本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种以胎盘为来源的造血干细胞提取及冻存方法。
背景技术：
造血干细胞，是从卵黄囊全能间叶细胞分化而来的最原始的造血细胞，是体内所有血细胞的前体，是一类具有自我更新能力并能分化为各种血细胞前体细胞，最终生成包括红细胞、白细胞和血小板在内的各种血细胞，同时也可以分化成其他细胞。因此，其广泛应用于治疗恶性血液病、重型再生障碍性贫血、某些实体瘤、某些异常免疫病、某些遗传病、代谢病和极重度骨髓型急性放射病。同时，造血干细胞移植也是为癌症患者重建正常的造血和免疫功能的有效手段。
据研究表明胎盘组织中造血干细胞的含量是脐带血中造血干细胞含量的8-10倍，造血干细胞的数量大，且胎盘作为分娩后的废弃物，不需要侵入性过程来获取，且其造血干细胞的含量和增殖能力也具有明显优势，因此，以胎盘为来源进行造血干细胞移提取的方法能有效解决骨髓或动员后外周血来源不足，脐带血中造血干细胞数量不够成人使用等技术难题。
然而，目前以胎盘为来源的造血干细胞分离提取方法主要为机械酶解法和传统灌洗法两种。机械酶解法虽然能获取数量较多的细胞，但其中的造血干细胞含量较低，同时很难避免胎盘中母源性细胞的干扰。传统灌洗法整个提取过程操作繁复、耗时长、成本高，提取出来的细胞活率相对较低。胎盘造血干细胞的冻存多为非程控降温保存为主，该方法具有细胞存活率低、操作过程复杂、干细胞安全难以保证等缺点。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
技术实现要素：
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种以胎盘为来源的造血干细胞提取及冻存方法，旨在解决现有的造血干细胞提取方法中造血干细胞含量较低，提取过程操作繁琐，且冻存过程中操作复杂、干细胞存活率低等问题。
本发明的技术方案如下：
一种以胎盘为来源的造血干细胞提取方法，其中，包括：
步骤a、对采集到的胎盘及母血进行清洗和检测；
步骤b、用灌洗液对检测合格的胎盘分多次进行灌洗得到含造血干细胞的灌洗液；
步骤c、对提取到的含造血干细胞的灌洗液进行浓缩纯化，得到造血干细胞群。
所述的以胎盘为来源的造血干细胞提取方法，其中，步骤a具体包括：
a1、先用75%酒精喷洒胎盘外表面1～5min，再用组织保护液清洗胎盘外表面的残留血液和血凝块，得到胎盘和母血样本；
a2、对胎盘和母血样本进行健康指标检测。
所述的以胎盘为来源的造血干细胞提取方法，其中，步骤b具体包括：
b1、将注入软管头插入胎盘脐动脉中，并将回收软管头插入脐静脉中，再用止血钳夹紧；
b2、将灌洗液通过注入软管头注入胎盘，然后通过回收软管头来回收，得到含造血干细胞的灌洗液；
b3、重复上述步骤b2，并将获得的含造血干细胞的灌洗液混合。
所述的以胎盘为来源的造血干细胞提取方法，其中，所述步骤b中，分三次进行灌洗，其中，
第一次灌洗过程的灌洗液为：含有5～10%fbs、0.1～0.5mg/ml肝素钠、0.01～0.1mg/ml酚妥拉明、0.01～0.1mg/ml氯丙嗪的dmem/f12（基础培养基）灌洗液；
