细胞捕获系统和方法与流程
相关申请的交叉引用
本专利申请根据35u.s.c.§119(e)要求于2014年12月22日提交的，名称为“capturesystemofcellsandmethods”的美国序列号62/095,179，以及于2015年12月21日提交的us14/976,071的权益，所述申请的内容以引用的方式全文并入本文。
本公开内容至少涉及细胞生物学、分子生物学、材料科学、细胞治疗和医学领域。本公开内容的某些实施例涉及用于捕获所需细胞，并且任选地处理它们，包括用于体内递送的系统。
背景技术：
人类的免疫系统可分为两部分，迅速回应侵入物的主要部分的先天免疫系统，以及能够设计针对病原体侵入的非常特异性回应的适应性免疫系统。树突状细胞联系这两个系统，并且是启动针对侵入病原体的强烈应答的关键要素。单核细胞是能够分化成各种细胞的多能细胞，所述各种细胞包括巨噬细胞和树突状细胞。一般而言，单核细胞以1000个细胞/μl的浓度存在于全血中。它们代表成人血液中存在的白血细胞的大约5％。
树突状细胞活化淋巴结中的t细胞。一旦被树突状细胞活化，t细胞就最有效地防御病原体，刺激免疫系统的其他部分，并且能够大规模地特异性地杀死被感染的细胞。因此，适应性免疫系统的关键部分是t细胞被树突状细胞的活化。树突状细胞桥接先天免疫系统和适应性免疫系统，吞噬侵入物以将其抗原呈递给t细胞，并且活化它们以杀死被感染的细胞。
因为单核细胞可分化成对先天免疫系统和适应性免疫系统有用的细胞，所以它们是影响个体免疫系统的强大工具。考虑到其在血液中相对较低的浓度，其以高得率的无害分离及其纯度仍然是一个挑战。因此，仍然存在提供分离单核细胞的更有效方法的持续需要，而无需求助于传统的、效率较低的程序。像这样，需要用于分离这些细胞和其他细胞的改进的生物系统。
技术实现要素：
本公开内容的实施例包括用于从样品中分离一种或多种所需生物试剂(例如细胞)的系统、方法和组合物。在特定实施例中，本公开内容提供了包括用于从样品中捕获某些所需生物试剂的改性表面的系统。本公开内容的实施例包括封闭的无反应性系统，其用于从样品中分离所需细胞，并且任选地还进一步处理细胞，包括至少培养用于细胞治疗的细胞(例如免疫细胞)。本公开内容的某些实施例包括用于细胞分离以及任选地其后的生长和/或处理的离体系统。本公开内容的系统允许在一步法或单系统方法中分离细胞，而不损害细胞，使得它们随后可被利用，至少包括用于体内应用。
在本公开内容的某些方面，系统包括至少一个容器，例如管或袋，其包括被配置用于从样品中收集至少一种特定类型的生物试剂的表面。在特定方面，考虑到细胞具有各种表面标记物，可通过相同的部分捕获超过一种细胞类型。在某些方面，超过一种细胞类型可在相同系统中被非相同部分的混合物捕获。在具体实施例中，系统包括具有膜片的容器，例如其中片被激光焊接在例如蛇形袋中。在一些实施例中，容器包括除管或袋外或者加上管或袋的珠、微结构或器械。可使用本公开内容的实施例分离任何细胞，但在特定实施例中，细胞例如是血细胞或免疫细胞。用于捕获的示例性免疫细胞包括至少单核细胞，尽管可使用本公开内容的系统和方法获得其他免疫细胞。
一个实施例包括容器(例如柔性管)，其包括包含具有官能化表面的聚合物的内壁。在具体实施例中，容器具有细胞特异性适体(结合特定靶分子的寡核酸或肽分子)的连续覆盖。在具体实施例中，适体可由核酸或氨基酸组成。在一些情况下，容器的内壁由小于约0.1mg/cm2、0.09mg/cm2、0.08mg/cm2、0.07mg/cm2、0.06mg/cm2、0.05mg/cm2、0.04mg/cm2、0.03mg/cm2、0.02mg/cm2、0.01mg/cm2、0.009mg/cm2、0.008mg/cm2、0.007mg/cm2、0.006mg/cm2、0.005mg/cm2、0.004mg/cm2、0.003mg/cm2、0.002mg/cm2、0.001mg/cm2或者是不可检测的在水中的总有机碳(toc)的聚合物组成。在特定实施例中，在水中的toc小于在0.001mg/cm2至0.1mg/cm2、0.001mg/cm2至0.095mg/cm2、0.001mg/cm2至0.075mg/cm2、0.001mg/cm2至0.05mg/cm2、0.001mg/cm2至0.01mg/cm2、0.001mg/cm2至0.005mg/cm2、或0.001mg/cm2至0.025mg/cm2范围内的量。在特定实施例中，在水中的toc小于在0.01mg/cm2至0.1mg/cm2、0.01mg/cm2至0.075mg/cm2、0.01mg/cm2至0.05mg/cm2、或0.01mg/cm2至0.025mg/cm2范围内的量。在特定实施例中，在水中的toc小于在0.05mg/cm2至0.1mg/cm2、0.05mg/cm2至0.09mg/cm2、0.05mg/cm2至0.075mg/cm2、或0.05mg/cm2至0.06mg/cm2范围内的量。在特定实施例中，在水中的toc小于在0.005mg/cm2至0.1mg/cm2、0.005mg/cm2至0.095mg/cm2、0.005mg/cm2至0.075mg/cm2、0.005mg/cm2至0.05mg/cm2、0.005mg/cm2至0.025mg/cm2、或0.005mg/cm2至0.01mg/cm2范围内的量。
在具体实施例中，氟化乙烯丙烯(fep)的toc为0.00005mg/cm2的制品的内部润湿表面(0.001mg/g的制品)；硅酮材料例如硅酮管的toc为0.021mg/cm2(0.023mg/cm的管)和0.008mg/cm2(0.009mg/cm)的制品的内部润湿表面；用于历史上使用的细胞培养袋的toc为0.002mg/cm2的制品的内部润湿表面(0.032mg/g的制品)。
在包含聚合物的内壁的具体实施例中，聚合物是含氟聚合物(具有多个强碳-氟键的氟碳基聚合物)，例如氟化乙烯丙烯(fep)。内壁的官能化可通过适合于在系统中使用的系统和/或试剂的预期应用的任何方法。在具体实施例中，内壁的官能化包括例如用羧基、羟基、醛基、羰基、胺基、亚胺基、酰胺基、酯基、酸酐基、硫醇基、二硫化物、苯酚、胍、硫醚、吲哚、咪唑或重氮表面基团使壁官能化，使得存在特定的起始表面。在具体实施例中，官能化是用羧酸，随后为经由肽键将羧酸酯与抗生物素蛋白蛋白质连接。在具体实施例中，固定的抗生物素蛋白蛋白质充当关于生物素化引物或生物素化适体的结合位点。在至少一些情况下，官能团可具有与之直接或间接连接的作为引物的dna序列，以使用rca(滚环扩增)构建适体。因此，在具体方面，本公开内容包括使用适体“触角”来捕获和释放样品中的特定细胞而不伤害它们。本公开内容包括在一步法或单系统方法中从样品中分离特定细胞，而不有害地影响细胞的功能。在具体实施例中，本公开内容的系统是单次使用的。
实施例包括对所需细胞如单核细胞具有高特异性和亲和力的适体(例如通过用于核酸适体的细胞selex方法设计的适体)。使用封闭系统(包括至少一个容器，例如袋或管，且至少部分包含含氟聚合物)，其内表面例如用长dna序列官能化。这些触角可通过任何合适的方法生成，尽管在具体实施例中，触角由核酸组成，并且由针对适体的第一模板的rca生成。在一些情况下，触角由合成产生或由相应的表达构建体表达的氨基酸适体组成。然后，每个触角具有对所需细胞高度特异性的至少几个位点。在某些实施例中，适体的长度为长度至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个或更多个碱基对等等。在具体实施例中，适体的长度不超过长度5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个或更多个碱基对。样品在系统的表面(通过可以是袋、管、珠、板或微结构的至少一个容器)上处理，并且其后仅所需细胞保持附着至触角。然后，方法用于实现与其他不需要的细胞分离的来自系统的所需细胞释放。限制性酶消化、加热和/或互补dna可用于释放细胞。
在用于分离生物物质的系统(包括所需细胞)的实施例中，存在包括含氟聚合物层的器械。在某些实施例中，该器械可被配置为包括袋或管的容器。在至少一些情况下，袋被进一步限定为管，并且管可由柔韧材料构成，使得它能够被配置为易于使用或贮存的形状(例如蛇形配置)。含氟聚合物层可包括至少主表面和包含官能团的反应性部分。反应性部分(rm)可附着至例如共价附着至含氟聚合物的主表面。在至少某些方面，反应性部分可为在表面上几何契合的化学基团的量。反应性部分可具有每平方微米至少50个反应性部分的表面浓度，即50rm/μm2的主表面。在某些实施例中，反应性部分可具有至少55rm/μm2、60rm/μm2、65rm/μm2、70rm/μm2、75rm/μm2、80rm/μm2、85rm/μm2、90rm/μm2、95rm/μm2、100rm/μm2、200rm/μm2、500rm/μm2、750rm/μm2或1000rm/μm2的表面浓度。
在一个实施例中，用于分离生物物质的系统包括入口和在第一端连接至入口的容器(例如管)。管可包括含氟聚合物层。在某些方面，含氟聚合物层可包含主表面和包含官能团的反应性部分。反应性部分可共价附着至含氟聚合物的主表面。反应性部分可具有至少50个反应性部分/平方微米(50rm/μm2)的表面浓度。在一些实施例中，系统还包括连接至管的第二端的出口。
在该系统的特定实施例中，分离生物物质的方法包括提供生物样品。该方法还可包括通过管应用生物样品。在具体实施例中，管可包括含氟聚合物层。在特定情况下，含氟聚合物层包括主表面和反应性部分。反应性部分可附着至例如共价附着至含氟聚合物的表面。共价附着的反应性部分具有表面浓度sc。在特定实施例中，该方法包括将来自生物样品的单一所需生物试剂固定到表面上。该方法还可包括从管中去除生物样品，减少所需的生物试剂。在一个实施例中，至少90摩尔％的单一生物试剂基于表面浓度sc和长度l固定在表面上，尽管在一些情况下，至少80摩尔％、81摩尔％、82摩尔％、83摩尔％、84摩尔％、85摩尔％、86摩尔％、87摩尔％、88摩尔％、89摩尔％、90摩尔％、91摩尔％、92摩尔％、93摩尔％、94摩尔％、95摩尔％、96摩尔％、97摩尔％、98摩尔％或99摩尔％的单一生物试剂基于表面浓度sc和长度l固定在表面上。在一些实施例中，该方法还包括从个体获得生物样品。获得可通过任何方式发生，例如从个体中抽取血液、从个体中收集骨髓、抽脂、手术取样(使用导管、内窥镜检查等等)、其他取样固体和液体组织的方法等等。
在某些实施例中，系统包含包括入口的袋。在具体实施例中，袋包括出口。在一些情况下，袋还可包括捕获元件。捕获元件包括表面和捕获部分。在具体方面，捕获部分可包括生物素化合物。捕获部分可包括抗生物素蛋白蛋白质。捕获部分可包括生物素化合物或抗生物素蛋白蛋白质，但并非两者。在该系统的一个方面，袋包括可共价附着至袋的表面的捕获部分。在具体实施例中，捕获部分可具有固定任何种类的细胞(具体例子至少包括白血细胞)的特异性。在特定实施例中，抗生物素蛋白是直接或间接连接物以附着dna并且不捕获细胞本身。
在一个实施例中，系统包括袋，其包含至少10,000,000个关于细胞的捕获位点/100ml体积，尽管该袋可包含至少15,000,000、20,000,000、25,000,000、30,000,000、50,000,000、75,000,000等等数目的关于细胞的捕获位点/100ml体积；在具体情况下，例如，细胞是造血干细胞。每个捕获位点都可包含捕获元件。捕获元件可包括表面和捕获部分。捕获部分可附着至例如共价附着至表面。
在一些实施例中，存在从样品中分离细胞的方法，所述方法包括提供样品。在某些情况下，存在分离血细胞或免疫细胞(包括至少白血细胞)的方法，所述方法包括提供来自个体的样品。在具体实施例中，该方法包括提供来自个体的血液或骨髓样品。该方法可包括从个体中提取血液或骨髓样品。该方法可包括将样品(例如血液样品)转移到本公开内容的器械包括例如上述容器内。
在某些实施例中，从生物样品中分离某些细胞的方法包括提供来自哺乳动物例如人、犬、猫、马、猪、绵羊、黑猩猩、狒狒、大猩猩或山羊的样品。在一些情况下，从生物样品中分离单核细胞的方法包括提供来自哺乳动物的血液样品。该方法可包括将样品(例如血液)转移到上述容器之一内。
本公开内容的实施例还包括诱导单核细胞在血管结构的表面上附着的人造血管，然后使用各种细胞因子诱导单核细胞与表面的附着，允许从全血中分离单核细胞并且其后将它们从容器的表面取出。容器的环境可包含用于刺激单核细胞粘附的一种或多种趋化因子，并且一旦粘附，单核细胞就可基于其自身的肌动蛋白骨架发展更强的相互作用。因此，本公开内容的具体实施例允许高剪切应力的不存在。
在一个实施例中，存在包括容器的细胞分离系统，其中所述容器包括：内表面，其包含具有小于0.1mg/cm2的在水中的总有机碳(toc)的聚合物，以及附着至聚合物的多个官能团。在具体实施例中，氟化乙烯丙烯(fep)的toc为0.0005mg/cm2的制品的内部润湿表面(0.001mg/g的制品)；硅酮材料例如硅酮管的toc为0.021mg/cm2的制品的内部润湿表面(0.023mg/cm的管)和0.008mg/cm2的制品的内部润湿表面(0.009mg/cm的管)；用于历史上使用的细胞培养袋的toc为0.002mg/cm2的制品的内部润湿表面(0.032mg/g的制品)。在具体实施例中，官能团直接或间接附着至生物试剂-捕获部分。在一些实施例中，官能团通过接头附着至聚合物，并且接头可为线型亚烷基(亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基或亚己基)、支链亚烷基、环状亚烷基、芳烃二基(arenediyl)、低聚乙二醇基如四乙二醇、糖基或其组合。在具体实施例中，官能团具有与之直接附着的结合对的第一成员。在某些方面，生物试剂-捕获部分包含结合对的第二成员。在某些实施例中，官能团具有与之直接附着的结合对的第一成员，并且生物试剂-捕获部分包含结合对的第二成员，其中所述结合对的第一成员和第二成员彼此结合。在结合对的第一成员是抗生物素蛋白种类时的情况下，结合对的第二成员是例如生物素。当结合对的第一成员是生物素时，结合对的第二成员是例如抗生物素蛋白种类。抗生物素蛋白种类的例子包括抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白。在一些情况下，官能团是羧基、羟基、醛基、羰基、胺基、亚胺基、酰胺基、炔基、烯基、氮丙啶基、环氧基、异腈基、异氰化物基、四嗪基、烷基、氨基乙基酰胺基、酯基、硫醇基、酸酐基、二硫化物基、苯酚基、胍基、硫醚基、吲哚基、咪唑基、重氮基或其组合。在一些实施例中，生物试剂-捕获部分直接结合生物试剂，并且生物试剂-捕获部分可包含氨基酸序列，例如包括包含一个或多个适体的氨基酸序列。在特定实施例中，生物试剂-捕获部分间接结合生物试剂或产生直接结合生物试剂的分子。在特定实施例中，生物试剂-捕获部分或由生物试剂-捕获部分产生的分子是核酸。在具体实施例中，生物试剂-捕获部分包含核酸模板，并且它可为环状dna模板。核酸模板可包含与直接结合生物试剂的序列互补的序列。在特定实施例中，由生物试剂-捕获部分产生的分子包含一个或多个适体。在特定方面，聚合物是含氟聚合物例如聚四氟乙烯(ptfe)、全氟烷氧基(pfa)、乙烯四氟乙烯(etfe)、聚偏二氟乙烯(pvdf)、聚三氟氯乙烯(pctfe)、乙烯三氟氯乙烯(ectfe)、氟化乙烯丙烯(fep)、乙烯氟化乙烯丙烯(efep)、全氟聚醚(pfpe)、改性聚四氟乙烯(tfm)、聚氟乙烯或其组合。
在本公开内容的特定实施例中，系统是封闭系统。
