点。参见，例如，图6a-d。模板核酸可以与固定的捕获引物经由一个或更多个模板的侧翼通用捕获区域和引物的3’-末端通用捕获区域杂交。参见，例如，图7a。
在一些实施方案中，使多种模板核酸与多种固定的捕获引物杂交。多种模板核酸可以包括多个相同的模板核酸和/或多个不同的模板核酸。可以彼此区分不同的模板核酸，例如通过具有不同的靶特异性捕获区域或通过在不同位置具有相同的靶特异性捕获区域。
当使模板核酸与图案化的流通池上固定的捕获引物杂交时，可以调整杂交条件，使得每个垫仅单个模板核酸与垫中的固定的捕获引物杂交。每个垫仅单个模板核酸的杂交可以发生在图案化流通池上的一个或更多个垫上。图案化流通池的两个或更多个垫可以各自与具有相同核酸序列(例如，相同的靶特异性捕获序列)或不同核酸序列(例如，不同的靶特异性捕获序列)的单个模板核酸杂交。
延伸与靶核酸杂交的捕获引物以形成与模板核酸互补的固定的延伸产物。在图案化流通池上，一个或更多个垫可以仅具有单个延伸产物。图案化流通池上的两个或更多个垫可以各自具有单个延伸产物，所述单个延伸产物具有相同核酸序列或不同核酸序列。可以例如通过具有不同的靶特异性捕获区域或通过在不同位置具有相同的靶特异性捕获区域区分不同的延伸产物。
延伸产物的3’-末端可以与未延伸的固定的捕获引物经由其互补的3’-末端通用捕获区域杂交，从而形成桥结构。进行一轮或多轮桥式扩增以从每个垫单个延伸产物形成固定的模板核酸的单克隆簇。图案化流通池上的不同垫可以具有相同的固定的模板核酸或不同的固定的模板核酸的单克隆簇。
固定的模板核酸可以用限制性酶裂解以产生固定的嵌合捕获引物和再生的通用捕获引物。参见，例如，图7b-c。嵌合捕获引物各自具有捕获区域和靶特异性捕获区域。在图案化流通池上，一个或更多个垫各自具有相同的多个嵌合捕获引物。参见，例如，图7c。图案化流通池上的两个或更多个垫可以具有多个嵌合捕获引物，所述多个嵌合捕获引物是相同的嵌合捕获引物或不同的嵌合捕获引物。参见，例如，图7d。可以例如通过具有不同的靶特异性捕获区域区分不同的嵌合捕获引物。再生的通用捕获引物可以具有带有截短的通用捕获区域或核苷酸延伸的3’-末端。一些核苷酸延伸可以包含部分限制性位点。
在另一方面，本公开内容提供了用于修饰固定的捕获引物的方法，所述方法包括a)使包含多种固定的捕获引物的基底与至少一种模板核酸在足以杂交的条件下接触以产生至少一种固定的模板核酸，其中多种固定的捕获引物包括第一多种引物和第二多种引物，所述第一多种引物包含3’-末端通用捕获区域y，所述第二多种引物包含3’-末端通用捕获区域z，并且其中每一种模板核酸侧翼为5’-末端和3’-末端通用捕获区域y或z，并且包含一个或更多个限制性位点和在5’-末端通用捕获区域和一个或更多个限制性位点之间或在3’-末端通用捕获区域和一个或更多个限制性位点之间的靶特异性捕获区域，以及b)延伸与模板核酸杂交的至少一种固定的捕获引物以产生与至少一种模板核酸互补的至少一种固定的延伸产物。
在一些实施方案中，模板核酸的通用捕获区域y和/或z可以包含与固定的捕获引物的通用捕获区域中的核酸序列相同的核酸序列。
在一些实施方案中，模板核酸的通用捕获区域y和/或z可以包含与固定的捕获引物的通用捕获区域中的核酸序列互补的核酸序列。
在一些实施方案中，模板核酸的第一通用捕获区域y或z可以包含与第一固定的捕获引物的通用捕获区域中的核酸序列互补的核酸序列，且模板核酸的第二通用捕获区域y或z可以包含与第二固定的捕获引物的通用捕获区域中的核酸序列相同的核酸序列。
通用捕获区域y或z可以具有相同的核酸序列或不同的核酸序列。通用捕获区域y可以在模板核酸的3’-末端或5’-末端。通用捕获区域z可以在模板核酸的3’-末端或5’-末端。通用捕获区域y或z可以包含任何通用捕获区域。
在一些实施方案中，模板核酸在其3’-末端或5’-末端具有第一通用捕获区域和在与第一通用捕获区域相对(3’-或5’-)末端的第二通用捕获区域，所述第一通用捕获区域包含第一固定的捕获引物的通用捕获区域的核酸序列，从而第二通用捕获区域包含与第二固定的捕获引物的通用捕获区域互补的核酸序列。
在一些实施方案中，模板核酸包含在其5’-末端的第一通用捕获区域y和在其3’-末端的第二通用捕获区域z’，所述第一通用捕获区域y包含第一固定的捕获引物的通用捕获区域y’的核苷酸序列，所述第二通用捕获区域z’包括与第二固定的捕获引物的通用捕获区域z的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
在一些实施方案中，模板核酸包含在其5’-末端的第一通用捕获区域z和在其3’-末端的第二通用捕获区域y’，所述第一通用捕获区域z包含第一固定的捕获引物的通用捕获区域z’的核苷酸序列，所述第二通用捕获区域y’包含与第二固定的捕获引物的通用捕获区域y的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
在一些实施方案中，模板核酸包含在其5’-末端的第一通用捕获区域y’和在其3’-末端的第二通用捕获区域z，所述第一通用捕获区域y’包含第一固定的捕获引物的通用捕获区域y的核苷酸序列，所述第二通用捕获区域z包含与第二固定的捕获引物的通用捕获区域z’的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
在一些实施方案中，模板核酸包含在其5’-末端的第一通用捕获区域z’和在其3’-末端的第二通用捕获区域y，所述第一通用捕获区域z’包含第一固定的捕获引物的通用捕获区域z的核苷酸序列，所述第二通用捕获区域y包括与第二固定的捕获引物的通用捕获区域y’的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
在一些实施方案中，模板核酸包含在其5’-末端的第一通用捕获区域和在其3’-末端的第二通用捕获区域，所述第一通用捕获区域包含
在一些实施方案中，模板核酸包含在其3’-末端的第一通用捕获区域和在其5’-末端的第二通用捕获区域，所述第一通用捕获区域包含
在一些实施方案中，模板核酸包含在其5’-末端的第一通用捕获区域和在其3’-末端的第二通用捕获区域，所述第一通用捕获区域包含
在一些实施方案中，模板核酸包含在其3’末端的第一通用捕获区域和在其5’-末端的第二通用捕获区域，所述第一通用捕获区域包含
模板核酸可以具有一个或更多个靶特异性捕获区域。靶特异性捕获区域可以具有多于8个、多于10个、多于12个、多于14个、多于16个、多于16个、多于18个、多于20个、多于22个、多于24个、多于26个、多于28个、或多于30个核酸的靶特异性捕获序列。一些靶特异性捕获区域具有10和20个核酸之间的靶特异性捕获序列。在一些模板核酸中，一个或更多个靶特异性捕获区域可以位于3’-末端通用捕获区域和限制性位点之间或者5’-末端通用捕获区域和限制性位点之间。参见，例如，图6a和b。
模板核酸可以具有两个或更多个靶特异性捕获区域。参见，例如，图6c。两个或更多个靶特异性捕获区域可以是相同的靶特异性捕获区域或不同的靶特异性捕获区域。一些模板核酸具有第一和第二靶特异性捕获区域。第一靶特异性捕获区域可以位于3’-末端通用捕获区域和第一限制性位点之间，并且第二靶特异性捕获区域可以位于5’-末端通用捕获区域和第二限制性位点之间。第一和第二靶特异性捕获区域可以是相同的靶特异性捕获区域或不同的靶特异性捕获区域。
在一些实施方案中，至少一种模板核酸包含两个限制性位点和两个限制性位点之间的间隔区域。在一些实施方案中，两个限制性位点是sapi限制性位点。在一些实施方案中，间隔区域包括约150个碱基。
至少一种模板核酸可以是多种模板核酸。多种模板核酸可以是多个相同的模板核酸或多个不同的模板核酸。在一些方法中，至少一种模板核酸包括多于2个、多于3个、多于5个、多于8个、多于10个、多于15个、多于20个、多于30个、多于100个、多于300个、多于1,000个、多于3,000个、多于10,000个、多于30,000个、多于100,000个、多于300,000个、或多于1,000,000个的多个不同模板核酸。不同的模板核酸中的每一种可以是相同的多个模板核酸。