第二次灌洗过程的灌洗液为：含有5～10%fbs（胎牛血清）、0.1～0.5mg/ml肝素钠、0.005～0.1mg/mlamd3100（趋化因子受体拮抗剂）、0.005～0.1mg/mlg-csf（粒细胞集落刺激因子）的dmem/f12灌洗液；
第三次灌洗过程的灌洗液为：含有0.1～0.5mg/ml肝素钠、0.01～0.05mg/ml胶原酶ⅷ、0.01-0.03mg/ml胰酶的生理盐水灌洗液。
所述的以胎盘为来源的造血干细胞提取方法，其中，
第一次灌洗过程的条件为：以每秒钟3滴灌洗液的速度灌洗2小时，灌洗1000ml灌洗液；
第二次灌洗过程的条件为：以每秒钟3滴灌洗液的速度灌洗3小时，灌洗1500ml灌洗液；
第三次灌洗过程的条件为：以每秒钟3滴灌洗液的速度持续灌洗，至脐静脉流出来的液体为粉红色酶解液时，结扎动静脉，然后置于室温酶解1h，之后解开动静脉继续灌洗1000ml灌洗液。
所述的以胎盘为来源的造血干细胞提取方法，其中，步骤c具体包括：
c1、对含造血干细胞的灌洗液进行离心、分离处理，获得白细胞层；
c2、对所述白细胞层进行多次离心，获得造血干细胞群；
c3、用dmem/12对所述的造血干细胞群进行重悬，并对其进行计数和检测。
所述的以胎盘为来源的造血干细胞提取方法，其中，所述步骤c之后还包括：
d、采用程序控温法对造血干细胞群进行冻存。
所述的以胎盘为来源的造血干细胞提取方法，其中，所述步骤d中，在冻存前对造血干细胞群进行预处理，预处理过程包括：
第一预处理步骤，使用dmem/f12（基础培养基）将造血干细胞群沉淀重悬至20ml，并将重悬得到的造血干细胞群重悬液用注射器吸取并缓慢注入至冻存袋内，将冻存袋用冰袋冰浴至4℃；
第二预处理步骤，向所述冻存袋内缓慢加入5mlcryosuredex40（细胞冻存混合液），在摇晃冻存袋的同时排出冻存袋和管道内的空气并封口。
所述的以胎盘为来源的造血干细胞提取方法，其中，所述程序控温过程具体为：
第一控温阶段，先于4℃平衡30min，然后以1℃/min的速度降至-6℃，再以25℃/min的速度降至-50℃；
第二控温阶段，以10℃/min的速度升温至-14℃；
第三控温阶段，以1℃/min的速度降至-45℃，接着以10℃/min的速度降至-90℃，最后于-196℃长期保存。
所述的以胎盘为来源的造血干细胞提取方法，其中，上述造血干细胞群置于-196℃的液氮中进行保存。
有益效果：本发明提供了一种以胎盘为来源的造血干细胞提取及冻存方法，造血干细胞提取过程采用的灌洗方法设备简单，操作方便，且封闭的灌洗系统能够有效避免空气中细菌的感染，该灌洗方法提取造血干细胞的回收率非常高，有效避免了资源浪费。
附图说明
图1为本发明以胎盘为来源的造血干细胞提取及冻存方法中胎盘造血干细胞流式检测结果图，其中a为圈选cd45的阳性细胞细胞群（p1门）；b为从p1门中圈选得到的cd45阳性细胞中圈选cd34+细胞群（r3门）；c为r3门圈选的细胞群体为cd45+细胞；d引用自a中p5门；e为所有事件。f引用自c中e4门复制d中圈选的e6门。
具体实施方式
本发明提供一种以胎盘为来源的造血干细胞提取及冻存方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供一种以胎盘为来源的造血干细胞提取方法实施例，其中，包括：
步骤a、对采集到的胎盘及母血进行清洗和检测；
步骤b、用灌洗液对检测合格的胎盘分多次进行灌洗得到含造血干细胞的灌洗液；