在用于细胞分离的容器的实施例中，容器还包含酶，例如聚合酶，包括至少phi29聚合酶。容器可包括袋、管、珠、烧瓶、滚瓶和/或刚性容器。容器可包括两个或更多个孔。在某些实施例中，该系统包括直列式附着至所述容器的一个或多个另外的容器。在具体实施例中，包含一种或多种细胞生长剂的第二容器。在某些情况下，存在包含一种或多种抗原如肿瘤抗原的第三容器。在一些情况下，存在配置为浓缩生物试剂如细胞的第四容器，所述细胞可为来自样品的细胞。细胞的例子包括单核细胞、血细胞、免疫细胞或其混合物。
在该系统的某些实施例中，存在包括一个或多个膜的第二容器(参见美国临时专利申请序列号62/095,197和美国临时专利申请序列号62/095,116中的至少某些实施例，这两个专利申请以引用的方式全文并入本文)。膜可为多孔的。在一些情况下，存在包括两个或更多个孔的第二容器。在特定实施例中，第二容器包括两个入口和两个出口。在特定实施例中，存在包括一个或多个膜并且包括两个、三个或四个孔的第二容器。在具体实施例中，第一膜被配置为将第一入口与容器中的室选择性地流体分离，并且第二膜被配置为将第一出口与腔选择性地流体分离。在特定实施例中，第二入口定位在室处，第二出口定位在室处，或两者。在具体实施例中，第二容器包括内表面，所述内表面包含具有小于0.1mg/cm2的在水中的总有机碳(toc)的聚合物。在具体实施例中，氟化乙烯丙烯(fep)的toc为0.0005mg/cm2的制品的内部润湿表面(0.001mg/g的制品)；硅酮材料例如硅酮管的toc为0.021mg/cm2的制品的内部润湿表面(0.023mg/cm的管)和0.008mg/cm2的制品的内部润湿表面(0.009mg/cm的管)；用于历史上使用的细胞培养袋的toc为0.002mg/cm2的制品的内部润湿表面(0.032mg/g的制品)。
在一个实施例中，存在制备如本文考虑的系统的方法，所述方法包括以下步骤：提供包括内表面的容器，所述内表面包含具有小于0.1mg/cm2的在水中的toc的聚合物；并且将官能团附着至内表面。在具体实施例中，附着步骤是通过氧化、格氏试剂或电晕处理。在一些实施例中，该方法还包括将结合对的第一成员附着至官能团的步骤。在具体实施例中，将结合对的第一成员附着至官能团的步骤包括官能团的活化。活化可包括使官能团暴露于乙酸钠与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)的混合物。在具体实施例中，方法还包括将结合对的第二成员附着至生物试剂-捕获部分的步骤，所述生物试剂-捕获部分例如通过结合对的第二成员直接或间接附着至官能团的生物试剂-捕获部分。生物试剂-捕获部分可包含氨基酸序列。生物试剂-捕获部分可为环状dna模板和引物，并且该方法还包括向容器提供聚合酶(例如在合适的条件下延伸dna模板的聚合酶)和核苷酸的步骤。聚合酶可为phi29聚合酶。
在某些实施例中，存在用于从来自至少一个个体的样品中分离特定细胞的方法，所述方法包括以下步骤：提供如本文考虑的系统；并且在使混合物中的特定细胞能够选择性地结合生物试剂-捕获部分或选择性地结合由生物试剂-捕获部分产生的分子(例如核酸)的条件下，使包含细胞的混合物的样品经受系统。样品可能是血液或骨髓。在某些实施例中，经受步骤还包括向系统提供酶，例如聚合酶。本公开内容的方法还可包括从个体获得样品的步骤。个体可能需要细胞治疗，例如用于癌症的细胞治疗。在特定实施例中，在从样品中分离特定细胞后，从系统中收集细胞。可通过从生物试剂-捕获部分或由生物试剂-捕获部分生成的分子释放细胞来收集细胞。在具体实施例中，释放是通过在合适的条件下的加热。在特定实施例中，当生物试剂-捕获部分或由生物试剂-捕获部分生成的分子是核酸时，通过暴露于一种或多种内切核酸酶和/或暴露于与相应的部分或分子互补的核酸而释放细胞。在具体实施例中，在从样品中分离特定细胞后，进一步处理细胞，并且可在系统中的一个或多个另外的容器中进一步处理细胞。可通过培养细胞、使细胞暴露于一种或多种抗原、使细胞分化、扩增细胞、浓缩细胞、纯化细胞或其组合而进一步处理细胞。在具体实施例中，将治疗有效量的所收集的细胞提供给需要细胞治疗的个体。
在一些实施例中，存在包括如本文考虑的系统的试剂盒，所述系统容纳在合适的容器中。在具体实施例中，系统还包括用于样品收集或样品贮存或两者的器械。该器械可为小瓶、注射器、杯、导管、袋、管或其组合。试剂盒还可包含聚合酶，例如phi29聚合酶。试剂盒还可包含内切核酸酶、缓冲液和/或一种或多种细胞因子、趋化因子或生长因子。
附图说明
为了更全面地了解本公开内容，现在参考与附图结合进行的下述描述，其中：
图1a-1b示出了用于分离和培养用于细胞治疗的细胞的封闭系统的示例性实施例；
图2证实了将包含适体的袋暴露于血液用于捕获特定免疫细胞的实施例；
图3证实了作为例子来自
图4显示了附着至fep基材用于分离目的细胞的珠；
图5显示了经处理的氧化的膜、经处理的未氧化的膜和未经处理的氧化的膜的ftir光谱；
图6示出了使用加入血液样品中并且引入包含具有中性抗生物素蛋白的fep涂层的管中的生物素化适体分离所需细胞的例子；
图7包括根据实施例用于分离生物物质的系统的图示；
图8包括根据利用核酸适体的实施例，关于改性表面的方法的流程图的例子；
图9包括用于从生物样品中分离生物试剂的方法图示的例子；
图10示出了在抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白(nav)吸附后，进入未经处理的膜的4000-1400cm-1范围内的ftir光谱。对照样品与悬浮液和冲洗缓冲液(naoac和去离子h2o)接触。在1630cm-1处观察到酰胺存在。对于蛋白质样品在3400cm-1处的较高峰也显示至表面的蛋白质的存在；
图11显示了在抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白(nav)吸附后，进入经c处理的膜的4000-1400cm-1范围内的ftir光谱。对照样品与悬浮液和冲洗缓冲液(naoac和去离子h2o)接触。在1630cm-1处观察到酰胺存在。对于蛋白质样品在3400cm-1处的较高峰也显示至表面的蛋白质的存在；
图12证实了在未经处理的(第1列)、经c处理的(第2列)和氧化的经c处理的fep膜(第4列)上，与羧基结合的亚甲基蓝分子在600nm处的吸光度。第3列显示了在其与亚甲基蓝反应之前氧化的经c处理的膜的吸光度(空白对照)；
图13显示了在未经处理的(第1列)、经c处理的(第2列)和氧化的经c处理的fep膜(第4列)上，与羧基结合的亚甲基蓝分子的总吸光度和在600nm处的吸光度。第3列显示了在其与亚甲基蓝反应之前氧化的经c处理的膜的吸光度(空白对照)；
图14显示了具有亚甲基蓝的fep膜染料进入uv-vis范围350-1050nm内的典型光谱。氧化的对照是在与亚甲基蓝反应之前的氧化的经c处理的膜；
图15a-15d提供了具有吸附的中性抗生物素蛋白的未经处理的fep的sem图像(a至d)。图像d显示了生物素涂布的珠与官能化的中性抗生物素蛋白表面(具有吸附的中性抗生物素蛋白的未经处理的fep)的附着；
图16显示了具有吸附的中性抗生物素蛋白的经c处理的fep(左)和具有缀合的中性抗生物素蛋白的氧化的经c处理的fep(右)的sem图像；
图17提供了在具有吸附的中性抗生物素蛋白的未经处理的fep上生物素涂布的微珠；
图18显示了用olympusdsx500显微镜获取，在具有吸附的中性抗生物素蛋白的未经处理的fep上的生物素微珠(d～0.8-1μm的黑色斑点)的光学图像。尺度：341-342μm，放大倍率：在20x透镜上3x；
图19提供了在不同类型的改性fep膜上的染色蛋白质在660nm处的吸光度，包括未经处理的对照。每组列的第一列代表仅暴露于缓冲溶液的对照样品，每组的第二列代表吸附的抗生物素蛋白，并且每组的第三列代表具有吸附的中性抗生物素蛋白的样品。在进行蛋白质染色反应后获得所有测量。
图20证实了在与蛋白质的染料反应之前和与蛋白质的染料反应之后，在经c处理的膜上进入uv-vis范围350-1050nm内的典型光谱。
图21显示了用吸附的中性抗生物素蛋白(nav)先前改性的1％sds洗涤的氧化的经c处理的膜的ftir光谱；
图22提供了在高功率(us-a)和低功率(us-b)下5分钟的超声处理步骤后，在具有吸附的中性抗生物素蛋白的未经处理的fep上的ftir光谱。未观察到变化。细实线代表超声处理前吸附蛋白质的光谱；
图23显示了在高功率(us-a)和低功率(us-b)下5分钟的超声处理步骤后，在具有吸附的中性抗生物素蛋白的经c处理的fep上的ftir光谱。未观察到变化。细实线代表超声处理前吸附蛋白质的光谱；
图24示出了在附着的中性抗生物素蛋白的fep膜上的酶联免疫吸附测定的例子；
图25显示了在聚丙烯酸官能化的fep膜(paa-fep)的4000-1400cm-1范围内的ftir光谱，已在mes缓冲液中被edc/nhs化学活化的paa-fep膜的光谱，活化的paa-fep膜表面与抗生物素蛋白蛋白质的进一步缀合反应的光谱，以及作为参考的吸附在表面上的抗生物素蛋白蛋白质的光谱；
图26提供了加上荧光团标签的与paa-fep表面化学附着的抗生物素蛋白的荧光图像，paa-fep表面与不被paa官能化的fep的对照段相邻；和
图27显示了在聚丙烯酸官能化的fep膜(paa-fep)的4000-1400cm-1范围内的ftir光谱，暴露于无dna的镁离子偶联缓冲液的paa-fep膜的光谱，暴露于edc/nhs试剂的paa-fep膜的光谱；在与胺封端的dna缀合反应后，edc/nhs活化的paa-fep膜的光谱；在dna溶液中浸泡的paa-fep膜的光谱。
具体实施方式
如本文说明书中使用的，“一个”或“一种”可意指一个或多个/一种或多种。如本文权利要求中使用的，当与单词“包括”结合使用时，单词“一个”或“一种”可意指一个/种或超过一个/种。如本文使用的，“另一”可表示至少第二或更多。再进一步地，术语“具有”、“包括”、“含有”和“包含”是可互换的，并且本领域技术人员认识到这些术语是开放式术语。本公开内容的一些实施例可由本文的一个或多个元素、方法步骤和/或方法组成，或者基本上由本文的一个或多个元素、方法步骤和/或方法组成。考虑本文描述的任何方法或组合物均可就本文描述的任何其他方法或组合物而言来实施。
本说明书的一个目的是提供以高特异性从生物样品中分离至少一种生物试剂的系统、方法和组合物。该说明书还包括用于制备这种系统的一种或多种方法。在一个实施例中，例如，生物试剂范围可从无机种类例如金属离子和阴离子到小的有机分子，例如维生素、激素或肽。在另一个实施例中，生物试剂可包括大分子种类，例如蛋白质、酶或核苷酸。在再一个实施例中，生物试剂甚至可包括更复杂的系统，例如细胞器，即细胞核、核糖体、线粒体、细胞囊泡、粗面内质网和滑面内质网、高尔基体、溶酶体、中心体、细胞碎片或细胞膜。在一个特定实施例中，生物试剂可包括整个细胞。在某些实施例中，生物试剂包括任何类型的血细胞、任何类型的干细胞或任何类型的免疫细胞。来自样品的细胞可为正常的或可为患病的。在另一个特定实施例中，生物试剂包含血细胞，例如白血细胞。在特定实施例中，生物试剂包含免疫细胞，例如单核细胞或t细胞。在具体实施例中，例如，生物试剂是病毒、细胞群或微生物。相应地，生物样品可包括来自动物(包括人)的任何器官或组织的样品。例如，血液可为分离单核细胞的生物样品。在另一个实施例中，骨髓可为分离造血干细胞(即单核细胞的前体)的生物样品。在特定实施例中，系统允许以特异性分离大分子化合物、细胞亚单位或细胞，同时维持种类的生物活性，即具有低降解速率。
本公开内容的实施例提供了允许从细胞的混合物(例如来自样品的细胞混合物)中分离所需细胞的系统。样品可来自个体，包括哺乳动物，例如人。在特定实施例中，系统包括被配置为分离所需细胞的容器。在一些实施例中，该系统是分成多部分的，具有除用于细胞分离的容器外的另外的容器。在一些情况下，这样的容器可被配置在用于细胞移动的序贯路径中；在这种实施例中，细胞经受不同的环境或操作用于进一步处理。在特定实施例中，细胞分离容器是用于细胞的序贯处理的路径中的第一容器。在其中系统中存在两个或更多个容器的情况下，容器可被直列式配置，使得被处理的样品或细胞从一个容器连续移动到另一个容器。在具体实施例中，多容器系统被线性地配置，并且这样的线性路径可为水平的或线性的，或者两者都不是。
在特定实施例中，样品在递送到系统之前不被处理，尽管在递送到系统之前，样品可已在足够的条件下贮存。在具体实施例中，样品在递送至系统之前不经受分离技术(包括离心)，在递送至系统之前不经受一种或多种生物试剂(包括例如抗凝血剂)的加入等等。在具体实施例中，样品不经受与将触发免疫细胞应答的表面接触。样品可已由与进行系统处理的一方不同的另一方从个人获得。
在一个实施例中，在其使用之前，该系统可为完整的并且准备用于分离生物试剂。在另一个实施例中，系统可在初级阶段提供给用户，并且用户例如实验室技术人员根据所需生物试剂的特异性修改系统。在一个实施例中，系统可与进一步处理分离。在另一个实施例中，本公开内容的系统可包括在一系列过程中，其中生物试剂的分离是包括本公开内容的系统的多部分系统的一部分。考虑到一些生物试剂的灵敏度，至少本公开内容的系统可为封闭系统，其中生物试剂的分离及其进一步处理在单一受控系统中进行。
在系统的某些实施例中，容器包含用于捕获所需物质例如所需细胞的一种或多种生物试剂-捕获部分。在本发明的特定方面，系统的生物试剂-捕获部分和方法包括适体和/或产生适体，所述适体可为与特定靶分子结合的寡核苷酸或肽或多肽(在这种情况下，要捕获的所需生物试剂)。适体序列可为用户或系统的制备者已知或未知的。在特定实施例中，特定的适体对于特定所需细胞的结合是特异性的。适体可由系统的用户生成或鉴定，或者适体可从另一个获得，包括商业获得。例如，可通过从大型随机合成生成的序列库中选择寡核苷酸适体来生成寡核苷酸适体，尽管适体可存在于自然界中。本公开内容的系统的用户或制备者可能不是鉴定对于特定生物试剂特异性的适体的序列的一方。对于核酸实施例，适体可包含dna或rna并且可包含寡核苷酸的多聚体，或者它们可包含肽或肽的多聚体。在具体实施例中，dna适体触角的长度范围为在触角内至少10、25、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个或更多个适体。在具体实施例中，肽适体触角的长度范围为在触角内至少为10、25、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个或更多个适体。在特定实施例中，适体触角的长度范围不超过触角内的10、25、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个或更多个适体。
在本公开内容的特定实施例中，容器是封闭系统的部分，所述封闭系统包括由含氟聚合物组成的至少一个袋或管，或在含氟聚合物中涂布的至少一个袋或管，使得其内表面用核酸(例如dna，包括dna的长序列)或肽或多肽官能化，并且核酸、肽或多肽可间接附着至内表面。在具体实施例中，含氟聚合物具有与之附着的dna长序列的触角，所述触角可通过与适体相适应的第一模板生成(例如通过rca或pcr)。因此，dna的每个触角具有对目的生物试剂高度特异性的至少两个或更多个位点。在某些实施例中，含氟聚合物具有与之附着的氨基酸长序列的触角，所述触角可以多种方式生成，包括化学合成或由核酸表达构建体表达。
在一个具体实施例中，从个体获得样品(例如血液)，并且提供至包含特定聚合物的容器，该聚合物被改性用于捕获样品中的所需生物试剂(例如所需细胞)。在具体实施例中，聚合物被改性为具有与之附着的能够结合细胞的核酸或肽或多肽适体触角。在所需细胞与触角结合后，具有结合的细胞的触角可从聚合物中释放出来用于收集。释放可通过任何合适的方式，但在具体实施例中，它通过使用加热，或者在核酸适体的情况下，例如通过核酸内切酶(例如限制性酶)和/或互补dna。当采用一种或多种限制性酶时，限制性酶的选择可针对dna触角的特定序列定制。所需细胞的收集可例如通过管进入袋内。