模板核酸可以具有一个或更多个限制性位点。一些模板核酸具有两个或更多个限制性位点。两个或更多个限制性位点可以是相同的限制性位点或不同的限制性位点。一些模板核酸可以具有一个或更多个sapi限制性位点。一些模板核酸具有包含5’-gctcttc-3’核酸序列或5’-gaagacg-3’核苷酸序列的限制性位点。一些模板核酸具有包含5’-gctcttcn/nnn-3’核酸序列或5’-n/nnngaagacg-3’核酸序列的限制性位点。参见，例如，图6d。
模板核酸的两个或更多个限制性位点可以任选地被间隔区域分隔。可以优化间隔区域的长度，以促进模板核酸与两种固定的捕获引物经由其侧翼通用捕获区域杂交并促进桥形成。参见，例如，图6a和7a。间隔区域的长度可以是多于3个、多于5个、多于8个、多于10个、多于15个、多于20个、多于25个、多于50个、多于75个、多于100个、多于125个、多于150个、多于175个、多于200个、多于225个、或多于250个核酸。一些模板核酸具有约150个核酸的间隔区域。
模板核酸可以包含一个或更多个另外的区域，例如sbs。另外的区域可以位于模板核酸的任何位置。例如，sbs可以位于例如靶特异性区域和3’-末端通用捕获区域之间。一些模板核酸可以包含两个或更多个sbs。
在一些实施方案中，基底是包括多个垫的图案化流通池。参见，例如，图7a-c。在一些实施方案中，多个垫是布置为微阵列的多个孔。一些图案化流通池可以具有多于3个、多于10个、多于30个、多于100个、多于300个、多于1,000个、多于3,000个、多于10,000个、多于30,000个、多于100,000个、多于300,000个、或多于1,000,000个垫。在一些实施方案中，多个垫的每一个垫包括第一多种固定的通用捕获引物和第二多种固定的通用捕获引物，所述第一多种固定的通用捕获引物包含3’-末端通用捕获区域y，所述第二多种固定的通用捕获引物包含3’-末端通用捕获区域z。参见，例如，图7a。
在一些实施方案中，每个垫单个模板核酸与多个垫中的一个或更多个垫的每个垫单个捕获引物杂交。参见，例如，图10。在多个垫的两个或更多个垫中，与两个或更多个垫的每一个中的单个捕获引物杂交的单个模板核酸可以是包含相同靶特异性捕获区域或不同靶特异性捕获区域的模板核酸。
可以例如通过dna聚合延伸与单个模板核酸杂交的单个捕获引物，以形成与模板核酸互补的单个固定的延伸产物。在图案化的流通池上，一个或更多个垫可以各自仅具有单个固定的延伸产物。在图案化流通池的两个或更多个垫中，单个固定的延伸产物可以包含相同的靶特异性捕获区域或不同的靶特异性捕获区域。
在一些实施方案中，每个垫单个固定的延伸产物在图案化流通池的多个垫的一个或更多个垫中产生。参见，例如，图10。在一些实施方案中，在多个垫中，每个垫单个固定的延伸产物与相同的模板核酸互补。在一些实施方案中，在多个垫中，每个垫单个固定的延伸产物与两种或更多种不同的模板核酸互补。在一些实施方案中，在多个垫的至少1％、至少3％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的垫中，每个垫单个固定的延伸产物与不同的模板核酸互补。在一些实施方案中，在多个垫的多于1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的垫中，产生每个垫单个固定的延伸产物。在一些实施方案中，在多个垫的小于100％、95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％或1％的垫中，产生每个垫单个固定的延伸产物。
在一些实施方案中，该方法还包括通过聚合酶链式反应(pcr)扩增至少一种固定的延伸产物以产生固定的双链模板核酸的至少一个单克隆簇。固定的双链模板核酸的单克隆簇包含多个固定的双链模板核酸。例如，单克隆簇可以包含多于3个、多于10个、多于30个、多于100个、多于300个、多于1,000个、多于3,000个、多于10,000个、多于30,000个、多于100,000个、多于300,000个、或多于1,000,000个固定的双链模板核酸。
在本文提供的方法中，通过pcr扩增可以包括桥式扩增或kea。参见，例如，图8c。
图11-15说明用于转化固定的双链模板核酸的单克隆簇以形成包含靶特异性捕获区域的修饰的捕获引物的方法的示例性实施方案。显示了各对双链模板核酸(individualpairsofdouble-strandedtemplatenucleicacids)的转化。
图11示出了用于处理包含单个sapi限制性位点的固定的双链模板核酸的示例性方法。模板核酸还包含在3’-末端的通用捕获区域(p7’；与
图12示出了用于处理使用固定的
图13示出了用于处理包含两个sapi限制性位点的固定的双链模板核酸的示例性方法。图13的固定的双链模板核酸的sapi消化导致固定的双链嵌合捕获引物和多种双链固定的再生的通用捕获引物的形成，所述固定的双链嵌合捕获引物包含通用捕获区域(p7)和靶特异性捕获区域(cp)。双链捕获引物的变性导致单链文库就绪捕获引物的形成。在图13的方法中，固定的双链模板核酸的sapi消化去除单链固定的嵌合捕获引物的靶特异性捕获区域的一个核苷酸。图12b的文库就绪捕获引物可以用于从包含具有p5核苷酸序列(并且没有部分sapi限制性位点)的通用捕获区域的测序文库测序靶多核苷酸。
图14示出了用于处理包含一个sapi限制性位点的固定的双链模板核酸的示例性方法。图14的固定的双链模板核酸的sapi消化导致固定的双链嵌合捕获引物和多种双链固定的再生的通用捕获引物的形成，所述固定的双链嵌合捕获引物包含通用捕获区域(p7)和靶特异性捕获区域(cp)，所述多种双链固定的再生的通用捕获引物包含通用捕获区域(p5)和部分sapi限制性位点(ncttctcg)。双链捕获引物的变性导致单链捕获引物的形成。为了从单链再生的通用捕获引物中去除部分sapi限制性位点，可以使嵌合捕获引物和再生的通用捕获引物的通用捕获区域与互补寡核苷酸杂交以形成双链dna的区域，同时留下再生的捕获引物的部分限制性位点为单链。可以通过用外切核酸酶诸如外切核酸酶i处理来去除单链部分限制性位点。可以例如通过变性(例如，化学或热)去除互补寡核苷酸以形成单链文库就绪捕获引物。图14的文库就绪捕获引物可以用于从包含具有p5核苷酸序列(并且没有部分sapi限制性位点)的通用捕获区域的测序文库测序靶多核苷酸。
图15示出了用于处理包含一个sapi限制性位点和通用捕获区域px的固定的双链模板核酸的示例性方法。图15的流通池包括三个固定的通用捕获引物，所述固定的通用捕获引物包含
在一些实施方案中，该方法还包括使固定的双链模板核酸的至少一个单克隆簇与至少一种限制性酶接触以切割固定的双链模板核酸中的一个或更多个限制性位点以产生多种固定的双链嵌合捕获引物和多种双链固定的再生的通用捕获引物，所述多种固定的双链嵌合捕获引物包含通用捕获区域和靶特异性捕获区域。参见，例如，图7b和c。
双链模板核酸可以与一种或更多种不同的限制性酶接触。在一些方法中，双链模板核酸与2种、3种、4种、5种或更多种不同的限制性酶接触。在一些实施方案中，至少一种限制性酶包括sapi。
在双链嵌合捕获引物和再生的通用捕获引物中，一条链共价附接至该表面，而另一条链不共价附接至该表面。该方法可以包括将两条链分离形成共价附接至表面的单链嵌合捕获引物和再生的通用捕获引物的步骤。链可以分离，例如通过变性，诸如热或化学变性，或通过酶促降解。参见，例如，图11-15。酶促降解可以包括核酸酶消化。例如，双链引物可以用外切核酸酶诸如5’-3’dsdna外切核酸酶(例如，t7外切核酸酶)处理，其以5’→3’方向特异性地消化双链dna中的核苷酸链。参见，例如，图14。表面附接保护了双链嵌合捕获引物和再生的通用捕获引物中共价附接的链的5’-末端免受5’-3’dsdna外切核酸酶消化，而未共价附接至表面的链被消化。
在一些实施方案中，该方法还包括使多个固定的双链嵌合捕获引物和多种双链固定的再生的通用捕获引物变性以产生多种单链固定的嵌合捕获引物和多种单链固定的再生的通用捕获引物。变性可以包括例如热变性或化学变性或其组合。参见，例如，图10和11。
在一些实施方案中，该方法还包括使多个固定的双链嵌合捕获引物和多种双链固定的再生的通用捕获引物与5’-3’双链脱氧核糖核酸(dsdna)外切核酸酶接触以产生多种单链固定的嵌合捕获引物和多种单链固定的再生的通用捕获引物。