步骤c、对提取到的含造血干细胞的灌洗液进行浓缩纯化，得到造血干细胞群。
在本实施例中，首先将采集到的胎盘及母血进行清洗和检测，确保提取到干净、健康的造血干细胞。之后对检测合格的胎盘分多次进行灌洗，能够得到较传统的灌洗方法更多的造血干细胞。最后将得到的含造血干细胞的灌洗液进行浓缩纯化，得到造血干细胞。该方法能够有效提高回收到的造血干细胞的数量，并确保所回收的造血干细胞健康、安全，便于进一步对造血干细胞的保存和应用。
在所述步骤a中，具体包括步骤：
a1、先用75%酒精喷洒胎盘外表面1～5min，再用组织保护液清洗胎盘外表面的残留血液和血凝块，得到胎盘和母血样本；
a2、对所述胎盘和母血样本进行健康指标检测。
在步骤a1前还需要对捐献胎盘的母体进行检测，确定其无相关微生物感染后，在无菌环境下采集胎盘及母血，存放于胎盘组织采集套装内的无菌采样袋中，并浸泡在无菌采样袋内的组织保护液中，贴好标签，维持温度在4-22℃，12h内送达实验室进行处理。对母体进行检测能够确保胎盘的来源是健康的，从源头上避免了被感染的胎盘及母血被使用，提高了所取得的造血干细胞的安全性和可靠性，当然，也可选择不进行母体检测。同时，对采集到的胎盘和母血在适当的温度和理化环境下保存，不仅能使胎盘和母血保持活性，而且能够避免胎盘和母血因被感染而无法使用。
在所述步骤a1中，在无菌超净台上，将上述保存在胎盘组织采集套装内的胎盘取出，并取1～2ml胎盘采集液做无菌检测，确定胎盘未被细菌感染后，取75%酒精喷洒胎盘组织的外表面1～5min进行消毒（优选2min），之后迅速用组织保护液清洗组织外表面残留的血液和血凝块，钝性分离羊膜及绒毛膜，必要时用剪刀剪去羊膜及绒毛膜。对胎盘进行上述预处理过程能够确保获得的胎盘是未被感染的健康胎盘，可以作为可靠的造血干细胞来源；同时，对其表面进行清理，便于后续灌洗过程顺利进行。
在所述步骤a2中，对胎盘和母血样本进行健康指标检测。所述检测指标包括，谷丙转氨酶（alt）、谷草转氨酶（ast）；疱疹病毒（eb）；巨细胞病毒（cmv）；艾滋病毒（hiv）；梅毒螺旋体（tp）；乙肝病毒（hbv）；丙肝病毒（hcv）；嗜t细胞病毒（htlv）、细菌、真菌、组织配型（hla）检测，造血干/祖细胞定性检测（cfu-gm）。对胎盘和母血进行上述全面的健康指标检测，确保胎盘中提取的造血干细胞未被上述细菌和病毒感染，也就是确保造血干细胞移植到受体中后，能够分化发育成健康的组织和器官，在帮助受体摆脱原有疾病的困扰同时，避免二次感染的发生。
所述步骤b具体包括：
b1、将注入软管头插入胎盘脐动脉中，并将回收软管头插入脐静脉中，再用止血钳夹紧；
b2、将灌洗液通过注入软管头注入胎盘，然后通过回收软管头来回收，得到含造血干细胞的灌洗液；
b3、重复上述步骤b2，并将获得的含造血干细胞的灌洗液混合。
在步骤b1之前，需用剪刀与脐带呈45度的斜角剪切脐带，分离脐带和胎盘，形成血管的吻合口。用组织保护液清洗该开口，确保能够看清脐带内的两条动脉和一条静脉，取2条6fr的一次性无菌导尿管，用无菌剪刀将导尿管头部斜切45度，旋转导尿管向动脉口插入，如果难以插入动脉可将动脉剪切一个小口，旋转导尿管向动脉插入至下口到达止血钳固定处。取1条10fr的一次性无菌导尿管，用无菌剪刀将导尿管头部斜切45度，旋转导尿管往静脉口伸入，并用止血钳加紧固定。该过程建立了胎盘中的动脉与灌洗系统的连接，方便后续过程通过灌洗系统获得造血干细胞群。