在本公开内容的特定实施例中，存在用于产生用于分离细胞的系统的多步法。本领域技术人员认识到，存在用于固定适体的各种化学方法，包括附着至金，共价附着至功能改性的表面，包括用于接头设计的有用参数，作为一个例子(balamurugan等人，2008)。然而，在具体实施例中，本文考虑了多步法。在一个实施例中，一个步骤是选择特定的起始fep表面用于随后固定蛋白质，例如抗生物素蛋白或其衍生物之一。在具体实施例中，生物捕获试剂直接与表面连接。可考虑表面能和表面化学的改性。另一个步骤可为将抗生物素蛋白或其衍生物之一附着至所选择的fep表面，并且在具体实施例中，这样的步骤可包括物理吸附或化学缀合。根据选择的哪种方法，fep表面的起始官能化可不同。另一个步骤涉及将具有细胞表面标记物(例如单核细胞表面标记物)的特异性dna序列的生物素化适体偶联到抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白。最后，从样品中分离所需细胞(如从全血中分离单核细胞)。在该步骤中，细胞将通过其特定细胞表面标记物结合适体，并且将在封闭系统中与其他细胞分离。
在特定实施例中，系统被封闭并且包括至少一个表面。表面可为整个系统连续的，也可不是整个系统连续的，例如在系统中的多个容器中是连续的。在具体实施例中，系统的不同容器中的表面基本相同，尽管在其他实施例中，系统的不同容器中的表面是不同的。系统的容器的内表面可具有在系统的至少部分中的一个或多个层，尽管在一些情况下，表面具有在整个系统中的一个或多个层。系统中的不同表面可具有不同的改性。
在一个实施例中，系统中的表面的第一层可视为基层，例如容器包括的内表面。这样的层可由具有低浸出性、低提取性、对生物试剂如细胞非反应性等等的材料组成。第一层可为系统的容器的结构的内表面，或者第一层可为系统的容器的结构的内表面上的涂层。
在一个实施例中，系统中的表面的第二层可包含附着至第一层的官能团。官能团可被化学配置用于将第一层与包含生物试剂-捕获部分的层或与生物试剂-捕获部分相关联的层连接。这些官能团可为任何种类的，这取决于系统的一个或多个层的性质。在某些情况下，官能团包含酸用于进一步改性。在具体实施例中，官能团为羧基、羟基、醛基、羰基、胺基、亚胺基、酰胺基、酯基、酸酐基、硫醇基、二硫化物基、苯酚基、胍基、硫醚基、吲哚基、咪唑基、氨基乙基酰胺基、炔基、烯基、氮丙啶基、环氧基、异腈基、异氰化物基、四嗪基、重氮表面基团、炔基、烯基、氮丙啶基、环氧基、异腈基、异氰化物基、四嗪基、烷基、氨基乙基酰胺基、酯基、重氮基或其组合。第二层还可包含附着至结合对的第一成员的官能团，所述结合对的第一成员例如抗生物素蛋白种类(包括抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白)或生物素分子。
在一个实施例中，系统中的表面的第三层可包含生物试剂-捕获部分。生物试剂-捕获部分可为任何种类的，但在具体实施例中，生物试剂-捕获部分是直接或间接的细胞结合部分。在具体实施例中，生物试剂-捕获部分允许直接或间接的细胞选择性。在具体实施例中，生物试剂-捕获部分可包含核酸或可产生核酸。在一些情况下，生物试剂-捕获部分包含氨基酸，例如具有肽或多肽(包括例如具有肽适体的多个重复的氨基酸分子)。生物试剂-捕获部分可包含例如单一适体、适体触角或抗体。在具体实施例中，生物试剂-捕获部分包含抗生物素蛋白蛋白质(包括抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白)或生物素分子，或者与抗生物素蛋白或生物素分子间接相关联。在其中第二层包含抗生物素蛋白种类或生物素之一的情况下，第三层包含相应的配对生物素或抗生物素蛋白种类。
参考图7，用于分离生物试剂的系统100包括分离单元100a和转移单元100b。分离单元100a可包括蛇形袋102，其具有入口端口104且具有入口106(入口可包括限制装置，例如阀或夹具)和具有出口110的出口端口108(出口可包括限制装置，例如阀或夹具)。在一些实施例中，袋102可被配置为管。如图1所示，例如，分离单元可以蛇形方式排列，以节省空间和/或促进分离单元的温度维持。在其他实施例中，例如，分离单元可为直管或螺旋管。
仍然参考图7，分离单元可包含外部材料112，尽管在其他实施例中，该单元缺少外部材料(例如，当该单元包含100％含氟聚合物时)。在某些方面，外部材料可由热塑性聚合物、热塑性弹性体、硅酮、橡胶或其任何组合组成。外部材料可具有至少0.0005英寸、0.0010英寸、0.0050英寸、0.0075英寸、0.01英寸、0.02英寸、0.03英寸、0.04英寸、0.05英寸、至少0.06英寸、至少0.07英寸、至少0.08英寸、至少0.09英寸、至少0.1英寸、或至少0.11英寸的厚度。在另一个实施例中，外部材料可具有不大于0.2英寸、不大于0.18英寸、不大于0.16英寸、不大于0.14英寸、或不大于0.12英寸的厚度。在一个实施例中，外部材料112的厚度范围可为0.06英寸至0.13英寸，例如在某些实施例中0.09至0.126英寸。外部材料112具有内表面1122。
如图12所示，作为例子，外部材料112的内表面1122可被含氟聚合物材料114覆盖。含氟聚合物可为任何种类的，但在具体情况下，含氟聚合物可选自聚四氟乙烯(ptfe)、全氟烷氧基(pfa)、乙烯四氟乙烯(etfe)、聚偏二氟乙烯(pvdf)、聚三氟氯乙烯(pctfe)、乙烯三氟氯乙烯(ectfe)、氟化乙烯丙烯(fep)、乙烯氟化乙烯丙烯(efep)、全氟聚醚(pfpe)、改性聚四氟乙烯(tfm)、聚氟乙烯(pvf)或其任何组合。在特定实施例中，含氟聚合物材料114包含fep。fep是一种方便的材料，因为它维持了用于细胞分离包括至少白血细胞分离的良好可加工性。例如，fep不触发生物样品的先天性免疫应答。相应地，在一个实施例中，含氟聚合物材料114由fep组成或基本上由fep组成。在其中聚合物是ptfe的实施例中，存在用于改变其表面的已知反应，其采用射频辉光放电氨等离子体以在含氟聚合物表面上引入氨基，随后为与戊二酸酐和顺-乌头酸酐的进一步反应，以提供羧酸官能团(gauvreau等人，2004)。适用于ptfe的表面官能化方法可扩展到其他含氟聚合物表面如本文所讨论的那些。
在某些情况下，不存在管的外表面，并且壁是完全含氟聚合物。在任何情况下，在某些实施例中，含氟聚合物材料114可具有至少0.0003英寸、至少0.0004英寸、至少0.0005英寸、至少0.0006英寸、至少0.001英寸、至少0.10英寸等等的厚度。在另一个实施例中，含氟聚合物材料包含不大于0.100英寸、不大于0.08英寸、不大于0.070英寸、不大于0.050英寸、不大于0.030英寸、不大于0.018英寸、不大于0.016英寸、不大于0.014英寸或不大于0.012英寸的厚度。在一个实施例中，含氟聚合物材料114的厚度范围可为0.001英寸至0.015英寸，例如0.002至0.01英寸。在具体实施例中，壁厚度可直到0.100英寸并包括0.100英寸。含氟聚合物材料114可上覆内表面1122，如图7所示。在特定实施例中，含氟聚合物材料114上覆至少内表面1122的大部分。在一个实施例中，含氟聚合物材料与外部材料112直接接触。该含氟聚合物可具有主表面1142。
主表面1142可为管102的暴露内腔。可使含氟聚合物材料114的主表面1142改性。在具体实施例中，可将含氟聚合物材料114改性为包括至少反应性部分。反应性部分可包括可被化学改性以形成生物试剂-捕获部分的结合位点的官能团。在另一个实施例中，反应性部分可为缀合物部分。缀合物部分包含蛋白质和/或核苷酸(例如)的大分子复合物，包括关于生物试剂的至少一个结合位点。对于包含超过一个结合位点的反应性部分，反应性部分可形成捕获部分。
进一步参考图7，转移单元100b允许在通过分离单元100a之后生物样品的控制处理。转移单元100b可包括连接至出口阀110的管120。管120可由例如热塑性聚合物、热塑性弹性体或硅酮制成。在一个实施例中，管120可内衬有含氟聚合物。在特定实施例中，含氟聚合物可与分离单元100a中的相同，但具有未经改性的主表面，即管120中的含氟聚合物不包括反应性部分。例如，含氟聚合物可选自聚四氟乙烯(ptfe)、全氟烷氧基(pfa)、乙烯四氟乙烯(etfe)、聚偏二氟乙烯(pvdf)、聚三氟氯乙烯(pctfe)、乙烯三氟氯乙烯(ectfe)、氟化乙烯丙烯(fep)、乙烯氟化乙烯丙烯(efep)、全氟聚醚(pfpe)、改性聚四氟乙烯(tfm)、聚氟乙烯(pvf)或其任何组合。在特定实施例中，含氟聚合物材料包含fep。
在至少一些情况下，转移单元还可包括分离器122，用于在通过单元100a之后将生物样品从系统转向通过管124。相反，管126允许通过连接器128将分离单元100a连接到另一个系统。在特定实施例中，对另一个系统作出的连接是无菌连接，其可包括管的无菌焊接或使用无菌连接器。
参考图8，该图示描述了当适体是核酸适体(作为例子)时，将具有官能团的生物试剂-捕获部分制备到含氟聚合物202上的示例性方法200。在初始步骤a中，在含氟聚合物202的主表面上制备包含接头204和官能团206的反应性部分。如图8所示，官能团206可为羧基。可替代地，官能团可为羟基(-oh)、醛基(-cho)、羰基(c(o)r，r是c1-c4烷基)、羧基(-cooh)、胺基(-nh2)、亚胺基(＝nh)、酰胺基(-c(o)nhr，r是h、烷基、肽或蛋白)、酯基(-coor，r是烷基、肽或蛋白质)、硫醇基、酸酐基、二硫化物基、苯酚基、胍基、硫醚基、吲哚基、咪唑基、重氮基、炔基、烯基、氮丙啶基、环氧基、异腈基、异氰化物基、四嗪基、重氮表面基团、烷基或其组合。
在至少一些情况下，反应性部分还可包括接头204。在一个实施例中，接头可为共价键，将羧基(或其他官能团)直接连接至含氟聚合物。在另一个实施例中，接头基团可为有机基团。例如，接头基团可为例如包括亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基或其任何组合的线型亚烷基。在某些实施例中，官能团(如cooh)表面包含稳定的涂层而不是共价结合的基团。
含氟聚合物的表面改性提供了在本发明的某些实施例中有用的改性含氟聚合物。一般地，极性官能团附着至含氟聚合物表面或在含氟聚合物表面中产生，使其更易于润湿并提供用于化学键合的机会。存在使含氟聚合物表面官能化的几种方法，包括例如化学蚀刻、物理-机械蚀刻、等离子体蚀刻、在不同压力下的等离子体活化、电晕活化、化学处理、电晕处理、化学气相沉积或其任何组合。在一个实施例中，化学蚀刻包括氨钠或萘钠。示例性的物理-机械蚀刻可包括用二氧化硅的喷砂和空气磨蚀。在另一个实施例中，等离子体蚀刻包括反应性等离子体，例如氢、氧、乙炔、甲烷及其与氮、氩和氦的混合物。lachmann等人(2011)描述了使用氦和合适的反应性种类或成膜剂的气体混合物的表面改性方法。等离子体活化可包括通过用气体处理在表面中形成反应性种类，所述气体包括但不限于氩、氢、氮、二氧化碳和组合。等离子体活化可在低压例如0.1托至0.6托下达到或接近大气压例如700托至760托下实现。可实现在气体下的表面的电晕活化，所述气体包括但不限于氩、氮和氢或其组合，以在表面中产生可进一步用于化学处理中的活性位点。化学处理包括通过化学反应对活性或现有表面的序贯化学改性，所述化学反应包括接枝聚合、偶联、点击化学、缩合和加成反应。作为例子，可通过经由自由基聚合使乙烯基单体聚合来实现在溶液中的接枝聚合。乙烯基单体包括但不限于丙烯酸、(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸烷基酯、苯乙烯、二烯、α-烯烃、卤代烯烃、(甲基)丙烯腈、丙烯酰胺、n-乙烯基咔唑和n-乙烯基吡咯烷酮和马来酸酐。电晕处理可包括反应性烃蒸气如酮(例如丙酮)、醇、对氯苯乙烯、丙烯腈、丙烯二胺、无水氨、苯乙烯磺酸、四氯化碳、四亚乙基五胺、环己胺、四异丙基钛酸酯、癸胺、四氢呋喃、二亚乙基三胺、叔丁胺、乙二胺、甲苯-2,4-二异氰酸酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、三亚乙基四胺、己烷、三乙胺、甲醇、乙酸乙烯酯、甲基异丙胺、乙烯基丁基醚、甲基丙烯酸甲酯、2-乙烯基吡咯烷酮、甲基乙烯基酮、二甲苯或其混合物。
一些技术使用包括这些方法之一的步骤的组合。例如，表面活化可通过在激发气体种类的存在下的等离子体或电晕来实现。例如，表面活化可通过在溶剂气体如丙酮的存在下的电晕处理来实现。另一个例子包括经由在低压或大气压下的等离子体活化或在气体例如氩气中的电晕活化的表面活化，所述气体进一步使用化学处理进行改性。化学处理可为乙烯基单体的接枝聚合反应，所述乙烯基单体包括但不限于丙烯酸、丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸烷基酯、苯乙烯、二烯、α-烯烃、卤代烯烃、(甲基)丙烯腈、丙烯酰胺、n-乙烯基咔唑和n-乙烯基吡咯烷酮、以及马来酸酐。
不受理论限制，已发现该方法提供在改性含氟聚合物和非含氟聚合物界面(或第二改性含氟聚合物)之间的强层间粘附。在一种方法中，含氟聚合物和非含氟聚合物形状各自分别形成。随后，含氟聚合物形状通过美国专利3030290、3255099、3274089、3274090、3274091、3275540、3284331、3291712、3296011、3391314、3397132、3485734、3507763、3676181、4549921和6,726,979中描述的处理方法进行表面处理，所述专利的教导为了所有目的全文并入本文。然后，将所得到的改性含氟聚合物和非含氟聚合物形状例如通过热层压接触在一起，以形成多层膜。最后，多层膜可提交给波长在uva；uvb和/或uvc范围内的uv辐射。
在一个方面，用电晕放电处理含氟聚合物基材的表面，其中电极区域充满丙酮、四氢呋喃、甲基乙基酮、乙酸乙酯、乙酸异丙酯或乙酸丙酯蒸气。
通过气体介质的电容交换产生电晕放电，所述气体介质存在于两个间隔开的电极之间，所述电极中的至少一个通过介电阻挡层与气体介质绝缘。电晕放电由于其电容性质而在起源中略微受限于交流电。这是一种高电压、低电流现象，其中电压通常以千伏特测量到，并且电流通常以毫安测量到。电晕放电可维持在宽范围的压力和频率上。0.2至10个大气压的压力一般限定了电晕放电操作的极限，并且大气压一般是优选的。可方便地使用范围为20hz到100mhz的频率：特别地，范围从500hz，尤其是3000hz到10mhz。
当介电阻挡层用于将两个间隔开的电极各自与气体介质绝缘时，电晕放电现象常被称为无电极放电，而当单个介电阻挡层用于将电极中的仅一个与气体介质绝缘，所得到的电晕放电常被称为半电晕放电。术语“电晕放电”在本说明书中自始至终用于指示两个类型的电晕放电，即无电极放电和半电晕放电。
关于电晕放电处理程序的所有细节在转让给美国e.i.dupontdenemoursandcompany的一系列美国专利中提供，在过期的美国专利号3,676,181和saint-gobainperformanceplasticscorporation美国专利号6,726,979中描述，所述专利的教导为了所有目的全文并入本文。所提出的技术的一个例子可在美国专利号3,676,181(kowalski)中找到。封闭处理设备的大气为氮中的20％丙酮(按体积计)，并且是连续的。例如，恒定进料的多层膜或颗粒填充膜的外层经受0.15至2.5瓦特小时/每平方英尺的膜/片表面。含氟聚合物可在膜/形状的两侧上进行处理，以增加粘附。然后可将该材料放置在非硅化的剥离衬里上用于贮存。经过c处理的材料持续超过1年，而无表面润湿性、粘结性和粘附力的明显损失。