在一些实施方案中，基底是包括多个垫的图案化流通池。在一些实施方案中，多个垫是布置在微阵列中的多个孔。在一些实施方案中，多个垫中的一个或更多个垫包含第一多种捕获引物和第二多种通用捕获引物，所述第一多种捕获引物包含3’-末端通用捕获区域y，所述第二多种通用捕获引物包含3’-末端通用捕获区域z。在一些实施方案中，在多个垫的一个或更多个垫中，多于1％、多于5％、多于10％、多于20％、多于30％、多于40％、多于50％、多于60％、多于70％、多于80％、多于90％、多于95％、多于99％、多于99.9％或多于99.99％的包含3’-末端通用捕获区域y的捕获引物被转化为单链固定的嵌合捕获引物。在一些实施方案中，在多个垫的一个或更多个垫中，多于1％、多于5％、多于10％、多于20％、多于30％、多于40％、多于50％、多于60％、多于70％、多于80％、多于90％、多于95％、多于99％、多于99.9％或多于99.99％的包含3’-末端通用捕获区域z的捕获引物被转化为单链固定的嵌合捕获引物。在一些实施方案中，在多个垫中的一个或更多个垫中，多于1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的包含3’-末端通用捕获区域y的捕获引物被转化为单链固定的嵌合捕获引物，且多于1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的包含3’-末端通用捕获区域z的捕获引物被转化为单链固定的嵌合捕获引物。
在另一方面，本文提供了用于修饰固定的捕获引物的方法，所述方法包括a)使包含多种固定的捕获引物的基底与至少一种模板核酸在足以杂交的条件下接触，以产生至少一种固定的模板核酸，其中多种固定的捕获引物包括第一多种引物和第二多种引物，所述第一多种引物包含3’-末端
在另一方面，本文提供了用于修饰固定的捕获引物的方法，所述方法包括a)使包含多种固定的捕获引物的基底与至少一种模板核酸在足以杂交的条件下接触，以产生至少一种固定的模板核酸，其中多种固定的捕获引物包括第一多种引物和第二多种引物，所述第一多种引物包含3’-末端通用捕获区域y，所述第二多种引物包含3’-末端通用捕获区域z，并且其中至少一种模板核酸侧翼为5’-末端和3’-末端通用捕获区域y或z，并且包含一个或更多个限制性位点和在一个或更多个限制性位点和3’末端通用捕获区域之间的靶特异性捕获区域；b)延伸与至少一种模板核酸杂交的至少一个固定的捕获引物以产生与至少一种模板核酸互补的至少一种固定的延伸产物；c)通过pcr扩增至少一种固定的延伸产物以产生固定的双链模板核酸的至少一个单克隆簇；d)使固定的双链模板核酸的至少一个单克隆簇与限制性酶接触以切割固定的双链模板核酸中的一个或更多个限制性位点以产生多种固定的双链嵌合捕获引物和多种固定的双链再生的通用捕获引物，所述多种固定的双链嵌合捕获引物包含通用捕获区域z和靶特异性捕获区域，所述多种固定的双链再生的通用捕获引物包含通用捕获区域y。参见，例如，图7a。
在一些实施方案中，多种固定的再生的通用捕获引物包含3’-末端部分限制性位点。在一些实施方案中，该方法包括从多种固定的再生的通用捕获引物中去除3’-末端部分限制性位点。参见，例如，图12-15。
在一些实施方案中，多种固定的再生的通用捕获引物包含预先确定的裂解位点。在一些实施方案中，预先确定的裂解位点包含二醇连接体、8-氧代鸟嘌呤(8-氧代-g)、尿嘧啶碱基、核糖核苷酸、甲基化核苷酸或肽。参见，例如，图12a和b。
在一些实施方案中，去除部分限制性位点包括非酶促化学裂解。在一些实施方案中，非酶促化学裂解包括高碘酸盐处理、稀土金属离子处理、碱处理或光化学反应。
在一些实施方案中，去除3’-末端部分限制性位点包括酶促裂解。在一些实施方案中，酶促裂解包括尿嘧啶-dna糖基化酶裂解、内切核酸酶裂解、核糖核酸酶(rna酶)处理、限制性酶裂解或蛋白酶裂解。参见，例如，图12。
在一些实施方案中，去除3’-末端部分限制性位点包括使反向互补寡核苷酸与单链固定的再生的通用捕获引物杂交以形成双链通用捕获区域y。在一些实施方案中，该方法还包括使反向互补寡核苷酸与单链固定的嵌合捕获引物杂交以形成双链固定的嵌合捕获引物。在一些实施方案中，该方法还包括使基底与核酸酶接触以去除3’-末端部分限制性位点。在一些实施方案中，核酸酶是外切核酸酶。在一些实施方案中，外切核酸酶是外切核酸酶i。参见，例如，图14。
在一些实施方案中，固定的嵌合捕获引物的3’-末端靶特异性捕获区域是截短的。参见，例如，图13示出的示例性实施方案。
在一些实施方案中，至少一种模板核酸包含5’-末端通用捕获区域y、3’末端通用捕获区域z、包含第一和第二限制性位点以及在第一和第二限制性位点之间的间隔区域的中心部分、以及在中心部分和3’-末端通用捕获区域z之间的靶特异性捕获区域。在一些实施方案中，至少一种模板核酸还包含在靶特异性区域和3’-端通用捕获区域z之间的sbs。参见例如图13。
在一些实施方案中，该方法还包括：e)使包含多种靶多核苷酸的核酸样品与至少一种引物在足以杂交的条件下接触，所述至少一种引物包含衔接子；f)通过pcr扩增所述多种靶多核苷酸以产生多种扩增子；g)使多种固定的嵌合捕获引物与所述多种扩增子在足以杂交的条件下直接接触以产生第一多种固定的扩增子；h)延伸多种固定的嵌合捕获引物以产生与所述靶多核苷酸互补的多个固定的延伸产物，以及i)通过pcr扩增所述多个固定的延伸产物以产生第二多种固定的扩增子，其中所述固定的扩增子群体包括50％或更大的均匀性。在一些实施方案中，所述固定的扩增子群体包括55％或更大、60％或更大、65％或更大、70％或更大、75％或更大、80％或更大、85％或更大、90％或更大、95％或更大、98％或更大或99％或更大的均匀性。在一些实施方案中，均匀性包括80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94或95或更大。
可以例如，如美国专利申请号61/928,368中所述确定固定的扩增子的均匀性(也称为簇均匀性)，其通过引用在此并入本文。
在一些实施方案中，衔接子包含通用捕获区y或z。
在一些实施方案中，衔接子包含
在另一方面，本文提供了一种用于修饰固定的捕获引物的方法，所述方法包括：a)使固定在基底上的多种通用捕获引物与多种模板核酸在足以杂交的条件下接触以产生一种或更多种固定的模板核酸，其中多种通用捕获引物包括第一多种引物和第二多种引物，所述第一多种引物包含3’-末端通用捕获区域y，所述第二多种引物包含3’-末端通用捕获区域z，其中每一种模板核酸包含5’-末端通用捕获区域y、3’末端通用捕获区域z、靶特异性捕获区域、在5’-末端通用捕获区域y和靶特异性捕获区域之间的限制性位点、以及在3’-末端通用捕获区域z和靶特异性捕获部分之间的sbs；b)延伸一种或更多种通用捕获引物以产生与一种或更多种固定的模板核酸互补的一种或更多种固定的延伸产物；c)通过桥式扩增或kea扩增一种或更多种固定的延伸产物以产生固定的延伸产物的一种或更多种单克隆扩增子；d)使固定的延伸产物的一种或更多种单克隆簇与限制性酶接触以产生多种固定的嵌合捕获引物和多种固定的再生的通用捕获引物，所述多种固定的嵌合捕获引物包含通用捕获区域z和靶特异性捕获区域，所述多种固定的再生的通用捕获引物包含通用捕获区域y和部分限制性位点。例如，在图11中示出了该方法的示例性图示。
在另一方面，本文提供了一种用于修饰固定的捕获引物的方法，所述方法包括：a)使固定在基底上的多种通用捕获引物与多种模板核酸在足以杂交的条件下接触以产生一种或更多种固定的模板核酸，其中多种通用捕获引物包括第一多种引物和第二多种引物，所述第一多种引物包含3’-末端通用捕获区域y和第一预先确定的裂解位点，所述第二多种引物包含3’-末端通用捕获区域z和包含第二预先确定的裂解位点的5’部分，其中每一种模板核酸包含5’-末端通用捕获区域y、3’-末端通用捕获区域z、靶特异性捕获区域、在5’-末端通用捕获区域y和靶特异性捕获区域之间的限制性位点和在3’-末端通用捕获区域z和靶特异性捕获区域之间的sbs；b)延伸一种或更多种通用捕获引物以产生与一种或更多种模板核酸互补的一种或更多种固定的延伸产物；c)通过桥式扩增或kea扩增一种或更多种固定的延伸产物以产生固定的延伸产物的一种或更多种单克隆扩增子；d)使固定的延伸产物的一种或更多种单克隆扩增子与限制性酶接触以产生多种固定的嵌合捕获引物和多种固定的再生通用捕获引物，所述多种固定的嵌合捕获引物包含通用捕获区域z和靶特异性捕获区域，所述多种固定的再生通用捕获引物包含通用捕获区域y和部分限制性位点；e)通过在第一预先确定的裂解位点处裂解从多种固定的再生的通用捕获引物中去除部分限制性位点。参见，例如，图12a和b。在一些实施方案中，通用捕获区域y包含