造血干细胞群的提取过程中，首先需要将注入软管头插入胎盘脐动脉中，并将回收软管头插入脐静脉中，再用止血钳夹紧；之后，将灌洗液通过恒流泵，灌洗液经胶管、开关、蠕动泵、胎盘动脉、胎盘、胎盘静脉、胎盘灌注回收瓶针头、注入软管头注入胎盘，然后通过回收软管头来回收，得到含造血干细胞的灌洗液；重复上述灌洗过程三次，得到含有造血干细胞的灌洗液，最后，将三次灌洗过程得到的含有造血干细胞的灌洗液混合。该系统能够通过灌洗液的注入将造血干细胞从胎盘中的脐动脉中带出，得到含有造血干细胞的灌洗液，便于后续对造血干细胞群的提取。
三次灌洗过程使用的灌洗液不同，第一次灌洗过程的灌洗液为：含有5～10%fbs、0.1～0.5mg/ml肝素钠、0.01～0.1mg/ml酚妥拉明、0.01～0.1mg/ml氯丙嗪的基础培养基灌洗液；第二次灌洗过程的灌洗液为：含有5～10%胎牛血清、0.1～0.5mg/ml肝素钠、0.005～0.1mg/ml趋化因子受体拮抗剂、0.005～0.1mg/ml粒细胞集落刺激因子的基础培养基灌洗液；第三次灌洗过程的灌洗液为：含有0.1～0.5mg/ml肝素钠、0.01～0.05mg/ml胶原酶ⅷ、0.01-0.03mg/ml胰酶的生理盐水灌洗液。随着灌洗过程的进行，胎盘中的造血干细胞浓度逐渐变小，将其灌洗出来的难度逐渐增大。为了在灌洗过程中获得更多的造血干细胞，针对动脉中不同的造血干细胞浓度和理化环境，配置含有不同组分的灌洗液，便于获得更多的造血干细胞。
三次灌洗过程中，灌洗液的用量及灌洗方式不同，第一次灌洗过程的条件为：以每秒钟3滴灌洗液的速度灌洗2小时，灌洗1000ml灌洗液；
第二次灌洗过程的条件为：以每秒钟3滴灌洗液的速度灌洗3小时，灌洗1500ml灌洗液；第三次灌洗过程的条件为：以每秒钟3滴灌洗液的速度持续灌洗，至脐静脉流出来的液体为粉红色酶解液时，结扎动静脉，然后置于室温酶解1h，之后解开动静脉继续灌洗1000ml灌洗液。这是因为，当进行第二次灌洗时，胎盘中的造血干细胞数量较第一次灌洗过程已经明显减少，因此采用1500ml的灌洗液，即为第一次灌洗过程1.5倍用量的灌洗液进行灌洗操作，以获得更多的造血干细胞。而第三次灌洗时，胎盘中的造血干细胞数量更少，因此在灌洗液中加入0.01～0.05mg/ml胶原酶ⅷ、0.01-0.03mg/ml胰酶，且在脐静脉流出来的液体为粉红色酶解液时，结扎动静脉，然后置于室温酶解1h。即通过酶解作用，获得上述两次灌洗过程无法提取到的，需要酶解作用才能获得的造血干细胞，使得三次灌洗获得的造血干细胞总量更多。
上述步骤c具体包括：
c1、对含造血干细胞的灌洗液进行离心、分离处理，获得白细胞层；
c2、对所述白细胞层进行多次离心，获得造血干细胞群；
c3、用基础培养基对所述的造血干细胞群进行重悬，并对其进行计数和检测。
首先，将上述三次灌洗过程得到的灌洗液混匀，以1800rpm的转速离心10min，离心后去上清，用组织保护液重悬细胞，按体积比4:1向上述重悬细胞中加入羟乙基淀粉，混匀后室温静置60min。用移液管吸取上层澄清的白细胞层，用以获得细胞沉淀；另外，收集下层的红细胞层于离心管中，用于后续检测。