在另一个方面，用等离子体处理含氟聚合物基材的表面。术语“等离子体增强化学气相沉积”(pecvd)是本领域已知的，并且指在基材上将薄膜从气状(蒸气)沉积到固态的过程。在该过程中涉及一些化学反应，其在反应气体的等离子体产生之后发生。等离子体一般由两个电极之间的rf(ac)频率或dc放电产生，基材放置在所述两个电极之间并且空间填充有反应气体。等离子体是其中相当大百分比的原子或分子被离子化的任何气体，导致反应性离子、电子、自由基和uv辐射。
在具体实施例中，可利用导致表面上的自由基/过氧化物的fep的等离子体表面活化的两步法。然后使活化的fep表面暴露于湿化学方法，以允许表面充当自由基聚合引发剂。例如，可使用产生cooh基团的致密表面的丙烯酸单体，尽管可使用其他自由基单体。
进一步参考图8，在步骤b中，官能团与大分子种类208如蛋白质连接。在一个实施例中，这种蛋白质可包括抗生物素蛋白蛋白质。在步骤c中，生物素化的种类可与抗生物素蛋白连接。虽然生物素化的种类可包括针对所需生物试剂的特异性配体如抗体，但生物素化的种类也可仅包括生物素化的核苷酸引物，如图7所示，元件2104。在其他实施例中，生物素化的种类是肽或多肽。在一个实施例中，核苷酸模板可包括聚合酶2102或与聚合酶2102一起利用。为了形成配体，可应用聚合酶技术(例如)以在该方法的步骤d中形成配体特异性dna序列2106。在至少一些情况下，配体特异性dna包括适体。
继续参考图8，解决适体制备的前述描述在步骤d中举例说明，其中使用聚合酶2102生成dna触角2106。提供了包含至少一种适体的反义序列和充当适体序列之间的间隔物的非结合dna主链的反义序列的dna，并且在一些情况下，dna是环状的。在具体实施例中，环状dna是单链的，并且提供引物例如生物素化引物。在另一个实施例中，间隔的dna序列可包括一些另外功能。例如，间隔物可包括荧光部分，用于确定结合到反应部分212上的生物试剂的量的目的。
图9描绘了在具有固定的反应性部分212的管中采用分离单元100a的捕获方法。管的例子包括配备有所需细胞特异性部分(例如适体)的上述反应部分。在步骤l中，使样品(例如全血)302通过管100a。在通过期间，所需细胞304在单元212上特异性结合，而样品的剩余部分离开管。在步骤m中，样品已通过管，并且管已用无细胞缓冲液冲洗，以从管中去除非特异性材料，并洗涤固定的所需细胞。在步骤n中，细胞然后从单元212中移出。在一个实施例中，n1，可通过加热单元306加热管，直到克服细胞和缀合部分即dna触角之间的结合能。小心不要将细胞加热到有害水平。在加热期间，培养基可通过管以接受细胞并将其运送到容器308。
在另一个实施例中，n2，可用限制性酶或dna酶310处理管的内容物，所述酶破坏单元212的dna序列，由此释放所需细胞304。在消化期间，使培养基通过管以接受所需细胞并将它们和酶输送到容器308。酶310可通过简单的过滤去除。在另一个实施例中，通过添加与附着至细胞的区段互补的dna区段，将细胞从其附着物置换到dna上。
注意，不一定需要在上文一般描述或例子中描述的所有活动，可能不需要特定活动的一部分，并且除描述的那些之外还可进行一个或多个进一步的活动。再进一步地，活动列出的顺序不一定是活动进行的顺序。
i.用于分离的细胞及其处理
在本公开内容的实施例中，任何细胞均可通过本文所述的系统分离。用于分离的细胞包括细胞如免疫细胞、血细胞或干细胞(包括胚胎干细胞、成体干细胞或诱导的多能干细胞)。可用本文描述的系统分离的血细胞包括红血细胞、白血细胞或血小板。白血细胞的例子包括粒细胞(例如嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞或嗜酸性粒细胞)或无粒白细胞(例如淋巴细胞、单核细胞或巨噬细胞)。可分离的免疫细胞的例子包括吞噬细胞(巨噬细胞和嗜中性粒细胞)；b细胞；t细胞(包括辅助t细胞和细胞毒性t细胞)；单核细胞；树突状细胞；自然杀伤细胞；调节性t细胞；等等。
在特定实施例中，在本公开内容的系统中分离单核细胞。单核细胞是多能细胞，这意味着它们可分化成各种细胞。单核细胞可分化成的细胞的主要类型是巨噬细胞和树突状细胞。树突状细胞在设计针对病原体的免疫系统的具体回应中具有关键作用。事实上，通过树突状细胞的抗原呈递是刺激t细胞的重要步骤。
ii.总有机碳
总有机碳(toc)是有机化合物中结合的碳量，并且经常用作药物制造设备的非特异性指示剂等等。toc被用作生物技术工业中的工艺控制属性，以监测采用纯化和分配体系的单元操作的性能。
在具体实施例中，toc可根据uspharmacopeia(usp)643以及设备进行测量，所述设备利用uv促进化学氧化的高温湿氧化反应(ultra-cleantechnologyhandbook：第1卷：ultra-purewater,ohmi,tadahiro；crcpress,1993，第497-517页)。纯化水在70℃下置于与聚合物接触24小时，例如以3cm2的制品表面积与1ml水的比率。水被去除与聚合物的接触，并且在toc分析仪中进行测试。合适件的设备是tekmardohrmann型号phoenix8000toc分析仪。
在特定实施例中，对于本公开内容的系统中采用的容器可测量toc，包括例如通过从容器的内表面积提取(其中反映为mg/cm2的结果是对于toc/内部面积的平方厘米)。在具体实施例中，并且仅作为例子，容器可在纯化水70±2℃中提取24±2小时。可通过例如用过硫酸钠的酸化和化学湿氧化将toc转换成二氧化碳来分析提取物的toc。从容器释放的二氧化碳可使用红外检测器进行测量。fep容器的提取比率的例子为3cm2/ml(典型的提取比率为1ml水/3cm2容器的内部润湿表面积)。对于一些容器(如fep袋)，不需要稀释，因为toc水平低于校准曲线的上限，而对于其他实施例(如硅酮配管)，因为在提取物中检测到toc的水平，需要稀释。
fep容器的toc的例子为0.145mg/l(0.00005mg/cm2或0.001mg/g)。对于采用硅酮配管的实施例，提取比率可为14.6cm2/ml(例如对于biosil)，或者可为15.9cm2/ml(例如对于sr139)，并且硅酮biosil管的toc的例子是302mg/l(0.021mg/cm2或0.023mg/cm)，并且硅酮sr139配管的toc的例子为120mg/l(0.008mg/cm2或0.0009mg/cm)。在至少某些硅酮配管实施例中，样品可被稀释，因为提取的体积和浓度导致该值在机器的最大检测值以上。稀释度和不同提取比率需要相反在重量/面积值基础上作出的这些样品与袋样品的比较。
本领域技术人员认识到toc值可以重量/体积表征。然而，本领域技术人员知道用于容器(特别是fep袋材料)的比率相对于用于硅酮配管的比率是可区分的；硅酮配管值只能在mg/cm2起始基础上加以考虑，因为该值不依赖于提取比率/稀释度。本领域技术人员可使用重量/面积结果作为基础并假定标准3cm2/ml提取比率(作为例子)来计算“标准化的”重量/体积比，以便在重量/体积上比较该值。
在具体实施例中，热塑性弹性体(tpe)的toc为0.002mg/cm2(0.032mg/g或5.88mg/ml)。在某些实施例中，fep的toc为0.00005mg/cm2的制品的内部润湿表面(0.001mg/g或0.145mg/ml的制品)。在具体实施例中，制品的内部润湿表面的硅酮的toc为0.021mg/cm2或63mg/ml的制品的内部润湿表面。
在一些情况下，容器的内壁由小于约0.1mg/cm2、0.09mg/cm2、0.08mg/cm2、0.07mg/cm2、0.06mg/cm2、0.05mg/cm2、0.04mg/cm2、0.03mg/cm2、0.02mg/cm2、0.01mg/cm2、0.009mg/cm2、0.008mg/cm2、0.007mg/cm2、0.006mg/cm2、0.005mg/cm2、0.004mg/cm2、0.003mg/cm2、0.002mg/cm2、0.001mg/cm2或是不可检测的在水中的总有机碳(toc)的聚合物组成。在特定实施例中，在水中的toc小于在0.001mg/cm2至0.1mg/cm2、0.001mg/cm2至0.095mg/cm2、0.001mg/cm2至0.075mg/cm2、0.001mg/cm2至0.05mg/cm2、0.001mg/cm2至0.01mg/cm2、0.001mg/cm2至0.005mg/cm2、或0.001mg/cm2至0.025mg/cm2范围内的量。在特定实施例中，在水中的toc小于在0.01mg/cm2至0.1mg/cm2、0.01mg/cm2至0.075mg/cm2、0.01mg/cm2至0.05mg/cm2、或0.01mg/cm2至0.025mg/cm2范围内的量。在特定实施例中，在水中的toc小于在0.05mg/cm2至0.1mg/cm2、0.05mg/cm2至0.09mg/cm2、0.05mg/cm2至0.075mg/cm2、或0.05mg/cm2至0.06mg/cm2范围内的量。在特定实施例中，在水中的toc小于在0.005mg/cm2至0.1mg/cm2、0.005mg/cm2至0.095mg/cm2、0.005mg/cm2至0.075mg/cm2、0.005mg/cm2至0.05mg/cm2、0.005mg/cm2至0.025mg/cm2、或0.005mg/cm2至0.01mg/cm2范围内的量。
在具体实施例中，氟化乙烯丙烯(fep)的toc为0.00005mg/cm2(0.001mg/g)；硅酮材料如硅酮配管的toc为0.021mg/cm2(0.023mg/cm)和0.008mg/cm2(0.009mg/cm)的制品的内部润湿表面；历史上使用的细胞培养袋的toc为0.002mg/cm2的制品的内部润湿表面(0.032mg/g的制品)。
本领域技术人员认识到，如果采用mg/cm2单位，则可跨越不同提取比/稀释度比较toc值。如果单位是mg/l，则必须知道提取比。转换可如下发生：机器输出以mg/l为单位的值，将稀释度考虑在内，然后使用要提取的表面积和总体积将该数目转换为mg/cm2。提供了关于硅酮biosil的例子：
硅酮biosil样品：302mg/l*1l/1000ml*23.7ml/347cm2＝.021mg/cm2。
在特定实施例中，以mg/cm2单位比较toc，因为不需要提取比或任何稀释度。
下文是关于硅酮管biosil样品和硅酮管sr139样品的toc计算的例子。
测试制品提取
toc分析结果
下文是关于fep袋和baxter袋(主要由sebs(苯乙烯嵌段共聚物)组成并且还可包含eva和pp的单层袋)的toc计算的例子：
测试制品提取
toc分析结果
在具体实施例中，pmp膜的toc为0.07ppm(0.00002mg/cm2)。
在具体实施例中，容器包含内表面，其包含具有小于1mg/cm2、0.1mg/cm2、0.09mg/cm2、0.08mg/cm2、0.07mg/cm2、0.06mg/cm2、0.05mg/cm2、0.04mg/cm2、0.03mg/cm2、0.02mg/cm2、0.01mg/cm2、0.009mg/cm2、0.008mg/cm2、0.007mg/cm2、0.006mg/cm2、0.005mg/cm2、0.004mg/cm2、0.003mg/cm2、0.002mg/cm2、0.001mg/cm2等等的在水中的总有机碳(toc)的聚合物。
iii.适体和适体触角的产生
本公开内容的实施例允许从包含数百种不同种类的细胞的血液样品中分离一种细胞。这样的过程需要非常特异性的工具，所述工具对所需细胞(如单核细胞)是特异性的，并且不识别任何其他细胞(包括其他血细胞)。可具有这种特异性的抗体具有许多缺点，包括复杂的程序，需要在体内合成，并且它们可对细胞生成剪切应力和空间效应，潜在地改变其功能性；此外，抗体仅对细胞提供一个附着点。
适体是结合特异性靶分子的寡核酸或肽分子。它们可为单链dna或rna寡核苷酸，其可以高特异性和亲和力和低毒性结合几乎所有类别的小分子或大分子。核酸适体通常通过从大型随机序列库中进行选择来产生，例如通过称为selex的过程：其代表指数富集的配体系统进化(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment)。它们对其目标具有无与伦比的特异性，因为它们的小尺寸和3d构象使得它们比抗体对目标更特异性。例如，适体甚至可区分对映体和蛋白质同种型。产生适体的细胞类型特异性selex方法可为任何种类的，特别是基于活细胞的selex(参见例如ye等人(2012)；ozer等人(2014)；sun等人(2014)；以及zhou和rossi(2014)。
在特定实施例中，用于分离所需细胞类型的特定适体序列适用于从相同生物物种或属或族的任何个体中分离相同的细胞类型。在其他实施例中，用于分离所需细胞类型的特定适体序列仅针对特定个体是特异性的。
在特定实施例中，鉴定了可用于分离所需细胞类型的超过一种适体序列，并且多个适体序列用于本公开内容的系统中。
在一些情况下，适体具有与之附着的部分，其中所述部分可为可检测的和/或可能能够结合另一部分。该部分可为结合对的一个成员，例如生物素或抗生物素蛋白种类。将生物素或抗生物素蛋白附着至dna的方法是本领域已知的。
a.核酸适体的产生
在本公开内容的实施例中，设计适体以便从样品中分离所需细胞，包括例如来自全血样品的单核细胞。虽然适体可以各种方式设计，但在具体实施例中，利用selex方法。
selex是可靶向任何小分子、生物聚合物或细胞的体外方法。一旦已知适体的顺序，就可例如在体外合成它。适体可大量快速生产，并且非常稳定：其贮存期限是无限的。此外，可对其添加使其更容易与表面结合的主链。适体已经在生物制药行业中使用，并且仍未显示免疫原性的证据。
在具体实施例中，cell-selex方法用于生成用于本公开内容的系统的适体。适体基本上是dna的一部分，并且它可为多聚的。它是核苷酸序列，由四个不同单元的独特组合制成的聚合物：a、t、c、g。一旦已知对目标特异性的适体的代码，它就很容易合成。cellselex方法由selex方法修改，以生成对一种细胞高度特异性的适体。在该方法中，将单链dna(ssdna)文库与靶细胞一起温育。洗去非结合序列，并且例如通过在95℃下加热细胞-dna复合物，随后离心，从细胞中回收结合的序列。将回收的库与对照细胞系一起温育，以过滤掉与目标和对照两者上的共同分子结合的序列，导致针对目标的特异性结合物的富集。例如通过聚合酶链反应(作为pcr众所周知)扩增结合序列。这随后为反义链的去除，以生成用于后续轮选择的ssdna库。可通过流式细胞术结合测定来监测所选择的库的富集，与未经选择的dna文库相比，所选择的库具有增加的荧光。
一旦鉴定了一种或多种适体，就可用其使表面官能化，以分离所需细胞，例如袋或管。可使用依赖于适体来分离细胞的替代技术，例如亲和层析，用适体官能化的磁珠、塑料珠或玻璃珠，或者含有适体的水凝胶，或者含有适体的板，只要这些技术用于例如封闭系统中。在特定实施例中，结构可包含含氟聚合物层或以其他方式具有含氟聚合物层。
b.肽适体的产生
肽适体可选自组合肽文库，例如通过噬菌体展示和其他表面展示技术(包括mrna展示、核糖体展示、细菌展示或酵母展示)构建的文库。肽适体是具有在两端上与蛋白质栓系的单个可变环区的小而简单的肽。在至少一些情况下，肽适体由长度为8至20个氨基酸的可变肽区组成，并且可变区由支架蛋白(例如硫氧还蛋白)展示。文库系统及其设计是本领域已知的(borghouts等人，2008和reverdatto等人，2013，其以引用的方式全文并入本文)。
c.适体触角的产生