在另一方面，本文提供了一种用于修饰固定的捕获引物的方法，所述方法包括：a)使固定在基底上的多种通用捕获引物与多种模板核酸在足以杂交的条件下接触以产生一种或更多种固定的模板核酸，其中所述多种通用捕获引物包括第一多种引物和第二多种引物，所述第一多种引物包含3’-末端通用捕获区域y，所述第二多种引物包含3’-末端通用捕获区域z，其中每一种模板核酸包含5’-末端通用捕获区域y、3’-末端通用捕获区域z、包含第一和第二限制性位点以及在第一和第二限制性位点之间的间隔区域的中心部分、以及在中心部分和3’-末端通用捕获区域z之间的靶特异性区域；b)延伸多种通用捕获引物中的一种或更多种通用捕获引物以产生与一种或更多种模板核酸互补的一种或更多种固定的延伸产物；c)通过桥式扩增或kea扩增一种或更多种固定的延伸产物以产生固定的延伸产物的一种或更多种单克隆扩增子，以及d)使固定的延伸产物的一种或更多种单克隆扩增子与限制性酶接触以产生多种固定的嵌合捕获引物和多种固定的再生通用捕获引物，所述多种固定的嵌合捕获引物包含通用捕获区域z和靶特异性捕获区域，所述多种固定的再生通用捕获引物包含通用捕获区域y。该方法的示例性图示如图13所示。
在另一方面，本文提供了一种用于修饰固定的捕获引物的方法，所述方法包括：a)使固定在基底上的多种通用捕获引物与多种模板核酸在足以杂交的条件下接触以产生一种或更多种固定的模板核酸，其中多种通用捕获引物包括第一多种引物和第二多种引物，所述第一多种引物包含3’-末端通用捕获区域y，所述第二多种引物包含3’-末端通用捕获区域z，其中每一种模板核酸包含5’-末端通用捕获区域y、3’-末端通用捕获区域z、靶特异性捕获区域和在5’-末端通用捕获区域y和靶特异性捕获区域之间的限制性位点；b)延伸多种通用捕获引物的一种或更多种通用捕获引物以产生与一种或更多种模板核酸互补的一种或更多种固定的延伸产物；c)通过桥式扩增或kea扩增一种或更多种固定的延伸产物以产生固定的延伸产物的一种或更多种单克隆扩增子；d)使固定的延伸产物的一种或更多种单克隆扩增子与限制性酶接触以产生多种双链固定的嵌合捕获引物和多种双链固定的再生通用捕获引物，所述多种双链固定的嵌合捕获引物包含通用捕获区域z和靶特异性捕获区域，所述多种双链固定的再生通用捕获引物包含通用捕获区域y和单链部分限制性位点；e)使多种双链固定的嵌合捕获引物和多个双链固定的再生通用捕获引物变性以产生多种单链固定的嵌合捕获引物和多个单链固定的再生通用捕获引物；f)使反向互补寡核苷酸与多种单链固定的嵌合捕获引物和多个单链固定的再生通用捕获引物杂交以形成双链通用捕获区域和双链靶特异性区域，以及g)使表面与外切核酸酶i接触以从多个双链固定的再生通用捕获引物中去除单链部分限制性位点。例如，在图14中示出了该方法的示例性图示。
在另一方面，本文提供了一种用于修饰固定的捕获引物的方法，所述方法包括：a)使固定在基底上的多种通用捕获引物与多种模板核酸在足以杂交的条件下接触以产生一种或更多种固定的模板核酸，其中多种通用捕获引物包括第一多种引物和第二多种引物和第三多种引物，所述第一多种引物包含3’-末端通用捕获区域y，所述第二多种引物包含3’-末端通用捕获区域z，所述第三多种引物包含3’-末端区域x和包含预先确定的裂解位点的5’部分，其中每一种模板核酸包含5’-末端区域x、3’-末端通用捕获区域z、靶特异性捕获区域、以及在区域x和靶特异性捕获区域之间的限制性位点；b)延伸一种或更多种通用捕获引物以产生与一种或更多种模板核酸互补的一种或更多种固定的延伸产物；c)通过桥式扩增或kea扩增一种或更多种固定的延伸产物以产生固定的延伸产物的一种或更多种单克隆扩增子；d)使固定的延伸产物的一种或更多种单克隆扩增子与限制性酶接触以产生多种固定的嵌合捕获引物和多种固定的再生通用捕获引物，所述多种固定的嵌合捕获引物包含通用捕获区域z和靶特异性捕获区域，所述多种固定的再生通用捕获引物包含区域x和部分限制性位点，以及e)通过在预先确定的裂解位点处裂解，从基底去除包含区域x的多个固定的再生捕获引物。参见，例如，图15。在一些实施方案中，通用捕获区域y包含
其中提供的模板核酸可以通过本领域技术人员已知的任何方法产生。例如，模板核酸可以以其全长形式通过寡核苷酸合成产生，例如，如图6a-c所示。
在另一方面，本文提供了用于产生本文提供的模板核酸的方法，所述方法包括产生两种或更多种部分模板核酸，例如，如图16所示。在一些实施方案中，两种或更多种部分模板核酸是可以彼此部分地杂交以形成部分模板核酸的二聚体的一对部分模板核酸。在一些实施方案中，该方法包括将部分模板核酸的二聚体中的部分模板核酸延伸以形成全长模板核酸的二聚体。
在另一方面，本文提供了部分模板核酸的对，其可以彼此部分地杂交以形成部分模板核酸的二聚体。一对中的第一部分模板核酸可以与第二部分模板核酸的小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％或小于10％的核酸序列部分地杂交。在一些实施方案中，一对中的部分模板核酸在其3’-末端处可以彼此部分地杂交。在一些实施方案中，一对中的部分模板核酸可以在其靶特异性捕获区域中彼此杂交。
在一些实施方案中，部分模板核酸的二聚体包含第一部分模板核酸和第二部分模板核酸，所述第一部分模板核酸包含5’-末端通用捕获区域y或z、限制性位点和3’-末端二聚化区域dr，所述第二部分模板核酸包含5’-末端通用捕获区域y或z和3’-末端二聚化区域dr，其中第一部分模板核酸的3’-末端dr和第二部分模板核酸的3’-末端dr彼此杂交。在一些实施方案中，第一和第二部分模板核酸的3’-末端dr包含靶特异性捕获区域。在一些实施方案中，第一和第二部分模板核酸的3’-末端dr包含测序引物结合位点(sbs)。在一些实施方案中，第一和第二部分模板核酸的3’-末端dr包括限制性位点(例如，sapi限制性位点)。
在一些实施方案中，部分模板核酸的二聚体包含第一部分模板核酸，所述第一部分模板核酸包含在其5’-末端的第一通用捕获区域(p5)、限制性位点(sapi)和在其3’-末端的靶特异性捕获区域(cp)。在一些实施方案中，部分模板核酸的二聚体具有第二部分模板核酸，所述第二部分模板核酸包含在其3’-末端的互补靶特异性捕获区域(cp’)、测序引物结合位点(sbs)和在其5’-末端的第二通用捕获区域(p7)。参见，例如，图16。
通过在任何另外的靶核酸可以在相同的区域内接种之前快速扩增在表面区域上“接种”的单个靶核酸，kea可以使得能够在表面区域(例如，图案化流通池上的垫上)生产单克隆靶核酸簇(例如，靶核酸扩增子)，并且kea可以达到超过泊松极限的单克隆核酸簇的密度。通常，在kea中，靶核酸接种的速率比靶核酸扩增的速率低得多，并且扩增机制通常在靶多核苷酸接种期间存在。本公开内容部分地基于以下认识：这些特征可以使kea与许多常用的测序文库制备方法不相容，所述测序文库制备方法对流通池内试剂或者对将单个分子递送至表面的速率具有竞争性要求。
本公开内容还部分地基于以下认识：通过将靶核酸接种与靶核酸扩增分离或通过将样品制备和靶核酸接种与靶核酸扩增分离可以避免以上提到的问题。例如，在本文提供的方法的一个实施方案中，最初以导致表面区域(例如，图案化流通池的垫或孔)的多克隆靶核酸占有率的靶核酸负载密度进行本领域已知的靶核酸接种方法。一小部分表面元件(例如，通用捕获引物)与靶核酸(例如，靶多核苷酸或模板核酸)在所选择的靶核酸接种条件下杂交。在选择的实验条件下，接种事件本身不能有效地用作核酸扩增和单克隆簇形成的触发。在单独的方法步骤中，引入单独的触发物以比扩增速率低得多的速率活化靶核酸，以确保在大多数情况下，几种接种的靶核酸中仅一种例如，在图案化流通池的孔或垫中被扩增以形成靶核酸的单克隆簇。