之后，将上述白细胞层置于离心管中，以1300rpm的转速离心5min，弃去上清液，得到细胞沉淀，并按细胞沉淀与红细胞裂解液体积比为1:8的比例，向细胞沉淀中加入红细胞裂解液对细胞沉淀进行重悬，涡旋振荡5s，室温下裂解残留的红细胞10min后，以1300rpm的转速离心5min，去上清液，所得的细胞即为造血干细胞群。
最后，用基础培养基重悬上述细胞沉淀至20ml，然后向2个1.5mlep管中分别加入200ul上述重悬后的细胞沉淀，用于细胞计数和活性检测，且细胞活性进行检测使用台盼蓝染色法，死亡细胞会被染成淡蓝色。此外，还需进行有核红细胞计数、细胞dna样本留样、造血集落形成试验和cd34流式检测等。
cd34流式检测：向5个1.5mlep管中分别加入100ul上述重悬细胞沉淀，且向第一管中加入10ul生理盐水，向第二管中加入10ulpe-cd34抗体，向第三管中加入10ulfitc-cd45抗体，向第四管中加入10ulpe-cd34抗体和10ulfitc-cd45抗体，向第五管中加入10ulcd34抗体和10ulfitc-igg抗体，将三管分别混匀后放置在黑暗处孵育15分钟，然后用流式细胞仪检测cd34+细胞含量，进而确定造血干细胞的含量，检测结果如图1所示，其中，a为圈选cd45的阳性细胞细胞群（p1门）；b为从p1门中圈选得到的cd45阳性细胞中圈选cd34+细胞群（r3门）；c为r3门圈选的细胞群体为cd45+细胞；d引用自a中p5门，根据细胞大小和细胞复杂程度，圈选聚集的淋巴细胞群，去除碎片及其他细胞的干扰；e为所有事件，根据pe和fitc同型对照确定cd34和cd45阴性和阳性的信号值，分别统计其阴性和阳性的比例。f引用自c中e4门复制d中圈选的e6门，用于统计cd45+cd34+细胞即造血干细胞占所有有核细胞的比例，且在本实施例中造血干细胞占所有有核细胞的比例为1.27%。
对上述检测合格的造血干细胞进行冻存，在冻存之前，需要对造血干细胞群进行预处理，预处理过程具体包括：第一预处理步骤，使用基础培养基将造血干细胞群沉淀重悬至20ml，并将重悬得到的造血干细胞群重悬液用注射器吸取并缓慢注入至冻存袋内，将冻存袋用冰袋冰浴至4℃；第二预处理步骤，向所述冻存袋内缓慢加入5ml细胞冻存混合液，在摇晃冻存袋的同时排出冻存袋和管道内的空气并封口。对造血干细胞进行预处理过程，有利于造血干细胞保持活性，排出空气则能够避免空气中的细菌对造血干细胞的污染，延长冻存造血干细胞的保质期。
预处理后，采用程序控温的方法对造血干细胞进行冻存，所述程序控温过程具体为：第一控温阶段，先于4℃平衡30min，然后以1℃/min的速度降至-6℃，再以25℃/min的速度降至-50℃；第二控温阶段，以10℃/min的速度升温至-14℃；第三控温阶段，以1℃/min的速度降至-45℃，接着以10℃/min的速度降至-90℃，最后于-196℃长期保存。且所述造血干细胞群置于-196℃的液氮中进行保存。上述造血干细胞的冻存过程采用程序控温，并根据造血干细胞冻存过程中的升温及降温的规律设定相应的冻存速率，能最大限度的保护造血干细胞，使其不受温度变化带来的损伤，并最终将其置于-196℃的液氮中进行保存，有利于保持造干细胞的生物活性，便于其取出后发挥相应的作用。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。