在特定实施例中，系统中的超过一个适体/分子用于最大化所需细胞与系统的容器的结合(尽管在替代的情况下，在触角中仅采用一个适体)。在特定实施例中，在单个触角分子中重复利用相同类型的两个或更多个适体。在这种情况下，并非一个适体与表面结合，而是具有至少几倍适体序列的长链dna(或氨基酸)与表面结合。适体触角类似于章鱼触角，具有对所需细胞非常特异性的多个“吸盘”。
在具体实施例中，肽适体触角通过化学合成产生。在一些情况下，通过从包含表达构建体的相应核酸载体的表达产生肽适体触角，所述表达构建体指导作为多肽的肽适体触角的表达。
这些触角与细胞特异性适体的利用对于轻轻捕获所需细胞是有用的。事实上，通过这些触角的捕获是无害的，因为几个触角能够捕获一个细胞，导致低剪切应力而高捕获效率。
为了从触角释放细胞，可采取一个或多个步骤。释放细胞的方法的例子包括使用限制性酶来切割dna，使用核酸(dna或rna)来置换细胞，和/或加热。在使用加热时的某些实施例中，加热可为例如在45-50℃的温度范围下约10秒至约5分钟的持续时间。
触角的策略具有许多优点：与样品的一步分离；单次使用；低剪切应力，所以细胞无伤害或最低限度的伤害；高特异性；以及与抗体或单一适体相比，改进的捕获速率。
iv.用于系统的示例性材料和系统的制备
a.一般方面
用于系统的表面中的材料包括具有小于0.1mg/cm2的在水中的总有机碳(toc)的聚合物。含氟聚合物在系统的实施例中是有用的，因为它们是惰性的，含有低可提取物，具有低浸出性，具有足够的o2和co2气体可渗透性，具有低透水性，是柔性的并且很强。
在本公开内容的特定实施例中，系统的不同步骤在分开的容器中发生。在具体实施例中，除了一个或多个入口/出口之外，容器是封闭的实体。在具体方面，除了一个或多个入口/出口之外，系统整体是封闭的实体。容器可为任何类型的，但在具体实施例中，容器是袋、管、珠(例如包封在封闭容器中的珠)、烧瓶、滚瓶或刚性容器。在特定实施例中，系统中的一个或多个容器被修改为从样品中捕获所需细胞。
在某些实施例中，系统的每个步骤都在分开的容器中发生，尽管在替代实施例中，一个或多个步骤在相同容器中发生。在示例性情况下，第一容器用于细胞分离，第二容器用于细胞生长(在一些实施例中，例如单核细胞的扩增以产生初始细胞)，第三容器用于细胞转化(其可视为细胞的活化，包括例如用抗原的单核细胞活化)，并且第四容器用于细胞浓缩(并且至少在一些情况下，活化细胞的纯化)(图1a-1b)。
在具体实施例中，第一容器允许从样品中分离所需细胞。虽然来自样品的细胞可为来自任何种类的样品的任何种类的细胞，但在具体实施例中，细胞是来自血液样品包括未经处理的血液样品的所需细胞(例如单核细胞)。
本公开内容的实施例包括用适体触角的容器(例如袋)的官能化，以从样品(例如血液)中选择细胞(例如，免疫细胞)。适体与细胞表面的特定结构物理相互作用并且捕获细胞(图2或8)。在一些情况下，与适体相互作用的细胞表面的具体结构是系统的用户已知的，而在其他情况下，结构是未知的。该过程可在例如图2所示的物理袋中实现。
在特定的例子中，容器中允许充分暴露于血液样品所需的面积为对于94ml血液380cm2。
图9示出了细胞被含有适体的容器捕获后的细胞释放。细胞可通过任何适当的方法释放，但在具体实施例中，容器被足够加热，使得适体从结合的细胞分离(其可称为熔体)。然后可收获细胞或进一步处理细胞。用于释放细胞的其他方法是用酶例如限制性酶消化核酸适体(并且所得到的释放细胞和酶的混合物可进一步处理或可不进一步处理，以去除酶蛋白质)。用于释放被捕获的细胞的另外方法包括用与适体(适体序列的部分或全部)互补的dna从适体置换细胞。
关于分离单核细胞的本公开内容的具体方法的例子集中于下述：
1)从个体收获单核细胞；
2)离体培养细胞并且使其分化成初始树突状细胞；
3)通过使初始树突状细胞暴露于特定抗原来使初始树突状细胞成熟；和
4)将治疗有效量的活化的成熟树突状细胞注射回个体，并且允许细胞治疗活化免疫系统并对抗靶抗原(例如表达抗原的癌细胞)。因此，树突状细胞被放回到个体的体内，以使其自己对抗医疗状况。
因此，在一些情况下，用本公开内容的系统捕获单核细胞。单核细胞是非常敏感的细胞，其可在与几乎任何表面接触时被活化。含氟聚合物表面不活化单核细胞，并且因此使用含氟聚合物材料的系统可避免这种活化。另外，需要在封闭系统中扩增细胞，需要o2的连续输入和co2的输出，同时保持不透水性。这些都是fep的特征，fep是具有良好的氧和二氧化碳渗透性以及对水的低渗透性的含氟聚合物。另外，为了能够运输和保存细胞，需要具有承受非常低的温度(即低温贮存)的能力的系统。fep是在低温下继续非常良好地发挥功能的材料。所有这一切使fep成为系统材料的有用选择的良好例子。
图8示出了用于生产系统的步骤的示例性实施例，包括将适体链接枝到容器的表面。在示例性情况下，步骤1包括用羧酸使基材(例如含氟聚合物，包括氟化乙烯丙烯(fep))膜的表面官能化。下一步包括经由肽键共价连接蛋白质与羧酸；在具体实施例中，蛋白质具有与其结合的配体，使得进一步的处理将允许另一实体与蛋白质的结合。在具体情况下，蛋白质是抗生物素蛋白，使得与另一个实体结合的生物素可间接地结合到官能化表面。图8允许蛋白质与配体的偶联，例如抗生物素蛋白与用于适体的生物素化的环状模板的偶联。最后一步包括模板的滚环扩增以产生适体触角。图3证实了官能化基材的例子的产生，其中将
在替代实施例中，将生物素化的珠附着至fep基材用于分离目的细胞(图4)。可通过滚环扩增在珠的表面上生成适体。在特定实施例中，生物素化的珠与具有与之附着的抗生物素蛋白的适体一起利用。在具体实施例中，用抗生物素蛋白涂布的珠可捕获生物素化的适体/抗体。在特定实施例中，珠可附着至fep或不附着至fep。在某些实施例中，珠由fep组成，并且提供从样品中分离出所需细胞的替代方法。例如，抗生物素蛋白涂布的fep珠(或另一种材料)可暴露于生物素化的适体，以导致fep珠被适体涂布，然后这些暴露于样品例如血液样品。例如，单核细胞将附着至这样的珠，然后可使它们流过特定的过滤器/膜，该过滤器/膜保持具有与之附着的目的细胞的珠与血液的剩余部分分离。然后，可使用解离方法(如加热、酶等)以从珠中去除细胞。
在具体实施例中，将生物素加入适体的末端。生物素是维生素，其常用于将生物蛋白质连接至表面。生物素与中性抗生物素蛋白具有强亲和力，所以中性抗生物素蛋白可连接至基材的表面，然后生物素化的适体的模板由此与表面间接连接。在特定方面，中性抗生物素蛋白(或抗生物素蛋白)在表面上以足够高的密度连接，并且在具体实施例中，fep表面用cooh官能化。
在具体实施例中，系统的环境有助于维持由本公开内容的系统分离的任何细胞的完整性。该系统被配置为允许细胞充分暴露于氧、水、细胞因子和/或葡萄糖。该系统还被配置为防止细胞暴露于有害水平的有害物质，例如二氧化碳、碳酸和/或乳酸。
b.基材
至少一些系统实施例包括多个层。在特定实施例中，第一层由具有低浸出性、低提取性并且不与细胞有害反应的材料组成。第一层可视为薄膜或膜。在某些实施例中，该层包含聚合物。在具体实施例中，构成容器的润湿表面的聚合物具有小于0.1mg/cm2的在水中的总有机碳(toc)，并且可在构成容器的润湿表面的表面上测量。在一些实施例中，聚合物由硅酮、聚(氯乙烯)(pvc)或
在特定实施例中，第一层包含特定的厚度。在某些方面，该层的最小厚度为0.0003英寸。在至少一些情况下，该层的最大厚度为0.010英寸。
c.基材的官能化
本公开内容的实施例允许合适基材的官能化，使得其可用于直接或间接附着适体。在具体实施例中，因为适体直接附着至表面，所以表面不需要官能化。例如，可不利用系统的抗生物素蛋白/生物素实施例，并且在某些实施例中，存在生物部分与含氟聚合物的cooh(作为例子)表面的直接附着。在其中适体直接附着至表面的情况下，可将dna适体例如直接缀合到改性表面，使用在其中适体用nh2端官能化的情况下的含nh2蛋白质的类似途径(例如通过戊二醛接头或马来酰亚胺接头；参见例如ponche等人，2012)。在这样的实施例中，可避免使用抗生物素蛋白层，并且将适体直接附着至改性表面。在具体实施例中，例如经由特定端基(例如氨基、醛基或环氧基)将dna适体固定至表面(参见oh等人，2006)。例如，当用醛官能化的表面开始时，可使用席夫碱反应来固定dna适体(mcgettrick等人，2009)。其他功能性dna端基可包括氨基、生物素、叠氮化物、硫醇、二硫酚、地高辛、nhs酯、辛二炔基(octadiynyl)、羧基、羟基、醛基、羰基、胺基、亚胺基、酰胺基、酯基、酸酐基、硫醇基、二硫化物基、苯酚基、胍基、硫醚基、吲哚基、咪唑基、氨基乙基酰胺基、炔基、烯基、氮丙啶基、环氧基、异腈基、异氰化物基、四嗪基、重氮表面基团、炔基、烯基、氮丙啶基、环氧基、异腈基、异氰化物基、四嗪基、烷基、氨基乙基酰胺基、酯基和/或重氮基。
在其中表面需要被官能化的实施例中，存在可采用的至少四种一般的固定技术：1)物理吸附；2)电化学活化；3)电化学接枝；和4)抗生物素蛋白-生物素亲和力(在ocana和delvalle，2013年在石墨复合电极的背景下综述)。在其中基材需要被官能化的特定实施例中，存在给予特定起始表面的各种众所周知的反应途径。起始表面的例子包括羧基、羟基、醛基、羰基、胺基、亚胺基、酰胺基、酯基、酸酐基、硫醇基、二硫化物基、苯酚基、胍基、硫醚基、吲哚基、咪唑基、氨基乙基酰胺基、炔基、烯基、氮丙啶基、环氧基、异腈基、异氰化物基、四嗪基、重氮表面基团、炔基、烯基、氮丙啶基、环氧基、异腈基、异氰化物基、四嗪基、烷基、氨基乙基酰胺基、酯基、重氮基或其组合。所选择的官能化将决定需要不同试剂和不同固定化学的反应(例如，希夫碱附着至醛相对于edc/nhs附着至羧酸)。在具体实施例中，采用其中与蛋白质上的nh2基团形成键的反应。作为例子，含氟聚合物可以各种方式实现这种不同的官能性：等离子体处理、化学改性、接枝等等。
在具体实施例中，可受益于使用fep作为基材的优点，所述fep具有与单核细胞无反应的表面，用于用适体捕获细胞。因此，在特定实施例中，存在用生物分子的fep表面的官能化。图8显示了在fep基材(例如膜)的表面上产生触角的示例性步骤。四个示例性步骤描述了可如何使容器官能化。第四步可使用称为phi29dna聚合酶的酶发生。滚环扩增(rca)发展了数百到数千个模板链的拷贝，并且是生物工业中众所周知的过程。模板是由两部分组成的圆：一个是反适体的编码，并且另一个不编码。当酶发展触角时，它将收集与模板编码互补的核碱基，并且制备它的拷贝。因此，触角将包含适体和非编码部分(也称为间隔物)的序列；在具体方面，它是交替共聚物(a-b-a-b-a-b...)。触角的最终长度可由反应时间来控制。在特定实施例中，适体触角的长度在纳米和微米之间，包括数百纳米至数百微米。特定触角中适体重复的长度或数目可与系统中的另一触角有关而变。在某些情况下，适体重复数目为2或更多、10或更多、数十个重复或更多、数百个重复或更多、数千个重复或更多、数万个重复或更多等等。
在特定实施例中，羧酸在基材例如fep基材的表面上生成。在具体实施例中，可采用可在基材的表面上提供cooh基团的任何化学反应(参见，例如，tong和shoichet，1998)。在具体实施例中，所用的处理是等离子体，包括例如用于含氟聚合物的改性等离子体处理：c处理。c处理增加了fep袋的表面上极性基团的存在，最终允许细胞粘附。
在采用经c处理的膜的实施例中，并且为了使用经c处理的膜作为开始开发cooh官能化的fep表面的基础，表征了表面。在x射线光电子能谱(xps分析)、傅里叶变换红外光谱法、扫描电子显微镜检查、飞行时间二次离子质谱法(tof-sims)的组合中，确定在经c处理的fep基材的表面上存在的羰基是已在表面上均匀接枝的小有机链中的醛或酮。因此，在用cooh使表面官能化的具体方面，用氧化进一步使表面反应。
在其中存在更多酮的实施例中，合成策略是在羰基的α中引入氧原子，将酮转变成酯。为了处理该反应，可使用过酸，如mcpba(间氯过氧苯甲酸)。在第二步中，可处理皂化来切割酯并得到羧酸。
在其中存在更多醛的实施例中，可强烈地氧化表面，将醛转变为羧酸。在特定方面，通过使用高锰酸钾(kmno4)与硫酸(h2so4)浓溶液强烈地氧化表面。通过ftir分析反应结果。如图10中已知的，结果显示-oh峰的明确的强烈增加，考虑到反应，这只能来自醛转化为羧酸。在具体实施例中存在羰基峰的略微增加，其来自醇氧化成羰基。在图5的光谱上，存在反应的经c处理的膜光谱、未反应的经c处理的膜光谱和反应的未经处理的膜光谱。未经处理的膜光谱用作阴性对照，因为未经处理的fep不应与kmno4反应。该膜不具有-oh或c-o的增加，这是预期的结果。可在较高的温度和时间下运行反应，以便观察这些变量中的任一个是否是潜在限速的。
因此，存在表示3％表面的c＝o量。根据结果，醛是这些基团的主要部分。它们转变成羧酸，因此在具体实施例中，至少1％的表面用cooh官能化。1％的表面代表1个羧基/2nm2。然而，中性抗生物素蛋白覆盖约25nm2，因此当表面被均匀地覆盖时，对于一种蛋白质将存在至少10个羧基，这足以设计一个共价键。然而，对于cooh的量计算的百分比基于xps的结果，其给出了10纳米深度上的o百分比。因此，实际上，可预期具有超过0.5个cooh/nm2。
在氧化不设计足够的羧酸的情况下，可采用替代反应。在具体实施例中，利用格氏试剂。实际上，在无水环境中，可在碳和卤素之间引入镁原子。以这种方式设计的r-mg-x是非常反应性的，并且允许添加具有特定功能的碳链(例如羧酸)的选项。在设计格氏试剂的某些情况下，如果反应对氯或溴不是太困难，则它对于氟可能更复杂，尽管仍可用溶剂的正确选择和催化剂进行处理。一个例子在以引用的方式全文并入本文的“preparationofalkylmagnesiumfluorides”,(yu,1971)中描述。其中，在大气压回流的条件下，使用碘作为催化剂，1,2-二甲氧基乙烷作为溶剂，在4小时内以92％的产率产生正己基氟化镁。
然而，存在用于将cooh基团赋予表面的各种选项。在具体实施例中，在基材的表面上生成羧酸包括例如丙烯酸的接枝(参见例如racine等人，2010)。在fep的表面上获得cooh的另外的反应包括下述：1)通过使未经处理的fep暴露于萘钠处理的表面还原，随后为通过使经处理的fep暴露于硫酸中的kclo3的表面氧化；和2)使未经处理的fep暴露于氨等离子体，其中将样品保持在无氧区室中，以便限制在经处理的表面上的氧摄取，随后为使经处理的表面暴露于在丙酮中的戊二酸酐溶液。
在某些实施例中，除羧酸外的部分在基材的表面上产生，并且这种改性可通过本领域的任何合适的方法发生。例如，可通过用在基材的表面上的醛开始的酰化反应，将聚合物与蛋白质缀合(srivastava等人，2014)。另外，可采用具有戊二醛(或例如环状半缩醛或聚合半缩醛)的氨基官能化的乙酸纤维素，以获得用于共价生物分子优化的活化表面(heikkinen等人，2011)。
用于产生官能团(例如cooh基团)的方法包括使用气体例如氩、氢、氮、二氧化碳及其组合的处理的等离子体活化。在具体实施例中，等离子体活化在低压例如0.1托至0.6托，或接近大气压，例如700托至760托下实现。在气体(例如氩、氮和氢或其组合)下的表面的电晕活化可用于在表面中产生可进一步用于化学处理中的活性位点。化学处理可包含通过化学反应对活性或现有表面的序贯化学改性，所述化学反应包括接枝聚合、偶联、点击化学、缩合和加成反应。例如，可通过经由自由基聚合使乙烯基单体(丙烯酸、(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸烷基酯、苯乙烯、二烯、α-烯烃、卤代烯烃、(甲基)丙烯腈、丙烯酰胺、n-乙烯基咔唑、马来酸酐和n-乙烯基吡咯烷酮)聚合来实现在溶液中的接枝聚合。