本公开内容还部分地基于以下认识：靶核酸的活化可以在靶向过程(参见，例如，图17-19)或随机过程(参见，例如，图20-21)中触发。在靶向过程中，靶核酸可以例如包括可以单独和独立地被活化的不同亚组。在随机过程中，可以随机活化不同的靶核酸，并且可以选择活化条件，使得靶核酸的随机活化以低频率发生。
在靶向活化过程的一个实例中，可以将不同的靶核酸附接至不同的标记物以区分不同亚组的靶核酸，其中靶核酸的每一个成员携带相同种类的标记物。靶核酸标记可以随机进行，例如，通过鸟枪标记(例如，加条形码)，或者标记可以被靶向(例如，序列特异性标记)。
图18示出了本文提供的使用靶向活化靶核酸的示例性方法的部分。在第一步中，将携带不同标记物a、b、c的不同亚组的靶核酸接种在图案化流通池的垫(例如，垫1)中。在单独的步骤中使用标记物特异性触发分子来活化特定亚组的靶核酸。在一些实施方案中，靶核酸特异性标记物可以是靶核酸特异性核酸序列，并且标记物特异性触发分子可以是包含互补靶特异性核酸序列的核酸引物。标记物特异性触发分子可以是例如如图18中示出的可溶性核酸引物。在一些实施方案中，标记物特异性触发分子本身可以固定在表面上，例如，如图19所示。在一些实施方案中，标记物特异性触发分子以比接种的靶核酸低得多的浓度存在于表面上。在一些实施方案中，可溶性或固定的触发分子可以是例如包含通用捕获区域和靶特异性捕获区域(例如图19中的p5/b’)的嵌合引物。
图20示出了本文提供的包括靶核酸随机活化的方法的示例性实施方案。在该实例中，接种的靶核酸包含掩蔽通用捕获区域p5的发夹结构，并且还包含可裂解的碱基。靶核酸的随机活化可以通过例如发夹结构的内切核酸酶消化和通用捕获区域的解除掩蔽(umasking)来实现。
在本文提供的包括靶核酸随机活化的方法的另一个实施方案中，靶核酸可以用附接的封闭剂(例如，蛋白质或珠)接种。单独接种的靶核酸的随机活化可以通过随后添加去封闭剂(例如蛋白酶)来实现。
在本文提供的包括靶核酸随机活化的方法的另一个实施方案中，接种的靶核酸可以包含非天然存在的核苷酸(例如具有异鸟嘌呤或异胞嘧啶碱基)。可以在kea中通过将天然核苷酸“错误地掺入”靶核酸扩增子代替非天然存在的核苷酸来实现单独靶核酸的随机活化。天然存在的核苷酸通常与靶核酸的非天然存在的核苷酸仅以低效率和低频率配对。
在包括靶核酸的随机活化的另一个示例性方法中，例如在测序文库中的靶核酸最初缺乏触发序列。在初始步骤中，可以通过在kea中包括低水平的嵌合引物(包含触发序列(例如，p5序列)和与靶核酸互补的序列(例如，sbs3序列)两者)，在随机过程中将触发序列添加至单独靶核酸。具有添加的触发序列(例如，p5)的单独靶核酸然后可以例如在图案化流通池的孔中接种，并经历扩增以形成单克隆簇。参见，例如，图21和实施例2。
在另一方面，本文提供了一种用于修饰固定的捕获引物的方法，所述方法包括：a)使具有多种固定的捕获引物的基底与多种不同的种子核酸在足以杂交的条件下接触以产生多种不同的固定的种子核酸；b)延伸多种固定的捕获引物的两种或更多种以产生与多种不同的固定的种子核酸中的两种或更多种互补的多种不同的固定的延伸产物；c)活化多种不同的固定的延伸产物的一种固定的延伸产物，以形成活化的捕获引物，以及d)任选地扩增活化的捕获引物以产生固定的修饰的捕获引物的单克隆簇。
在一些实施方案中，种子核酸包括例如在dna测序文库中或在基因组dna中的靶核酸。在一些实施方案中，种子核酸包括本文提供的模板核酸。在一些实施方案中，靶核酸是rna或包含一种或更多种异种核酸的核酸。
固定的延伸产物的活化可以是靶向活化，其中并非所有固定的延伸产物同样地可能被活化。活化可以靶向预先确定的亚组的固定的延伸产物，所述预先确定的亚组的固定的延伸产物比其他亚组的固定的延伸引物更可能被活化的。在其他实施方案中，固定的延伸产物的活化是随机活化，其中一些固定的延伸产物比其他固定的延伸产物更早活化，但其中不能例如基于固定的延伸产物中的结构或功能特征预先确定多个固定的延伸产物中哪些固定的延伸产物被较早地活化和哪些被较晚地活化。
在一些实施方案中，活化多种不同固定的延伸产物中的一种固定的延伸产物包括靶向活化。在一些实施方案中，靶向活化包括用多种不同标记物标记多种不同种子核酸以产生多种不同标记的种子核酸的初始步骤。在一些实施方案中，靶向活化还包括形成多种不同标记的固定的种子核酸。在一些实施方案中，靶向活化还包括形成多种不同标记的固定的延伸产物。在一些实施方案中，靶向活化还包括使多种不同标记的固定的延伸产物与一种或更多种标记物特异性触发分子接触以活化一种固定的延伸产物。
在一些实施方案中，初始标记步骤包括随机标记多种不同的种子核酸。在一些实施方案中，初始标记步骤包括靶向标记多种不同种子核酸。在一些实施方案中，靶向标记是序列特异性标记。在一些实施方案中，多种不同的种子核酸用小于50种、小于45种、小于40种、小于35种、小于30种、小于25种、小于20种、小于18种、小于16种、小于14种、小于12种、小于10种、小于8种、小于6种、小于4种或小于2种不同的标记物进行标记。在一些实施方案中，多种不同的种子核酸用20种、18种、16种、14种、12种、10种、8种、6种、4种或2种不同的标记物进行标记。在一些实施方案中，多种不同的种子核酸用10种或更多种、20种或更多种、30种或更多种、40种或更多种、50种或更多种、60种或更多种、80种或更多种、90种或更多种、100种或更多种、150种或更多种、200种或更多种、250种或更多种、300种或更多种、400种或更多种、500种或更多种、600种或更多种、700种或更多种、800种或更多种、900种或更多种、或1000种或更多种不同标记物进行标记。在一些实施方案中，不同的标记物是具有不同核酸序列的不同引物。在一些实施方案中，初始标记步骤包括将多种不同的引物连接至多种不同的种子核酸。在一些实施方案中，多种种子核酸的每一种种子核酸用独特的标记物进行标记。在一些实施方案中，多种种子核酸中的两种或更多种不同的种子核酸用相同的标记物进行标记(参见，例如，图21；sbs3作为标记物)。
在一些实施方案中，触发分子是包含触发区域的核酸。在一些实施方案中，触发区域包含靶特异性捕获区域。在一些实施方案中，触发区域包含通用捕获区域。在一些实施方案中，通用捕获区域包含
在一些实施方案中，活化多种不同固定的延伸产物中的一种固定的延伸产物包括随机活化。在一些实施方案中，随机活化包括使具有多种固定的捕获引物的基底与具有发夹结构的多种不同的种子核酸接触，以产生包含发夹结构的多种不同的固定的种子核酸。参见，例如，图20。在一些实施方案中，随机活化还包括延伸多种固定的捕获引物的两个或更多个以产生包含发夹结构的多种不同的固定的延伸产物。在一些实施方案中，随机活化还包括用裂解试剂活化包含发夹结构的多种固定的延伸产物之一。在一些实施方案中，裂解试剂是核酸酶。在一些实施方案中，核酸酶是内切核酸酶。在一些实施方案中，内切核酸酶是产生切口的内切核酸酶。在一些实施方案中，裂解试剂包含usertm混合物(newenglandbiolabs，ipswich，ma)或fpg-蛋白(例如，来自大肠杆菌)。在一些实施方案中，多种不同种子核酸中的一种或更多种不同的种子核酸包括可裂解的碱基。在一些实施方案中，可裂解的碱基是尿嘧啶或8-氧代鸟嘌呤(8-氧代-dg)。
在一些实施方案中，多种不同的种子核酸不包含触发区域，并且随机活化包括用包含触发区域的嵌合引物扩增多种不同种子核酸之一的初始步骤。
在一些实施方案中，在扩增多种不同种子核酸之一的初始步骤中，多种不同种子核酸以比包含触发区域的嵌合引物多于5倍、多于10倍、多于25倍、多于50倍、多于100倍、多于250倍、多于500倍、多于1,000倍、多于2,500倍、多于5,000倍、多于10,000倍、多于25,000倍、多于50,000倍或多于100,000倍的过量存在。
在一些实施方案中，触发区域包含靶特异性捕获区域。在一些实施方案中，触发区域包含通用捕获区域。在一些实施方案中，嵌合引物包含触发区域和sbs。在一些实施方案中，触发区域包含
