准确快速捕获循环肿瘤细胞的方法与流程

本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种准确快速捕获循环肿瘤细胞的方法。

背景技术：

循环肿瘤细胞(ctc)是指从肿瘤上脱落并进入循环系统的癌细胞，ctc非常稀少，每毫升血液中10⁹血细胞只有几个ctc。ctc可以作为癌症的生物标志物，指示肿瘤的发生发展以及转移恶变。大部分癌症相关死亡由转移引起，转移过程中肿瘤细胞脱离原发灶，通过血流到达新的组织，并在一定条件下发展为转移灶。循环肿瘤细胞(ctc)早在140多年前就被发现，但由于其含量非常少以及分离检测方法的局限，直到近年才日益受到广泛关注。大部分ctcs在伴随外周循环的过程中发生凋亡，或直接被血细胞吞噬，只有少数能逃逸并发展成为转移灶(cancerres2003；63:3805)。这提示着我们：分离、鉴定和研究最具转移潜能的ctc是关键。

ctc具有特定的标志物，利用针对这些标志物的抗体可以标记、分离或检测。现有大多是将标志物抗体偶联在磁珠或其他固体介质上进行ctc捕获，其难点在于ctc数量非常低，难以进行分离提取。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明的目的是提供一种简单可行的准确快速捕获循环肿瘤细胞的方法。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种准确快速捕获循环肿瘤细胞的方法，筛选出两个高亲合力抗体，两个所述抗体同时结合到ctc标志物两个临近的抗原表位上，分别偶联单链核苷酸；

所述两个抗体结合完成后，加入第三个单链核苷酸，所述第三个单链核苷酸与一个抗体上偶联的单链核苷酸的3’端及另一个抗体上偶联的单链核苷酸的5’端互补，通过退火和连接，两个抗体上的核苷酸连接成一条完整的核苷酸链，与荧光探针进行杂交，利用流式分选仪对标有荧光探针的ctc进行捕获。

作为优选，两个所述抗体分别偶联单链核苷酸时，核苷酸序列在人基因组中不存在。

作为优选，所述退火和连接的条件为37℃的条件下温浴1小时。

作为优选，所述杂交是将荧光探针稀释至100nm，在稀释后的反应溶液中加入鲑鱼精dna减少非特异结合，将该溶液加入细胞中，混合均匀后置于37℃温浴1小时。

作为优选，两个所述抗体分别为ec1和ac2。

本发明具有以下有益效果：

利用邻位连接技术，通过用两个抗体同时结合一个标志物，可以有效的捕获到目的ctc，同时基于邻位连接技术，两个抗体上的ssdna高效地连成了一条完整的dna分子，并被荧光探针分子识别。流式分析仪筛选计数标本，筛选到的ctc细胞的特异性可达到99％。

附图说明

图1为用于捕获目的ctc的双标抗体的表达和纯化；

图2为蛋白免疫共沉淀实验证明特异性的双标抗体可以与ctc表面的抗原蛋白分子特异性结合；

图3为双标抗体在分别混有1个ctc，10个ctc和100个ctc的10ml血液中，可以有效捕获目的ctc；

图4为被双标抗体捕获后的ctc，同时分子交联在双标抗体分子上的ssdna，退火后连接成为一条完整的dna链可以被荧光探针识别，并通过荧光显微镜检测到。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

一种准确快速捕获循环肿瘤细胞的方法，筛选出两个高亲合力抗体，两个所述抗体同时结合到ctc标志物两个临近的抗原表位上，分别偶联单链核苷酸。

如图1所示，利用大肠杆菌表达目标抗体，破壁，再利用镍柱亲和纯化目标蛋白，采用咪唑洗脱，得到纯化的目标蛋白，用于后续的捕获实验。通过上述的纯化手段用于后续检测实验的抗体的纯化，以使实验结果准确。

如图2所示，通过蛋白免疫共沉淀实验证明，特异性的双标抗体可以与ctc表面的抗原蛋白分子特异性结合。图2中，抗体1为ec1，抗体2为ac2，均是可识别epcam的蛋白；对照抗体是h10，不能喝目标蛋白epcam结合。

两个抗体结合完成后，加入第三个单链核苷酸，所述第三个单链核苷酸与一个抗体上偶联的单链核苷酸的3’端及另一个抗体上偶联的单链核苷酸的5’端互补，通过退火和连接，两个抗体上的核苷酸连接成一条完整的核苷酸链，与荧光探针进行杂交，利用流式分选仪对标有荧光探针的ctc进行捕获。

其中，两个所述抗体分别偶联单链核苷酸时，核苷酸序列在人基因组中不存在。

退火和连接的条件为37℃的条件下温浴1小时。

如图3所示，双标抗体在分别混有1个ctc，10个ctc和100个ctc的10ml血液中，可以有效捕获目的ctc。同时分子交联在双标抗体分子上的ssdna，退火后连接成为一条完整的dna链，被realtimepcr实验检出。

如图4所示，被双标抗体捕获后的ctc，同时分子交联在双标抗体分子上的ssdna，退火后连接成为一条完整的dna链可以被荧光探针识别，并通过荧光显微镜检测到。

杂交是将荧光探针用浓度为1mg/ml的bsa稀释至100nm，在稀释后的反应溶液中加入浓度为300ng/ml的鲑鱼精dna减少非特异结合，将该溶液加入细胞中，混合均匀后置于37℃温浴1小时。

杂交体系为：1mg/mlbsa；300ng/mlsalmonspermdna；1×ssc；0.05％tween20；100nm荧光探针；dh2o。其中，bsa用于封闭细胞中蛋白质的非特异结合，降低杂交背景；salmonspermdna(鲑鱼精dna)用于封闭细胞中dna的非特异结合位点，降低杂交背景、提高杂交特异性。1xssc：dna杂交缓冲液；tween20(吐温20)，非离子型表面活性剂，减少探针的非特异性结合。荧光探针：和靶序列互补的dna片段，带有荧光信号，用于检测。

以上结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

技术特征：

技术总结
本发明公开了一种准确快速捕获循环肿瘤细胞的方法，筛选出两个高亲合力抗体，两个所述抗体同时结合到CTC标志物两个临近的抗原表位上，分别偶联单链核苷酸；所述两个抗体结合完成后，加入第三个单链核苷酸，所述第三个单链核苷酸与一个抗体上偶联的单链核苷酸的3’端及另一个抗体上偶联的单链核苷酸的5’端互补，通过退火和连接，两个抗体上的核苷酸连接成一条完整的核苷酸链，与荧光探针进行杂交，利用流式分选仪对标有荧光探针的CTC进行捕获。本发明的优点是：能准确快速地捕获循环肿瘤细胞。

技术研发人员：薛峰
受保护的技术使用者：云南赫斯提雅生物科技有限公司
技术研发日：2017.04.01
技术公布日：2017.08.18