d.抗生物素蛋白种类与表面的连接
在特定实施例中，包含羧酸的表面具有与之附着的蛋白质种类，例如抗生物素蛋白种类。蛋白质种类可通过任何合适的方法附着至羧酸基团，包括例如吸附或缀合。抗生物素蛋白种类在各种种类上的吸附是本领域已知的(albers等人，2012；orelma等人，2012；vermette等人，2003；vesel和elersic，2012；vesel等人，2012)并且在具体实施例中，技术人员考虑到，如果缓冲液的ph处于蛋白质获得与界面相反的电荷的点，则蛋白质在亲水界面上吸附更多。另外，抗生物素蛋白种类在各种种类上的缀合也是本领域已知的。这些方法包括用edc和nhs的活化(orelma等人，2012；fabre等人，2012；vermette等人，2003；vesel等人，2012；xia等人，2012)。
在具体实施例中，基材的表面是经c处理的氧化的fep(用羧酸官能化)。在初步研究中，可利用小表面，例如1cm2。考虑到具有约1个cooh/nm2，在1cm2上存在106个cooh。以摩尔计，这对应于约1.7*10-18摩尔。另一个限制因素是表面的大小：一个蛋白质覆盖约20nm2，所以不能将超过50000个蛋白质连接至表面。可使用大量过量的蛋白质，如5,000,000个蛋白质，这对应于8.3*10-18摩尔。抗生物素蛋白重量约66kda；它对应于6.6*104g.mol-1。然后，溶解的蛋白质的质量为5.5*10-13g。这个数字表明对于每个初步研究可利用最小量的蛋白质。起始量的一个例子是可能的最小体积中的0.1mg/ml蛋白质。
示例性方案提议：
i.第一步是用含有nhs(0.4mol.l-1)和edc(0.1mol.l-1)的乙酸钠缓冲溶液(10mmol.l-1)活化表面。
ii.第二步是通过使用含有中性抗生物素蛋白(100ug.ml-1)的相同缓冲溶液(10mm)的中性抗生物素蛋白结合。
iii.然后，通过用以ph8.5的0.1m乙醇胺洗涤系统可去除过量的nhs酯。然而，在过程中，这个步骤不是必需的，因为未预期过量的nhs酯。
iv.最后一步是去除非特异性结合的中性抗生物素蛋白：为此，用100mm甘氨酸-hcl溶液(用hcl和naoh将ph调节至2.5)洗涤系统。
为了确定蛋白质是否是连接的，可采用afm、ftir、ζ电位、拉曼、蛋白质660nm测定、bradford测试、elisa测试、荧光显微镜方法或tof-sims来检测肽键。
e.适体附着至fep表面
为了证实dna与fep表面的附着，可将生物素化的物体附着至与fep结合的中性抗生物素蛋白。在具体实施例中，可使用生物素化的荧光素，其在uv灯下可允许检测固定的蛋白质。在其他情况下，可使用生物素化的聚合物珠；偶联到eds检测器的sem将检测聚合物珠。在特定实施例中，可使用生物素化的长的随机dna链：与eds检测器偶联的sem将检测dna中存在的磷的量，如果它是固定的话。
v.细胞分离的替代实施例
在利用适体触角分离所需细胞的替代实施例中，可注入对样品中的所需细胞特异性的生物素化适体，随后将混合物提供至在中性抗生物素蛋白中涂布的容器以选择性捕获生物素，然后在去除样品后保留所需细胞。
为了分离所需细胞，可用适体选择性地靶向它们，并且可通过细胞selex方法来改造适体。一旦对所需细胞特异性的适体的序列是已知的，就可以更高数量合成它们。在其中所需细胞是单核细胞的情况下，在单核细胞上存在的至少一种表面标记物的确存在，cd14。用化学合成的这些适体用生物素进行官能化。也可制备具有涂布有中性抗生物素蛋白或另一种生物素-结合蛋白(抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白)的内表面的fep容器。为了实现这点，可首先用羧基使fep表面官能化，然后用肽键将蛋白质连接至表面(通过nhs和edc催化的反应)。
在图11中示出了示例性过程。该过程的第一步是将适体与样品如100ml血液样品混合。单核细胞在端部用生物素化的适体标记。然后，在第二步中，可用血液样品填充管，允许生物素通过中性抗生物素蛋白特异性地连接至表面(生物素-中性抗生物素蛋白复合物的kd为1015)。在第三步中，可通过用培养基(例如将用于细胞培养的培养基)填充管来去除样品。第四步是使细胞从管壁脱离。可使用酶来切割适体或使用酶来消化细胞的表面上存在的蛋白质。或者，也可加热管(例如，48度2分钟)；加热将使适体变形并释放细胞。在最后一步中，将细胞收集在另一容器，例如由fep组成的容器中。
vi.来自系统的经分离的细胞的示例性应用
用本公开内容的特定方法分离的细胞可在细胞从适体释放后用于一种或多种应用，或者可在进一步的处理步骤后利用细胞。在具体实施例中，由本公开内容的系统分离的细胞可用于贮存，随后为未来使用，包括用于一个或多个个体的治疗的未来临床用途。在特定实施例中，通过本公开内容的系统分离的细胞被递送至有此需要的个体，在某些实施例中包括直接递送至有此需要的个体。可进一步处理细胞，例如进一步浓缩细胞，加入药物载体，添加生物试剂(例如细胞因子(包括一种或多种白细胞介素)、趋化因子、生长因子或活化抗原呈递树突状细胞的任何因子)，细胞的重组操作，例如改造细胞以表达一种或多种特定t细胞受体、嵌合抗原受体等等。然而，在某些实施例中，细胞通过本公开内容的系统充分制备，使得它们可用于直接递送至需要细胞治疗的个体。个体可以是或也可以不是由其获得包含细胞的原始样品的个人。因此，在用系统分离后递送到个体的细胞可为与个体自体的(属于同一个体)或与个体同种异体的(属于除由其获取样品的个体外的个体)。进行系统步骤的个人可以是或可以不是从个体获得样品的人或将样品递送至有此需要的个体的人。
本公开内容的特定实施例利用通过系统分离的细胞用于哺乳动物的细胞治疗。在具体实施例中，细胞被用作具有医疗状况的个体的个性化药物。在具体实施例中，医疗状况是癌症、关节修复(包括脊椎盘)、神经系统修复或自身免疫病症。在特定方面，细胞被用作例如免疫原性组合物，包括疫苗。在其中个体患有癌症的实施例中，从系统中分离的细胞可能对个体的癌症的肿瘤抗原是特异性的。
在特定实施例中使用本公开内容中概述的方法将特定细胞类型捕获到表面上可用于除细胞类型与细胞混合物分离之外的应用。例如，在具体实施例中，在一些共培养应用中，将一种细胞类型锚定至表面，同时仍与悬浮中的细胞相互作用可能是有用的，以便能够区分两个群体。此外，对于优先作为贴壁培养物生长的细胞，在一些实施例中，利用所概述的方法来允许细胞在培养期间可逆地对接到表面可能是有用的；无论表面是平坦表面还是球形表面如在微载体上的发现的那种表面。
vii.本公开内容的试剂盒
本文所述的系统或方法的任何组分均可包含在试剂盒中。在非限制性例子中，用于捕获生物试剂的器械可包括在试剂盒中的合适容器手段中。该器械可为任何种类的，只要它被配置为允许在其上放置聚合物。该器械可为袋，并且在一些情况下是可视为管的细长袋。试剂盒可包含用于该器械中的一种或多种含氟聚合物(包括用于该系统的器械)，器械包含含氟聚合物、一种或多种反应性部分、用于与反应性部分一起使用的一种或多种接头、合适的试剂和/或用于从个体提取样品的一种或多种装置和/或试剂。本公开内容的试剂盒还可包含下述中的一种或多种：抗原；用于样品收集或贮存的器械(例如小瓶、注射器、杯子、手术刀或其组合)；聚合酶(例如phi29聚合酶)；内切核酸酶；以及缓冲液。
试剂盒可包括适当等分的液体，用于方法中或用于制备用于方法中的器械。试剂盒的某些组分可在水性介质中或以冻干形式包装。试剂盒的容器手段一般可包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其他容器手段，组分可置于其内，并且优选适当地等分。如果试剂盒中存在超过一种组分，则试剂盒一般还包含另外的组分可分开置于其内的第二容器、第三容器或其他另外的容器。本发明的试剂盒通常还包括用于将所述试剂盒的任何组分包含在密闭约束中商业销售的手段。这样的容器可包括例如所需组分保留在其内的注射或吹塑塑料容器。
当试剂盒的某些试剂在一种或多种液体溶液中提供时，液体溶液可为水性溶液，例如包括无菌水性溶液。在这种情况下，容器手段本身可为注射器、移液管和/或其他这样的类似器械。然而，在一些情况下，试剂盒的组分可作为干粉提供。当试剂和/或组分作为干粉提供时，可通过加入合适的溶剂来重构粉末。设想溶剂也可在另一个容器手段中提供。
本公开内容的试剂盒还可包含下述中的一种或多种：抗原；用于样品收集或贮存的器械(例如小瓶、注射器、杯子、手术刀或其组合)；聚合酶(例如phi29聚合酶)；内切核酸酶；以及缓冲液。
实例
包括下述实例以证明本发明的优选实施例。本领域技术人员应了解，下述实例中公开的技术代表由发明人发现的在本发明的实践中运作良好的技术，并且因此可视为构成用于其实践的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应当理解，可在所公开的具体实施例中作出许多改变，并且仍然获得相同或相似的结果，而不背离本发明的精神和范围。
实例1
经分离的单核细胞数目的评估
本实例提供了在本公开内容的实施例中分离的单核细胞数目的评估。
考虑到管：r＝0.5cm,l＝1.2m＝>v＝94ml,s＝3.8*10-2m2
一个单核细胞具有约7μm的半径。那么，如果它是固定的，则它将覆盖的平均表面是1.5*10-10m2。在管表面上可捕获的单核细胞的最大数目为2.5*108个。在示例性的94ml血液中，存在7.5*107个单核细胞(假定在平均血液样品中8*108个单核细胞/l的浓度)。假设25％的细胞捕获效率、80％的释放和80％的最终存活率，则分离出约1.2*107个活单核细胞。在某些方面，需要106至107个单核细胞来处理树突状细胞疫苗。
实例2
表面制备
该实例涉及在氟化乙烯丙烯(fep)上的表面官能化和蛋白质固定，所述氟化乙烯丙烯作为容器由其组成或具有由其制备的壁的材料的例子。在一些实施例中，蛋白质的固定可通过两种不同的方法进行：物理吸附和化学缀合。在该实例中描述的所有研究都用在三种不同的fep膜表面(未经处理的、经c处理的和经c处理的氧化的)上的两类蛋白质(抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白)之一进行。在下文中提供了证实吸附和化学缀合以及膜氧化的方案的例子。
吸附
吸附实施例涉及蛋白质通过吸引力(例如静电相互作用、疏水相互作用和亲水相互作用或范德华力)在表面上的物理吸附。这种方法是直接的，并且吸附是自发的，只需要几秒来启动。可考虑可能影响吸附过程并且最终影响蛋白质在表面上的行为的几种内部和外部参数。外部参数如温度、ph和离子强度可改变吸附的平衡状态和动力学。例如，增加温度将允许熵增益并且帮助从表面释放吸附的分子和盐离子，并且帮助蛋白质的结构重排，这将使得更多的蛋白质能够吸附至表面。缓冲液ph将影响蛋白质的静电状态，并且将产生负电荷或正电荷，这将根据蛋白质的特定等电点(iep)改变与表面的吸引或排斥相互作用。最后，溶液中的高离子强度将增加蛋白质聚集的趋势(表1；rabe2011)
为了完成该方法，表面仅与蛋白质溶液接触短时间段(例如，几秒或几分钟)。在此步骤之后，将表面轻轻洗涤并且准备用于下一步。这种方法的简单性和速度使其成为获得表面上的蛋白质层的主要候选物。可考虑可影响反应可逆性(解吸)和吸附后的蛋白质稳定性的各种参数。
表1：蛋白质的一般吸附趋势(rabe,2011)
缀合
在另一个实施例中，存在蛋白质与表面的化学缀合。通过这种方法，蛋白质通过特定的化学反应共价偶联至基材。为了完成这种方法，通过在fep的表面上加入羧酸基来使表面改性。可使用两步法实现这一官能化。第一种方法称为c-treatment，商购可得(saint-gobain)的表面，并且第二种方法是氧化反应。
当羧基存在于表面上时，羧基至胺的缀合可用于使蛋白质与表面结合。在具体实施例中，通过使用通常称为edc(drumheller和hubbell2003)的水溶性碳二亚胺交联剂1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐来活化羧基。
在用edc/nhs活化表面后，蛋白质与nhs酯试剂接触并与表面结合。可优化温育时间，以便提高该方法的可扩展性。在缀合反应后，用甘氨酸-氯化氢(甘氨酸-hcl)溶液洗涤表面，以去除所有静电结合的蛋白质。(orelma等人2012)
在特定实施例中，该附着方法诱导更稳定的蛋白质层到表面。
膜选择的例子
在具体实施例中，系统的容器包含氟乙烯丙烯(fep)，并且在某些方面，fep可为未经处理的fep、经c处理的fep或氧化的经c处理的fep。未经处理的fep是相当疏水的(水接触角：99°)，并且具有相对低的表面能(19mj/m2)。蛋白质吸附可在该表面上发生，尽管在特定实施例中，表面是改性的。在其中进行缀合方法的实施例中，使fep表面改性以便获得起始羧酸官能团。
经c处理的fep(saintgobain)提供了必要的极性表面官能团，用于向表面添加-cooh基团的化学反应。c处理的效应是其提高膜的表面能(水接触角：66°，并且表面能：38mj/m2)，同时与其未经处理的配对物相比也产生更亲水的表面。表面能已知影响蛋白质对膜的吸附，使得在特定实施例中，经c处理的fep膜成为吸附方法的替代候选物。
对于氧化的经c处理的fep，进行氧化反应以向表面添加羧酸基团，以将蛋白质共价附着至fep。存在于膜上的-cooh基团允许edc/nhs反应并产生酰胺键以结合抗生物素蛋白。该反应可用两种产物进行：0.8mm高锰酸钾(kmno4)和0.12m硫酸(h2so4)。在特定实施例中，在表面上加入羧酸是能够使蛋白质与表面共价结合的先决条件。在具体实施例中，该氧化反应使得经c处理的fep膜更亲水并且进一步增加了表面能。除了缀合之外，在具体实施例中，该氧化表面也是吸附过程的起始材料，因为它改变了表面能和润湿性。
表2：三种不同类型的fep膜之间的比较
表面化学
方法用于评估膜表面上存在的元素和化学基团。对于表面表征，考虑了氧原子和/或醛、酮和羧酸基团的存在。在具体实施例中，在未经处理的fep上仅可见c和f，在经c处理的fep上存在n、o和醛/酮基团，并且在氧化的经c处理的上存在cooh基团。对于具有蛋白质的样品，集中于c、n和o的高度存在以及少量s。蛋白质上存在的主要化学基团是羧酸基(cooh)、酰胺键(cno)和伯胺(nh2)。
x射线光电子能谱(xps)
xps用于确定表面上的定量原子组成和化学。单能x射线轰击样品并引起电子射出。元素的鉴定由射出电子的动能进行。在
下文显示了在未经处理的fep上如预期的仅存在c和f原子。在经c处理的膜上也检测到n(2.6％)和o(3％)的存在。这些元素通过c-treatment添加到表面。表面上的氧原子可为醛和酮存在的指示剂。在下表3中，通过碳化学状态分析，c＝o键(3％c)的存在证实了羰基(c＝o)基团存在于表面上。观察到在氧化的经c处理的上o的少量增加(3.4％)，但这与预期结果不符。预期氧的量的重复是因为推断向醛基添加另一个o的氧化反应。此外，双键o(＝o)看起来在氧化后降低。这可指示反应是从表面去除醛基或酮基，而不是在羧基中使它们改性。
表3：来自xps测量的碳化学状态(以c的原子％表示)
xps方法用于验证表面上蛋白质的存在。
表4显示了不同类型的fep膜的xps测量。
数据以原子％显示
表5显示了未经处理的膜和具有吸附的中性抗生物素蛋白的未经处理的膜之间的区别。第二膜显示了n和o的存在。在具有缀合的中性抗生物素蛋白的氧化的经c处理的上可检测到相同类型的信息。与氧化的经c处理的样品相比，n和o的高度存在指示在膜的表面上存在蛋白质。
表5显示了不同类型的fep膜的xps测量。
蛋白
该方法提供了关于蛋白质的存在和不存在的信息，而其他方法可用于确定蛋白质的量和蛋白质层的均匀性。
傅里叶变换红外光谱法(ftir)