在一些实施方案中，随机活化包括a)使具有多种固定的捕获引物的基底与多种不同的种子核酸在足以杂交的条件下接触以产生多种不同的固定的种子核酸，其中每一种不同的种子核酸包含一个或更多个修饰的核苷酸。在一些实施方案中，随机活化还包括b)延伸两种或更多种固定的捕获引物以产生与多种不同的固定的种子核酸互补的多种不同的固定的延伸产物，其中多种不同的固定的延伸产物的每一种包含一个或更多修饰的核苷酸。在一些实施方案中，随机活化还包括c)活化多种不同的固定的延伸产物之一以形成活化的捕获引物，其中活化的捕获引物不包含修饰的核苷酸。在一些实施方案中，修饰的核苷酸包括异鸟嘌呤(isog)或异胞嘧啶(isoc)。不希望受理论束缚，使用修饰的核苷酸的随机活化过程可以在条件下进行，其中随机活化是基于在核酸合成期间修饰的核苷酸与天然存在的核苷酸相比掺入的显著低得多的速率。可以通过调整修饰的核苷酸的浓度来进一步修改随机活化过程。例如，可以通过降低合成反应中修饰的核苷酸的浓度来进一步降低修饰的核苷酸掺入到生长中的核酸链中的速率。
在一些实施方案中，随机活化包括使具有多种固定的捕获引物的基底与包含与每一种种子核酸的一个末端结合的封闭试剂的多种不同的种子核酸在足以杂交的条件下接触以产生包含封闭剂的多种不同的固定的种子核酸，并使封闭剂与去封闭剂接触。在一些实施方案中，去封闭剂是蛋白酶(例如，蛋白酶k)。在一些实施方案中，去封闭剂包括洗涤剂或离液剂(例如dna，或蛋白变性剂)。在一些实施方案中，封闭剂是核酸结合蛋白。在一些实施方案中，封闭剂是珠(例如，链霉亲和素或抗dig包被的珠、或琼脂糖或聚合物珠)。在一些实施方案中，封闭剂包括病毒颗粒，例如噬菌体、受体-共同受体对、或疏水性分子和疏水性颗粒的组合。在一些实施方案中，封闭剂包括生物素化的核苷酸。在一些实施方案中，封闭剂包括链霉亲和素。
在一些实施方案中，扩增活化的捕获引物以产生固定的修饰的捕获引物的单克隆簇，包括kea或桥式扩增。在一些实施方案中，扩增活化的捕获引物以产生固定的修饰的捕获引物的单克隆簇，包括使用wildfire方案的dna合成(例如wildfire配对末端测序(wildfirepairedendsequencing))或滚环扩增。
在一些实施方案中，表面是包括多个孔的图案化流通池。在一些实施方案中，不同的固定的延伸产物在多个孔的两个或更多个孔中形成。在一些实施方案中，在多个孔的两个或更多个孔的每一个中形成活化的捕获引物。在一些实施方案中，活化的捕获引物在多个孔的至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的孔的每一个中形成。在一些实施方案中，在多个孔的两个或更多个孔的每一个中形成的活化的捕获引物是在至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的孔中的不同的活化的捕获引物。在一些实施方案中，在多个孔的两个或更多个孔的每一个中形成固定的修饰的捕获引物的单克隆簇。在一些实施方案中，固定的修饰的捕获引物的单克隆簇在多个孔的至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的孔中形成。在一些实施方案中，在多个孔的两个或更多个孔的每一个中形成的固定的修饰的捕获引物的单克隆簇是在至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的孔中的不同的固定的修饰的捕获引物的单克隆簇。
本文描述的方法可以与多种核酸测序技术联合使用。特别可应用的技术是那些技术：其中核酸被附接在阵列中固定的位置以使得其的相对位置不改变，并且其中阵列被重复成像。其中在不同的颜色通道获得图像的实施方案，例如，符合不同的标记物用于区分一个核苷酸碱基类型与另一个，是特别可应用的。在一些实施方案中，确定靶核酸的核苷酸序列的过程可以是自动化的过程。优选的实施方案包括边合成边测序(“sbs”)技术。
sbs技术可以包括通过针对模板链迭代添加核苷酸，酶促延伸新生核酸链。在本领域已知的sbs方法中，每一次递送时在聚合酶的存在下，可以向靶核苷酸提供单个核苷酸单体。然而，在本文描述的方法中，递送时在聚合酶的存在下，可以向靶核酸提供多于一种类型的核苷酸单体。
sbs可以利用具有终止子部分的核苷酸单体或缺少任何终止子部分的那些核苷酸单体。利用缺少终止子的核苷酸单体的方法包括，例如，焦磷酸测序和使用γ-磷酸标记的核苷酸测序，如在下文进一步详细列出的。在使用缺少终止子的核苷酸单体的方法中，每个循环中添加的核苷酸的数目可以是变化的，并且取决于模板序列和核苷酸递送模式。对于利用具有终止子部分的核苷酸单体的sbs技术，在使用的测序条件下，终止子可以是有效的不可逆的，如在利用双脱氧核苷酸的sanger测序的情况中，或终止子可以是可逆的，如在solexa(现为illumina,inc.)开发的测序方法的情况中。
sbs技术可以利用具有标记物部分的核苷酸单体或缺少标记物部分的那些核苷酸单体。因此，基于以下可以检测掺入事件：标记物的特征，诸如标记物的荧光；核苷酸单体的特征诸如分子质量或电荷；核苷酸掺入的副产物，诸如释放的焦磷酸或类似的。在测序试剂中存在两种或更多种不同的核苷酸的实施方案中，不同的核苷酸可以是彼此可区分的，或可选地，在使用的检测技术下，两种或更多种不同的标记物可以是不可区分的。例如，测序试剂中存在的不同的核苷酸可以具有不同的标记物，并且使用合适的光学器件，其可被区分，如通过solexa(现为illumina,inc.)开发的测序方法示例的。
优选的实施方案包括焦磷酸测序技术。焦磷酸测序检测当特定的核苷酸被掺入新生链时释放的无机焦磷酸盐(ppi)(ronaghi,m.,karamohamed,s.,pettersson,b.,uhlen,m.和nyren,p.(1996)"real-timednasequencingusingdetectionofpyrophosphaterelease."analyticalbiochemistry242(1),84-9；ronaghi,m.(2001)"pyrosequencingshedslightondnasequencing."genomeres.11(1),3-11；ronaghi,m.,uhlen,m.和nyren,p.(1998)"asequencingmethodbasedonreal-timepyrophosphate."science281(5375),363；美国专利号6,210,891；美国专利号6,258,568和美国专利号6,274,320，其公开内容通过引用以其整体并入本文)。在焦磷酸测序中，释放的ppi可以通过立即由atp硫酸化酶转化为腺苷三磷酸(atp)来检测，并且产生的atp的水平经由荧光素酶产生的质子来检测。待测序的核酸可以附接至阵列中的特征上，并且阵列可以被成像以捕获由于在阵列的特征处掺入核苷酸产生的化学发光信号。在用特定的核苷酸类型(例如a、t、c或g)处理阵列之后，可以获得图像。就阵列中检测哪种特征而言，添加每一种核苷酸类型之后获得的图像将不同。图像中的这些差异反映阵列上的特征的不同序列含量。然而，每一个特征的相对位置在图像中将保持不变。使用本文列出的方法，图像可以被储存、处理和分析。例如，对于基于可逆的终止子的测序方法，对于从不同的检测通道获得的图像，用每一种不同的核苷酸类型处理阵列之后获得的图像可以被以与本文示例的相同的方式处理。
在sbs的另一个示例类型中，通过逐步添加包含以下的可逆的终止子核苷酸完成循环测序：例如，如被描述于例如wo04/018497和美国专利号7,057,026中的可裂解的或可光漂白的染料标记物，通过引用将其公开内容并入本文。该方法正被solexa(现为illumina,inc.)商业化，并且还被描述于wo91/06678和wo07/123,744，其的每一个通过引用被并入本文。终止可被逆转和荧光标记物可被裂解的荧光标记的终止子的可用性，促进有效的循环可逆的终止(crt)测序。聚合酶还可以被共工程化以有效地掺入这些修饰的核苷酸，并从这些修饰的核苷酸延伸。