ftir是提供关于固体或薄膜上的元素的化学键合的信息的非破坏性方法。ftir-atr方法用于在表面上聚焦，并且获得分子振动光谱。光谱是背景和大气校正的。数据被修改以获得在4000-1400cm-1的光谱面积之间的吸光度选项中的信息。在该区域上进行了聚焦，以避免fep的cf键(1100-1300cm-1)的高信号。ftir光谱上的特定化学基团与其基团频率之间的相关性是本领域已知的(coates2000)。
为了验证样品上蛋白质的存在，应该考虑在～1640cm-1处的酰胺基团面积的氧双键(c＝o)。与其中表面仅与naoac缓冲液接触的对照膜相比，可明确看到吸附的蛋白质样品上的该区域中的峰。该峰存在于具有吸附蛋白质的所有膜上，并且指示抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白两者均可吸附在fep表面上。在未经处理的和经c处理的膜上，在抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白之间的峰强度中存在轻微差异。在具体实施例中，该差异来自吸附的蛋白质的量，并且这可通过其他定量方法来验证。图10-11显示了具有固定化蛋白质的样品光谱。
亚甲基蓝染料(mb)
开发该方法以鉴定和测量在氧化和/或官能化后在膜上羧基的存在。亚甲基蓝用于鉴定表面上的羧酸(-cooh)和非聚阳离子结合的羧酸根基团(-coo-)。该带正电的染料被吸附在官能化表面上，并且通过可见光谱法在600nm的波长处测量。在特定实施例中，该程序利用浸渍步骤，其中官能化的膜与亚甲基蓝溶液接触10分钟。其后，在测量之前将膜洗涤并干燥。通过对染色前和染色后的样品进行测量，可观察到在600nm波长处的吸收的存在。这显示亚甲基蓝的存在，因为它与膜的表面上可用的羧基和羧酸根基团结合。这种吸收中的变化在亚甲基蓝溶液中染色后的氧化的经c处理的样品上在图12、13和14中显现。对照是有用的，因为背景可适时改变。实现比较的一种方法包括从最终吸光度测量中减去对照(空白)。
形貌和光学分析
方法涉及对表面形貌的评估，并且存在可见化学改性和蛋白质固定如何改变fep表面的视觉数据。
扫描电子显微镜检查(sem)
一种分析方法包括扫描电子显微镜检查(sem)。该方法提供了样品表面的高分辨率和长景深图像。sem用于察看表面的蛋白质层。在fep表面上观察到不同层的图案。由于未经处理的膜的高疏水相互作用，在未经处理的fep上观察到的网状层(图15)可通过可能的蛋白质聚集来解释。在这种情况下，优先促进蛋白质与蛋白质的相互作用以获得平衡状态。在其他类型的fep膜上并未观察到这种层(图16)。
图15d显示了附着至表面的一些生物素涂布的聚苯乙烯微珠。预期这些珠的完整层以测试吸附的中性抗生物素蛋白的生物素结合位点(生物活性)的反应性。在未经处理的膜上仅观察到分散珠，并且其中几个在经c处理的和氧化的经c处理的膜上。在具体实施例中，这种差异通过珠(d＝1μm)和蛋白质(～20nm)之间的大尺寸差异来解释。图17更详细地显示了珠附着。在珠下观察到蛋白质层的不同图案。在左侧角上也观察到具有相同层图案的另一个斑点。在具体实施例中，这通过蛋白质因为呈递给珠的生物素的吸引力而改变其原始吸附构象来解释。在样品制备期间的吸引生物素力和冲洗步骤的组合可导致表面的生物素珠的损失，允许在表面上的中性抗生物素蛋白构象修饰的不同图案痕迹。
光学显微镜检查
借助于可见光和透镜，光学显微镜检查可用于获得小样品的放大图像。图18图像显示了附着至未经处理的膜上的蛋白质层的生物素微珠的存在。这种技术可借助于标记如微珠或生色染料来帮助观察蛋白质层的均匀性。
表面能
具有surpass的ζ电位
surpass是测量固体表面的流动电位/流动电流的仪器。固体表面的ζ电位可由平面样品如fep膜的流动电流计算。使用固定的自动滴定系统，可测量根据ph的ζ电位或根据表面活性剂浓度的的ζ电位。(antonpaar2013)。这种方法是敏感的，并且给出关于样品在不同ph和表面的iep点下的表面能的信息。在具体实施例中，该装置有助于表征在c处理、氧化反应和蛋白质吸附后的表面改性。在某些实施例中，在c处理和氧化后可见iep的增加，作为在相同离子和ph条件下获得的ζ电位值的增加。来自surpass研究的数据可指示处理后fep膜的亲水特性的增加。可进行关于氧化的经c处理的fep的研究。
蛋白质测定
下文立即描述的方法用于直接测试蛋白质。证实了直接显现蛋白质并验证其稳定性的方法。
660nm蛋白质测定
该方法使用与蛋白质中的主要碱性氨基酸残基例如组氨酸、精氨酸、赖氨酸、酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸结合的染料-金属络合物(antharavally等人，2009)。在酸性条件下，试剂为红棕色，但当染料-金属络合物与蛋白质结合时，试剂变为绿色。使用uv-vis分光光度计在660nm处测量染料的最大吸收。该技术主要用于测量溶液中的蛋白质浓度，但在本文中被修改为鉴定在表面上的蛋白质。在具体实施例中，具有蛋白质的官能化表面与试剂接触至少5分钟。其后，在通过uv-vis光谱法测量吸收之前，将膜洗涤并干燥。
通过在染色蛋白质之前和染色蛋白质之后获得样品的测量，可在660nm波长处进行观察。增加的吸收显示在膜的表面上的蛋白质存在。当与其中仅具有缓冲液残留物的膜与试剂反应的标记为“对照”的柱相比，察看代表在膜上的染色蛋白质的标记为“抗生物素蛋白”和“中性抗生物素蛋白”的第二列和第三列时，该效应可在图19中显现。当使用缀合和吸附方法时，可见蛋白质在具有两种蛋白质的所有类型的膜上的蛋白质存在：抗生物素蛋白和中性抗生蛋白。未经处理的fep上的抗生物素蛋白看起来显示比所有其他方法更少的表面附着。可考虑用于制备蛋白质溶液的缓冲液选择，因为一些缓冲液可与“蛋白质测定试剂”相互作用并且给出假阳性结果。图20显示了经c处理的中性抗生物素蛋白谱660nm蛋白质测定。
洗涤实验
在具体实施例中，可在膜上的蛋白质官能化之后使用两次洗涤步骤来表征蛋白质稳定性。第一种方法包括使用苛刻的离子型洗涤剂，例如十二烷基硫酸钠(sds)，其通常用于冲洗表面以去除蛋白质。该洗涤剂通过破坏非共价键和使蛋白质变性来影响蛋白质的分子3d构象。图21显示了在sds洗涤之前和sds洗涤之后具有吸附的中性抗生物素蛋白的氧化的经c处理的膜。如预期的，sds几乎完全去除蛋白质层和其他缓冲液残留物。sds曲线(黄色)上的酰胺键峰在对照值(红色)以下。通过该实验，可确定可在蛋白质官能化表面上进行的冲洗步骤的极限。
第二种方法涉及使用超声波发生器。该机器一般用于洗涤表面并通过冲击去除盐和灰尘残留物。图22和23显示了对具有吸附的中性抗生物素蛋白的未经处理和经c处理的fep的超声处理结果。在超声处理步骤后，仍存在酰胺峰(1630cm-1)，并且给出了在膜上的蛋白质稳定性的指示。
表征蛋白质稳定性、层均匀性和生物素结合活性的方法的实例
荧光标记
通过使用荧光显微镜检查，与生物素缀合的荧光团用于观察吸附至表面的蛋白质(sromqvist等人，2011)。当与抗生物素蛋白结合时，生物素-4-荧光素淬灭，并且在一些研究用于滴定抗生物素蛋白的生物素结合位点。(关于蛋白质的荧光素标记通常使荧光素的量子产率降低60％，但仅使其消光系数降低10％(thermoscientific2011))。在具体实施例中，该分子以相同的方式用于膜上，以便验证固定的抗生物素蛋白的生物活性。
为了避免当荧光团附着至蛋白质时的淬灭效应，可使用较长的臂间隔物。在具体实施例中，该间隔物可由聚乙二醇(peg)分子制成。在具体实施例中，可采用当分子结合抗生物素蛋白时保持荧光信号的生物素-荧光团。
酶联免疫吸附测定(elisa)
elisa是设计用于检测和定量不同分子例如肽、抗体和蛋白质的测定。该方法可用于确定样品上的蛋白质的量并且验证附着的蛋白质是否是活性的。(vermette等人，2003)。图24显示了如何对fep样品进行elisa的实施例。首先，将抗生物素蛋白/中性抗生物素蛋白附着至表面。在该步骤后，用牛血清白蛋白(bsa)的溶液洗涤fep表面，以封闭表面并避免非特异性酶结合。第二，将生物素化的酶溶液加入官能化表面，并且与生物素结合位点结合。小牛肠碱性磷酸酶(cip)和辣根过氧化物酶(hrp)可与生物素分子缀合，并且用于fep膜上的该测定。在温育后，再次冲洗表面以去除未结合的酶。第三，将反应性基材加入表面上，并且根据基材温育一定量的时间。基材的选择取决于测定灵敏度和可用的仪器(例如分光光度计或酶标仪)。发光和荧光基材更敏感，并且可用于检测极少量的蛋白质(皮米范围)。
在特定实施例中，elisa方法给出了附着的蛋白质的生物活性的良好构想。如果中性抗生物素蛋白在其附着后保持活性，则生物素化酶将能够结合到抗生物素蛋白/中性抗生物素蛋白的特异位点。这些结合的酶将与基材反应并且生成显色产物或荧光产物。这些产物通过测量溶液的吸光度进行记录。当显色产物或荧光产物浓度在溶液中增加时，吸光度将增加，因此在基材产物浓度与膜结合蛋白的量之间存在直接的相关性。
原子力显微镜检查(afm)
原子力显微镜检查用于表征聚合物的形态。它测量样品表面和固定在悬臂梁上的非常锋利的探针尖端之间的力。该方法允许观察固定的蛋白质到表面的存在。在具体实施例中，该方法是可视化的，并且可在几μm上对附着的蛋白质作图。敲击模式也可用于验证蛋白质的稳定性和生物活性。通过使用在悬臂上的生物素尖端，可敲击在表面上的蛋白质，并且分析去除在表面上吸附的蛋白质所需的能量。如果该能量类似于抗生物素蛋白和生物素之间的连接能，可了解抗生物素蛋白对表面的吸附比生物素-抗生物素蛋白相互作用更强。
实验方案的实例
下文提供了本实例中提及的实验方案的例子。
用亚甲基蓝的fep表面染色(鉴定在表面上的-cooh和羧酸根基团)：
1.在ph7.0下制备10-3m亚甲基蓝溶液。
a.在1升dh2o中混合0.32g亚甲基蓝
b.用hcl或naoh调节ph以达到ph7.0
2.将膜浸入亚甲基蓝溶液中10分钟。
3.通过在dh2o(ph＝7.0)中浸泡表面1分钟冲洗膜并且喷射表面
4.用温和的气流干燥或在通风罩中温育。
分析：通过uv/vis光谱法确定亚甲基蓝吸收。测量在膜上在600nm处的吸光度。
染色在膜上附着的蛋白质(允许鉴定在聚合物膜上附着的蛋白质的存在)
1.将2”x1.5”膜放置在表面皿(watchglass)上，并且用10ml试剂回收官能化表面(可调整试剂体积以完全回收样品)
2.盖上并且在室温下温育5分钟。
3.从溶液中取出样品，并且用大量的dh2o洗涤(浸渍5x，并且使用瓶在表面上喷射dh2o)
4.用温和的气流使样品干燥，或在罩下使干燥
分析：通过uv/vis光谱法确定蛋白质试剂吸附，并且测量在膜上在660nm处的吸光度。
在表面官能化之前/表面官能化之后溶液中的蛋白质浓度
1.在测定的工作范围(25-2000μg/ml)内制备标准曲线。将10μl1000μg/ml标准与390μl0.9％盐水和0.05％叠氮化钠混合，以获得25μg/ml标准溶液。或者，用在10mmnaoac缓冲液中的100μg/ml中性抗生物素蛋白溶液制备标准曲线。
2.将0.1ml标准的每个重复、样品空白样品加入试管内。(如果使用较小的样品体积，则保持1:15的比率)
3.向每个管中加入1.5ml蛋白质分析试剂，并且涡旋以充分混合。
4.盖上并且在室温下温育5分钟。
分析：通过uv/vis光谱法确定蛋白质试剂吸收。测量液体在660nm处的吸光度。制备测试样品前的标准曲线(吸光度相对于蛋白质浓度)，并且通过减去空白溶液(10mmnaoac缓冲液或0.9％盐水和0.05％叠氮化钠)的吸光度来校正吸光度。
在表面上的中性抗生物素蛋白稳定性：sds洗涤
1.制备sds1％洗涤溶液(也可使用2％)(sds浓度测试范围：0.1mm(0.0288g/l)sds，对于人血清白蛋白至>10mm；(2.88g/l)sds对于sod和链霉抗生物素蛋白)
a.将1gsds在100mldh2o中混合
2.通过将膜在sds洗涤溶液中潜水5分钟来洗涤膜表面。
3.用dh2o冲洗表面并使膜干燥
分析：在洗涤步骤之前和洗涤步骤之后对膜进行ftir测量。
洗涤溶液中的蛋白质浓度可用piece660nm蛋白质测定进行分析。离子型洗涤剂相容试剂(idcr#22663)需要sds>0.0125％的浓度。
在表面上的中性抗生物素蛋白稳定性：超声处理
1.将样品放入50ml锥形管中，并且用适当的缓冲液填充管。确保管完全关闭并密封。
2.将锥形管放入充满dh2o的超声波发生器中
3.使样品在超声波发生器中在30khz至200khz之间运行5分钟。
4.从管中取出样品，并且用dh2o洗涤(浸渍5x)
5.在室温下在罩下干燥。
分析：
1.在超声处理之前和超声处理之后对膜进行ftir测量。
2.缓冲液中的蛋白质浓度可用piece660nm蛋白质测定进行分析。
具有附着的抗生物素蛋白/中性抗生物素蛋白的生物素珠与膜的缀合
1.将官能化表面加入100ml1xpbs缓冲液中
a.1xpbs缓冲液：50ml在450mldh2o中的10xpbs。
2.加入0.2ml生物素-聚苯乙烯珠溶液。在使用前使珠溶液涡旋
3.在室温下在罩下温育1小时。
4.用pbs(1x)和大量的dh2o(5x)洗涤。
5.使表面在罩中干燥。
分析：使用ftir和/或sem
抗生物素蛋白/中性抗生物素蛋白在fep膜上的吸附
1.制备10mmnaoac缓冲溶液
a.在容量瓶中，将1.7ml3mnaoac加入498.3mldh2o中
2.制备0.1mg/ml蛋白质溶液。可利用10ml蛋白质溶液/1.5”x2”膜样品
a.在50ml圆柱形一次性使用的管中，加入在40ml10mmnaoac中的0.004g蛋白质(抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白)
3.将膜样品放入表面皿中，并且用10ml0.1mg/ml蛋白质溶液覆盖膜。
4.在室温下温育1分钟
5.用10mmnaoac洗涤样品(浸渍5x)
6.用dh2o洗涤样品(浸渍5x)
7.在室温下在培养皿中干燥
8.在-80℃下的冷冻器中贮存
抗生物素蛋白/中性抗生物素蛋白在fep膜上的化学缀合
**使用氧化的经c处理的fep膜样品用于本实验
1.制备10mmnaoac缓冲溶液
a.在容量瓶中，将1.7ml3mnaoac加入498.3mldh2o中
2.制备0.14mg/mlnhs和0.20mg/mledc溶液
a.在容量瓶中，加入在500ml10mmnaoac中的0.07gnhs
b.在溶液中加入0.1gedc
3.制备0.1mg/ml蛋白质溶液。可利用10ml蛋白质溶液/1.5”x2”膜样品
a.在50ml圆柱形一次性使用的管中，加入在40ml10mmnaoac中的0.004g蛋白质(抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白)
4.将膜加入nhs/edc溶液中，并且在室温下温育10分钟
5.通过将膜在10mmnaoac溶液中浸渍5次来洗涤膜。
6.将膜样品放入表面皿中，并且用10ml0.1mg/ml蛋白质溶液覆盖膜。
7.在室温下温育1小时
8.制备100mm甘氨酸-hcl溶液
a.在容量瓶中，加入在250mldh2o中的2.79g甘氨酸-hcl
9.用甘氨酸-hcl溶液洗涤样品(浸渍5x)
10.用ddh2o(5x)洗涤样品
11.用10mmnaoac洗涤样品(浸渍5x)
12.用dh2o洗涤样品(浸渍5x)
13.在室温下在培养皿中干燥
14.在-80℃下的冷冻器中贮存
经c处理的fep膜的氧化
1.在容量瓶中制备氧化溶液
a.1gkmno4
b.5mlh2so4，98％
c.加入1000mldh2o
2.在烧杯中，将样品浸渍在氧化溶液(100ml/样品，不要在同一烧杯中放置超过2个膜)中