优选地，在基于可逆的终止子的测序实施方案中，在sbs反应条件下，标记物基本不抑制延伸。然而，检测标记物可例如通过裂解或降解被去除。在标记物掺入到排列的核酸特征之后，可以捕获图像。在特定的实施方案中，每一个循环包括同时递送四种不同的核苷酸类型至阵列，并且每一种核苷酸类型具有光谱不同的标记物。然后，可以获得四种图像，每一种使用对于四种不同标记物中的一种选择的检测通道。可选地，可以顺序添加不同的核苷酸类型，并且在每一个添加步骤之间可以获得阵列的图像。在此类实施方案中，每一个图像将示出已掺入特定类型的核苷酸的核酸特征。由于每一个特征的不同序列含量，不同的图像中将存在或不存在不同的特征。然而，特征的相对位置在图像中将保持不变。从此类可逆的终止子-sbs方法获得的图像可如本文列出的被储存、处理和分析。图像捕获步骤之后，标记物可被去除，并且可逆的终止子部分可以被去除用于随后的核苷酸添加和检测循环。在其在特定循环中已被检测之后且在随后的循环之前去除标记物，可以提供降低背景信号和循环间的串扰的优势。有用的标记物和去除方法的实例在下面列出。
在特定的实施方案中，一些或所有的核苷酸单体可以包括可逆的终止子。在此类实施方案中，可逆的终止子/可裂解的荧光剂可以包括经由3’酯连接体连接至核糖部分的荧光剂(metzker,genomeres.15:1767-1776(2005)，其通过引用并入本文)。其他方法已经将终止子化学反应与荧光标记物的裂解分开(ruparel等,procnatlacadsciusa102:5932-7(2005)，其通过引用以其整体并入本文)。ruparel等描述了可逆终止子的开发，其使用小的3’烯丙基基团以封闭延伸，但通过用钯催化剂短期处理可以容易地去封闭。荧光团经由可光裂解的连接体附接至碱基，所述可光裂解的连接体通过暴露于长波长uv光30秒可以容易地裂解。因此，二硫键还原或光裂解可以用作可裂解的连接体。可逆的终止的另一种方法是使用天然的终止，其在dntp上放置大量的染料之后随之发生。dntp上带电荷的大量染料的存在可以通过立体和/或静电障碍充当有效的终止子。一个掺入事件的存在阻止进一步掺入，除非染料被去除。裂解染料去除荧光剂，并且有效地逆转终止。修饰的核苷酸的实例也描述于美国专利号7,427,673和美国专利号7,057,026，其的公开内容通过引用以其整体并入本文。
可与本文描述的方法和系统一起使用的另外的示例性sbs系统和方法描述于美国专利申请公布号2007/0166705、美国专利申请公布号2006/0188901、美国专利号7,057,026、美国专利申请公布号2006/0240439、美国专利申请公布号2006/0281109、pct公布号wo05/065814、美国专利申请公布号2005/0100900、pct公布号wo06/064199、pct公布号wo07/010,251、美国专利申请公布号2012/0270305和美国专利申请公布号2013/0260372，其的公开内容通过引用整体并入本文。
一些实施方案使用少于四种不同的标记物，可以利用四种不同核苷酸的检测。例如，利用在美国专利申请公布号2013/0079232的并入的材料中描述的方法和系统可以进行sbs。作为第一种实例，一对核苷酸类型可以在同一波长检测，但基于该对中的一个成员相比于另一个的强度中的差异区分，或基于对该对的一个成员的改变(例如，经由化学修饰、光化学修饰或物理修饰)导致表观信号相比于该对的另一个成员检测的信号出现或消失来区分。作为第二种实例，四种不同的核苷酸类型中的三种可以在特定的条件下被检测到，而第四种核苷酸类型缺少在那些条件下可检测的标记物，或在那些条件下被最小检测到(例如，由于背景荧光的最小检测等)。基于其的各自的信号的存在可以确定前三种核苷酸类型掺入核酸，且第四种核苷酸类型掺入核酸可以基于不存在任何信号或任何信号的最小检测确定。作为第三种实例，一种核苷酸类型可以包含在两个不同通道中被检测到的一种或更多种标记物，而其他核苷酸类型在不超过一个通道中被检测到。前面提到的三种示例性构型不被认为是互相排斥的，并且可以在多种组合中使用。合并全部三种实例的示例性实施方案是基于荧光的sbs方法，其使用在第一通道中被检测到的第一核苷酸类型(例如具有当被第一激发波长激发时，在第一通道中被检测到的标记物的datp)，在第二通道中被检测到的第二核苷酸类型(例如具有当被第二激发波长激发时，在第二通道中被检测到的标记物的dctp)，在第一和第二通道两者中被检测到的第三核苷酸类型(例如具有当被第一和/或第二激发波长激发时，在两个通道中被检测到的至少一种标记物的dttp)和缺少标记物的第四核苷酸类型，其在任一通道不被检测到或被最小检测到(例如不具有标记物的dgtp)。
此外，如在美国专利申请公布号2013/0079232的并入材料中描述的，可以使用单一通道获得测序数据。在此类所谓的一染料测序方法中，第一核苷酸类型被标记，但在产生第一图像之后，标记物被去除，并且仅在产生第一图像之后，第二核苷酸类型被标记。第三核苷酸类型在第一和第二图像两者中保持其的标记物，且第四核苷酸类型在两个图像中保持未被标记。
一些实施方案可以利用边连接边测序(sequencingbyligation)的技术。此类技术利用dna连接酶来掺入寡核苷酸，并且鉴定掺入的此类寡核苷酸。寡核苷酸可以具有不同的标记物，所述标记物与序列中与寡核苷酸杂交的特定核苷酸的身份关联。如同其他sbs方法，在用标记的测序试剂处理核酸特征的阵列之后，可以获得图像。每一个图像将示出已掺入特定类型的标记物的核酸特征。由于每一个特征的不同序列含量，不同的图像中将存在或不存在不同的特征，但特征的相对位置在图像中将保持不变。从基于连接的测序方法获得的图像可被储存、处理和分析，如本文列出的。可以与本文描述的方法和系统一起使用的示例性sbs系统和方法在美国专利号6,969,488、美国专利号6,172,218和美国专利号6,306,597，其的公开内容通过引用以其整体并入本文。
一些实施方案可以利用纳米孔测序(deamer,d.w.&akeson,m."nanoporesandnucleicacids:prospectsforultrarapidsequencing."trendsbiotechnol.18,147-151(2000)；deamer,d.和d.branton,"characterizationofnucleicacidsbynanoporeanalysis".acc.chem.res.35:817-825(2002)；li,j.,m.gershow,d.stein,e.brandin,和j.a.golovchenko,"dnamoleculesandconfigurationsinasolid-statenanoporemicroscope"nat.mater.2:611-615(2003)，其的公开内容通过引用以其整体并入本文)。在此类实施方案中，靶核酸穿过纳米孔。纳米孔可以是合成的孔或生物膜蛋白，诸如α-溶血素。当靶核酸穿过纳米孔时，每一个碱基对可以通过测量孔的电导率波动来鉴定。(美国专利号7,001,792；soni,g.v.&meller,"a.progresstowardultrafastdnasequencingusingsolid-statenanopores."clin.chem.53,1996-2001(2007)；healy,k."nanopore-basedsingle-moleculednaanalysis."nanomed.2,459-481(2007)；cockroft,s.l.,chu,j.,amorin,m.&ghadiri,m.r."asingle-moleculenanoporedevicedetectsdnapolymeraseactivitywithsingle-nucleotideresolution."j.am.chem.soc.130,818-820(2008)，其的公开内容通过引用以其整体并入本文)。从纳米孔测序方法获得的图像可如本文列出的被储存、处理和分析。特别是，根据本文列出的光学图像和其他图像的示例性处理，数据可作为图像被处理。