3.在室温下温育2小时。
4.用大量的dh2o冲洗(浸渍5x和喷射)
5.在真空烘箱中在65℃和hg中的-20下使样品干燥过夜。
6.在室温下贮存。避光
实例3
示例性实验程序
实验
在fep膜上的接枝聚合经由等离子体活化，随后为在溶液中的自由基聚合来实现。接枝聚合的方法在下述步骤中描述：(i)清洁膜，(ii)在低压等离子系统中处理膜，(iii)在溶液中聚合，(iv)膜的清洁和(v)表征。
膜的清洁
将膜切割，然后在丙酮中洗涤，用di水冲洗，在空气中干燥并且贮存在铝箔膜内。稍后的清洁过程包括先用肥皂洗涤膜，用水冲洗，然后用丙酮冲洗。在结束时的丙酮帮助从表面干燥过量的水。
等离子体处理
如果膜考虑在两侧中都被活化，则将膜放置在瓶中并且用双面胶带粘附。4”x5”的膜契合瓶的侧面，并且在过程中不使用胶带。仪器使用的条件是：
a.气体：氩mcf1
b.气体流量：如文献中推荐的20sccm(cm3/分钟)
c.时间：10分钟
d.功率：30％(最大100w)
聚合反应：
在活化表面之前30分钟制备溶液，以使用内部氮吹扫在溶液中溶解的氧。条件是：
e.溶剂：di水
f.单体：丙烯酸
g.大气：n2
h.温度：60-70℃
i.时间：加热2-4小时，然后允许在氮下放置过夜。
最终膜的清洁：
将膜从反应器中取出，然后在di水中冲洗，在水中超声浴5分钟，在丙酮中冲洗并且用空气干燥。样品用铝箔覆盖以避免污染。
fep膜现在用来自聚丙烯酸接枝聚合反应的许多羧酸基团进行官能化。
实例4
在paa-fep表面上的蛋白质固定
在本实例中使用两种示例性的蛋白质固定方法，蛋白质缀合和蛋白质吸收。为了使蛋白质化学缀合，利用两步edc/nhs化学来活化paa-fep表面上的羧酸基团。简言之，新鲜制备45mmedc和15mmnhs，并且在0.1m2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)缓冲溶液中混合。接下来，将10ml这种溶液置于100ml表面皿上，并且将fep膜样品(3.5×3.5cm2)的paa处理侧置于液体上，且充分处理15分钟。然后在膜表面上生成胺反应性nhs-酯中间体。然后通过将膜浸入10mldi水中的抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白(nav)溶液(0.1mg/ml)中2小时来实现偶联反应。
通过用10ml在di水溶液中的0.1mg/ml蛋白质处理经paa处理的表面2小时，而不预先通过edc/nhs活化，来制备蛋白质吸收膜样品。制备仅通过edc/nhs活化的膜样品作为阴性对照样品，其仅用di水处理2小时而不使用任何蛋白质。并且仅通过用mes缓冲液处理膜样品15分钟来制备仅缓冲液样品。
所有的膜样品随后通过10mm乙酸钠溶液、100mm甘氨酸-hcl溶液和去离子水冲洗，干燥过夜，并且在进一步分析之前贮存在-20℃冷冻器中。
傅里叶变换红外表征
为了验证paa-fep膜表面上蛋白质的存在，使用衰减全反射傅里叶变换红外(atr-ftir)表征。测试了膜样品(与蛋白质缀合的paa-fep、具有蛋白质吸收的paa-fep、仅通过edc/nhs处理的paa-fep和未经处理的paa-fep)。atr-ftir表征设置参数是：分辨率＝4，扫描次数＝512，以及波数范围：4000-1400cm-1(图25)。
用生物胞素荧光团表征抗生物素蛋白/中性抗生物素蛋白
因为生物素分子可以高亲和力和选择性结合抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白蛋白质，所以与生物素缀合的荧光团能够检测蛋白质的存在。这里使用生物胞素四甲基罗丹明(b-tmr，激发波长＝554nm，发射波长＝581nm)来染色稳定固定的蛋白质。首先，将每个膜样品(1×1cm2)放置在24孔板的孔上，其中经处理的一侧朝上，并且加入2mg/ml牛血清白蛋白溶液，以使在膜上的所有非特异性结合位点封闭15分钟。通过该步骤去除未通过edc/nhs反应与paa-fep表面连接的任何抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白。在通过1mlpbs洗涤5次后，样品通过溶解于pbs中的1μmb-tmr溶液避光染色30分钟。然后去除荧光团溶液，并且通过去离子水洗涤样品且干燥过夜。然后用立体显微镜荧光适体(emsciences,hatfield,pa)与青色蓝色滤光片(激发：490-515nm，发射：550nm，长通)来观察样品。
加上荧光团标签的与paa-fep表面化学附着的抗生物素蛋白的图像，paa-fep表面与充当内部对照的不被paa官能化的fep段相邻。(图26)
实例5
在paa-fep表面上的dna固定
适体dna溶液的制备
冻干的适体dna寡核苷酸(3'末端胺改性的，5'-适体-胺-3')及其fitc荧光团缀合形式购自basepairbiotechnologies(47-g06,oligo#603,pearland,tx,usa)。所有冻干的适体在使用前都避光在-20℃下贮存。为了将适体重悬浮于溶液中，将适体团块在微型离心机中离心5分钟，以确保所有团块都在管的底部上。然后将团块溶解在无核酸酶的水中以获得100μm浓度，随后为30分钟温育。接下来，获取50μl该适体溶液的等分试样用于进一步稀释，而将溶液的剩余部分贮存在-20℃下用于长期贮存。将等分试样在折叠缓冲液(在1x磷酸盐缓冲盐水，无核酸酶，ph7.4中的1mmmgcl2)中以50nm稀释至其工作浓度。以工作浓度的适体通过在85-95℃下的水浴折叠5分钟，随后为在室温下的冷却。一旦适体折叠，就不需要更多的折叠步骤。
将以工作浓度的溶液折叠的适体分成10个等分试样，并且贮存在-20℃下用于长期贮存。为了避免重复的冻融循环，适体溶液一旦解冻就保持在4℃下。在4℃下溶解于无核酸酶的水中时，寡核苷酸被建议在4周内用完(www.atbio.com/content/52/storage-of-oligonucleotides)。
用于dna寡核苷酸的傅里叶红外变换(ftir)表征
为了验证ftir光谱中dna寡核苷酸的特征峰，将1ml500pmdna溶液浸渍到ir聚乙烯(pe)标准膜上，然后在空气中干燥过夜。通过atr模式(扫描次数512，分辨率4cm-1)测试ftir光谱。首先收集未经处理的pe标准作为光谱背景，然后表征固定有dna的pe膜。光谱是自动基线校正和常规尺度调整的。
dna在聚(丙烯酸)氟化聚乙烯丙烯(paa-fep)上的共价固定
胺改性的适体dna寡核苷酸通过edc/nhs化学与paa-fep化学缀合。程序与蛋白质缀合实验相似，期望使用偶联缓冲液。首先，将以其工作浓度的折叠适体缓冲液在偶联缓冲液(100mm磷酸钠，150mm氯化钠，无核酸酶，ph7.2)中稀释。paa-fep的表面羧酸基团通过在0.1m无核酸酶的mes缓冲液中的2mmedc(在100ml中0.038g)和5mmnhs(在100ml中0.06g)活化15分钟。在去除edc/nhs试剂后，将活化的膜表面与稀释的dna适体溶液反应2小时。对于dna吸收样品，将paa-fep膜样品浸入dna溶液中2小时。加上fitc荧光团标签的dna(5'-fitc-适体-胺-3')寡核苷酸通过相同的方法固定，并且在整个程序中避光。并且阴性对照样品包括在通过edc/nhs活化后仅用偶联缓冲液处理的paa-fep膜(即仅缓冲液处理的膜)，以及仅通过edc/nhs试剂处理的膜(表6)。在反应结束时，随后通过折叠缓冲液和无核酸酶的水冲洗膜样品三次，并且将具有固定dna的样品浸入折叠缓冲溶液中，并且在进一步分析之前贮存在4℃下。
表6用于制备不同膜样品的化学品和缓冲液
paa-fep上的固定dna的傅里叶红外变换(ftir)表征
还使用atr-ftir表征方法来验证膜样品上dna的存在。环境空气首先被校正为背景。如前所述，将每个干燥样品(dna缀合膜、dna吸收膜、仅经edc/nhs处理的膜和仅经缓冲液处理的膜)放置在atr晶体上，并且通过3.2节的相同条件进行测试。光谱是自动基线校正和常规尺度调整的。(图27)。
实例6
表面改性实例
包括抗生物素蛋白蛋白质和适体dna寡核苷酸的生物物质可共价固定在聚(丙烯酸)接枝的氟化聚乙烯丙烯(paa-fep)上。主要改性方法是edc/nhs化学，随后为各种表征方法。这些表面改性程序可用于产生固定适体dna的fep袋。
1.使用两步edc/nhs化学的抗生物素蛋白固定
材料：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc或edac，贮存在-20℃下)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs，贮存在4℃下)、buphmes缓冲盐水包(贮存在室温中)、抗生物素蛋白蛋白质(贮存在4℃下)、甘氨酸-hcl、10mm乙酸钠缓冲液和paa-fep
步骤：
1.将一包mes缓冲盐水包溶解于500mldi水内，以得到0.1mmes缓冲液
2.称重0.43gedc和0.085nhs，并且将它们一起溶解在50mlmes缓冲液中，以得到45mmedc和15mmnhs溶液。避免含有羧酸酯和胺的任何组分
3.切下一片paa-fep膜样品。为了区分paa接枝侧，在未经处理的fep侧附上一小片标记胶带，或简单地将一个角折起
4.吸取edc/nhs溶液，以完全覆盖一片干净的玻璃表面皿。通常，3ml液体可完全覆盖50ml表面皿(对于3*3cm2膜样品)，并且10ml液体可覆盖100ml表面皿(对于5*5cm2膜样品)
5.将膜样品放置在edc/nhs溶液上。确保paa接枝侧可与溶液完全接触
6.将反应进行15分钟
7.用di水快速洗涤经处理的膜表面(任选的)
8.将抗生物素蛋白蛋白质溶解于di水中，以获得0.1mg/ml的蛋白质浓度，并且吸取该溶液以完全覆盖另一块干净的玻璃表面皿
9.将反应进行2小时
10.其他样品组如下制备：
a.抗生物素蛋白吸收样品：仅用抗生物素蛋白溶液处理paa-fep膜2小时
b.仅edc/nhs样品：用edc/nhs溶液处理样品15分钟，然后用不含抗生物素蛋白的di水处理样品
c.仅缓冲液样品：仅用0.1mmes缓冲液处理样品
11.将2.79g甘氨酸-hcl溶解于100mldi水中，以得到100mm甘氨酸-hcl溶液
12.随后通过将所有的膜样品浸渍在烧杯中的洗涤溶液中，用10mm乙酸钠溶液、100mm甘氨酸-hcl和di水洗涤所有的膜样品。使膜样品干燥过夜用于进一步研究。
2.使用生物胞素荧光团的抗生物素蛋白蛋白质表征
材料：5-(和-6)-四甲基罗丹明生物胞素(b-tmr，贮存在-20℃下)、10x磷酸盐缓冲盐水(pbs)、2mg/ml牛血清白蛋白(bsa)、青色蓝色荧光滤光片组、24孔板
步骤：
1.将10xpbs缓冲液稀释10倍
2.将1.7mgb-tmr荧光团团块溶解于2mlpbs中，以得到10mm溶液，然后将该溶液稀释1000倍，以得到10μmb-tmr溶液
3.从每个膜样品切下1*1cm2的片，并且将这些小样品放置在24孔板上的分开孔中，其中经处理的侧朝上
4.用1ml2mg/mlbsa溶液处理膜样品15分钟，以封闭非特异性结合位点。为了确保膜不翻转，在加入和去除液体时，使用小玻璃棒固定一角
5.弃去bsa溶液，并且用pbs缓冲液将膜样品洗涤5次
6.通过pbs缓冲液将10μmb-tmr溶液稀释至以1μm的工作浓度
7.用1μmb-tmr溶液染色样品30分钟
8.通过将样品浸渍在di水中洗涤样品并且将其干燥过夜
9.在立体显微镜荧光灯附件下查看样品时，根据供应商的手册组装滤光片组，并且通过黑色塑料袋覆盖整个显微镜，以免眼睛直接看到光线，并且阻挡环境背景光
10.将样品放置在干净的黑色背景(即小样品容器)上。轻轻倾斜样品以最小化来自激发光的反射，然后调整对焦。
3.适体dna工作溶液的制备
材料：无核酸酶的水、适体dna团块(胺改性的，用或不用fitc)、氯化镁溶液(mgcl2,1m)、无核酸酶的pbs缓冲液、微型离心机、微型离心管、500ml无菌罐
步骤：
1.通过将冷冻干燥的适体dna团块离心5分钟，使其向下旋转至管的底部
2.通过将适体dna团块溶解在无核酸酶的水中来使其重悬浮，以达到100μm(所需溶剂的体积在来自供应商的产品信息中列出)。将该溶液温育30分钟
3.通过将0.1ml1mmgcl2溶液与100ml1x无核酸酶的pbs缓冲液混合来制备折叠缓冲液，然后将缓冲液贮存在500ml无菌罐中
4.将烧杯中的约50ml水加热至95℃
5.为了折叠适体dna，获取100μm适体溶液的等分试样，并且在50ml无菌管中将其稀释至工作浓度(即2μm)。接下来，将适体dna溶液在加热的水中水浴5分钟，然后使溶液在室温下冷却约15分钟
6.通过在无核酸酶的管中等分来分开适体溶液。将未使用的溶液贮存在-20℃下用于长期贮存。一旦溶液解冻，就将其贮存在4℃下，以避免反复冻融循环。fitc-适体溶液应避光制备
4.使用两步edc/nhs化学的适体dna固定
材料：氯化钠和磷酸钠、edc/nhs试剂
步骤：
1.制备偶联缓冲液：在无核酸酶的水中溶解0.87g氯化钠和1.64g磷酸钠，然后将缓冲液贮存在500ml无菌罐中
2.称重0.019gedc和0.03gnhs，并且将它们一起溶解在50mlmes缓冲液中，以得到2mmedc和5mmnhs溶液。避免含有羧酸酯和胺的任何组分
3.切下一片paa-fep膜样品。为了区分paa接枝侧，在未经处理的fep侧附上一小片标记胶带，或简单地将一个角折起
4.吸取edc/nhs溶液，以完全覆盖一片干净的玻璃表面皿。通常，3ml液体可完全覆盖50ml表面皿(对于3*3cm2膜样品)，并且10ml液体可覆盖100ml表面皿(对于5*5cm2膜样品)
5.将膜样品放置在edc/nhs溶液上。确保paa接枝侧可与溶液完全接触
6.将反应进行15分钟
7.用di水快速洗涤经处理的膜表面(任选的)
8.通过偶联缓冲液将适体dna溶液稀释至所需浓度用于固定，并且吸取适体溶液以完全覆盖一片干净的表面皿，然后将经处理的膜表面置于适体溶液上
9.将反应进行2小时
10.其他样品组如下制备：
a.适体dna吸收样品：仅用dna溶液处理paa-fep膜2小时
b.仅edc/nhs样品：用edc/nhs溶液处理样品15分钟，然后用无核酸酶的水处理样品
c.仅缓冲液样品：在进行edc/nhs反应后，用相同量的适体溶液中的折叠缓冲液和偶联缓冲液处理样品(即，如果适体溶液是折叠缓冲液的50％体积比和偶联缓冲液的50％体积比，则这里使用的缓冲液是相同的成分)
11.用无核酸酶的水洗涤所有样品，并且将含dna样品浸入折叠缓冲液中，并且贮存于4℃下。
参考文献
在本说明书中提到的所有出版物都指示本发明所属领域的技术人员的水平。本文的所有出版物都以引用的方式并入，如同每个个别出版物被具体和个别地指示以引用的方式全文并入一样。
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尽管已详细描述了本发明及其优点，但应当理解，在本文中可作出各种变化、取代和改变，而不背离如由所附权利要求限定的本发明的精神和范围。此外，本专利申请的范围不预期限制于说明书中描述的过程、机器、制造、物质组成、手段、方法和步骤的特定实施例。如本领域普通技术人员从本发明的公开内容容易地理解的，可根据本发明利用执行与本文描述的相应实施例基本上相同的功能或实现与本文描述的相应实施例基本上相同的结果的目前存在的或稍后要开发的过程、机器、制造、物质组成、手段、方法或步骤。相应地，所附权利要求预期在其范围内包括这样的过程、机器、制造、物质组成、手段、方法或步骤。
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