一些实施方案可以利用包括dna聚合酶活性的实时监测的方法。核苷酸掺入可以通过载有荧光团的聚合酶和γ-磷酸标记的核苷酸之间的荧光共振能量转移(fret)相互作用来检测，如例如美国专利号7,329,492和美国专利号7,211,414(其的每一个通过引用并入本文)中描述的，或核苷酸掺入可用零模波导检测，如例如美国专利7,315,019(其通过引用并入本文)中描述的，并使用荧光核苷酸类似物和工程化的聚合物，如例如美国专利7,405,281号和美国专利申请公布第2008/0108082号(其的每一个通过引用并入本文)中描述的。照明可以限制于在表面拴系的聚合酶附近的仄升规模体积，以使得荧光标记的核苷酸的掺入可以低背景观察(levene,m.j.等“zero-modewaveguidesforsingle-moleculeanalysisathighconcentrations."science299,682-686(2003)；lundquist，pm等"parallelconfocaldetectionofsinglemoleculesinrealtime."opt.lett.33,1026-1028(2008)；korlach,j.等"selectivealuminumpassivationfortargetedimmobilizationofsinglednapolymerasemoleculesinzero-modewaveguidenanostructures."proc.natl.acad.sci.usa105,1176-1181(2008)，其的公开内容通过引用以其整体并入本文)。从此类方法获得的图像可如本文列出的被储存、处理和分析。
一些sbs实施方案包括检测将核苷酸掺入到延伸产物后释放的质子。例如，基于检测释放的质子的测序可以使用电子检测器和从iontorrent(guilford,ct,alifetechnologiessubsidiary)商购可得的相关技术，或在us2009/0026082a1、us2009/0127589a1、us2010/0137143a1或us2010/0282617a1中描述的测序方法和系统，其的每一个通过引用并入本文。本文列出的用于使用动力学排除扩增靶核酸的方法可以容易地应用于被用来检测质子的基底。更具体地，本文列出的方法可被用来产生用于检测质子的扩增子的克隆群体。
以上的sbs方法可以有利地以多重格式进行，以使得同时操作多种不同的靶核酸。在特定的实施方案中，可以在普通的反应容器中或在特定基底的表面上处理不同的靶核酸。这允许以多重方式便捷递送测序试剂、去除未反应试剂和检测掺入事件。在使用表面结合的靶核酸的实施方案中，靶核酸可以是以阵列格式。在阵列格式中，靶核酸可以以空间可区分的方式结合至表面。靶核酸可以通过直接共价附接结合，附接至珠或其他颗粒或与附接至表面的聚合酶或其他分子结合。阵列可以包括在每一个位点(还被称为特征)的靶核酸的单拷贝或在每一个位点或特征可存在具有相同序列的多个拷贝。多个拷贝可通过扩增方法产生，诸如桥式扩增或乳液pcr，如下面进一步详述的。
本文列出的方法可以使用具有任何多种密度的特征的阵列，包括，例如，至少约10特征/cm2、100特征/cm2、500特征/cm2、1,000特征/cm2、5,000特征/cm2、10,000特征/cm2、50,000特征/cm2、100,000特征/cm2、1,000,000特征/cm2、5,000,000特征/cm2或更高。
本文列出的方法的优势是，其提供了多种靶核酸的快速且有效的平行检测。相应地本公开内容提供了能使用本领域已知的技术诸如以上示例的那些制备并检测核酸的整合系统。因此，本公开内容的整合系统可以包括能够将扩增试剂和/或测序试剂递送至一个或更多个固定的dna片段的流体组分；系统包括组分诸如泵、阀门、储液箱、射流线路等。流通池可以被构造和/或在用于检测靶核酸的整合系统中使用。示例性流通池描述于例如us2010/0111768a1和美国序号13/273,666，其每一个通过引用并入本文。作为流通池的示例，整合系统的一个或更多个流体组分可被用于扩增方法和用于检测方法。以核酸测序实施方案为例，整合系统中的一种或更多种流体组分可被用于本文描述的扩增方法并用于在诸如以上示例的那些的测序方法中递送测序试剂。可选地，整合系统可以包括分隔流体系统以进行扩增方法和进行检测方法。能产生扩增的核酸且还能确定核酸的序列的整合测序系统的实例包括但不限于miseqtm平台(illumina,inc.,sandiego,ca)和在美国序号13/273,666中描述的装置，其通过引用被并入本文。
本公开内容还涉及用于修饰固定的捕获引物的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包括a)本文提供的模板核酸、以及b)具有两个或更多个孔的图案化流通池，其中两个或更多个孔具有一对通用捕获引物。在一些实施方案中，试剂盒还包括限制性酶。在一些实施方案中，限制性酶是sapi。在一些实施方案中，试剂盒还包括用于使用试剂盒的组分修饰固定的捕获引物的说明。在一些实施方案中，试剂盒还包括一种或更多种对照分析物混合物，例如用于测试试剂盒的两种或更多种对照分析物。
从前面的描述将明显的是，可以对本文描述的发明进行变化和修改，以使其适应多种用途和条件。此类实施方案也在以下权利要求书的范围内。
在本文的任何的变量的定义中一列元素的引述包括做为所列元素的任何单个元素或所列元素的组合(或子组合)的该变量的定义。本文的实施方案的引述包括作为任何单个实施方案的实施方案或与任何其他实施方案组合的实施方案或其部分。
在该说明书中提到的所有专利和出版物通过引用并入本文，至如同每个单独专利和出版物被特别地和单独地指明通过引用并入的相同程度。
以下实施例通过示例的方式而非限制性的方式来提供。
实施例
实施例1：双层引物接枝
本实施例描述了包括将第一和第二层沉积到图案化流通池上并将第一引物沉积到第一层中并将第二引物沉积到第二流通池中的实验。
基本上如美国专利公布号us2014/0079923a1和us2013/0096034a1中所述，将第一层(pazam)涂覆到具有700nm间隔的400nm孔的图案化流通池。在抛光之后，在第一层中沉积第一捕获引物，第一引物包含
将第二层(sfa)涂覆到纳米孔中的第一层和围绕孔的流通池的表面上。tet寡杂交显示矩形图案，表明，第一层中的第一捕获引物在沉积第二层之后仍然存在并起作用。还参见图5(中图)。
在第二层中沉积了以
该实验表明，图案化流通池可以涂覆有包含不同的捕获引物的至少两层。将第一捕获引物沉积在图案化流通池的孔内的第一层中。在第二层中、在围绕孔的表面上沉积第二捕获引物。第一和第二引物与特异性寡核苷酸探针杂交。
实施例2：靶向核酸扩增的随机活化
本实施例描述了包括在kea中使用包含触发序列和靶核酸特异性序列的嵌合引物与缺乏触发序列的靶核酸组合随机活化靶核酸的实验。在本实施例中，使用illumina通用捕获引物序列p5作为触发序列，并且使用illuminasbs3序列作为靶核酸特异性序列(p5/sbs3)。
实验设计在表1中示出。示例性结果示于图21。
随机p5/p7表面流通池在泳道1至5中用以sbs3结束但缺少p5序列的模板核酸接种。在泳道6至8中未接种模板核酸。在p5/sbs3嵌合引物的存在或不存在下进行kea。在kea中包含p5/sbs3嵌合引物的泳道(泳道2-4)上观察到簇形成，但在不包含p5/sbs3嵌合引物的kea的泳道(泳道1)中，或不包含模板核酸的泳道(泳道6-8)中未观察到簇形成。在泳道5中，由于p5/sbs3引物的浓度低，未观察到簇。
该实验证明，可以使用本文提供的包括模板核酸随机活化的方法产生单克隆簇。
虽然已经参考所公开的实施方案描述了本公开内容，但本领域技术人员将容易地理解，以上详述的具体实施例和研究仅仅是对本公开内容的说明。应当理解，可以进行各种修改而不偏离本公开内容的精神。因此，本公开内容仅由随后的权利要求限制。
序列表
<110>伊鲁米那股份有限公司等
<120>用于核酸测序的方法和组合物
<130>103949pc
<140>待分配
<141>在于此的同一天
<150>us62/078,346
<151>2014-11-11
<150>us62/096,464
<151>2014-12-23
<160>10
<170>patentinversion3.5
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