具有抗菌效应的聚羟基脂肪酸酯生物塑料的制作方法

本发明涉及生物可降解材料领域，更具体地说，涉及具有抗菌效应的聚羟基脂肪酸酯生物塑料。

背景技术：

随着石油资源的不断消耗和石化产品尤其是不可降解的传统塑料所造成的白色污染日益严重，可天然降解的绿色生物塑料正在受到越来越多的关注^[1]。不同于生产过程仍需化工缩聚反应的聚乳酸(polylacticacid，pla)，聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates，phas)作为一种新型的可降解生物塑料，可以通过可再生的生物质原料进行全程的发酵生产，其环境污染指数低，更为环保^[2,3]。更为重要的是，pha种类繁多(仅其单体就超过150种)，化学性质和材料性能差异极大，在不同的环境中均表现出很高的生物可降解性，其潜在的应用前景因此更为广泛^[4]。特别是在医疗和食品领域，聚(3-羟基丁酸-3-羟基己酸酯)[poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate),phbhhx]和聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)[poly(3-hydroxybutyricacid-co-4-hydroxybutyricacid),p(3hb-co-4hb)]这两种pha因其极强的生物相容性和人体可植入性展现出极大的应用潜力，可用做手术缝合线、骨钉、人造骨骼、食品包装等，其相关研究亟需跟进展开^[5,6]。

乳酸链球菌素(nisin)是由乳酸乳球菌(lactococcuslactissubsp.lactis)产生的一种阳离子多肽，可以有效的抑制多种引起食品腐败和医学感染的革兰氏阳性菌^[7]，对沙门氏菌(salmonella)等部分革兰氏阴性菌同样有抑制效果^[8]。nisin可被人体肠道分泌的α-胰凝乳蛋白酶有效降解，因此对人体安全无毒，是目前唯一大规模商业化应用的高效天然防腐剂^[7]，被广泛应用于欧盟、中国、美国等多个国家和地区的食品行业中^[9,10]。特别值得注意的是，除了作为食品防腐剂之外nisin亦可被应用到多种材料中以达到抗菌效果。x.qi等^[11]利用peg1000将nisin稳固结合到碳纳米管上，从而使碳纳米管具备了一定的抗菌活性。t.jin等^[12]则将nisin整合入聚乳酸(pla)以生产具有抗菌效应的食品包装袋。进一步研究表明，在带有nisin-pla涂层的牛奶灌装瓶中，李斯特菌(listeriamonocytogenes)的生长被显著抑制，并且抑制效果在4℃保存条件下可维持70天^[13]。

技术实现要素：

本发明一方面提供了具有抗菌效应的聚羟基脂肪酸酯，其中包含作为抗菌剂的乳酸链球菌素。

在本发明的优选实施方案中，所述乳酸链球菌素的浓度为不低于25μg/g；例如，不低于100μg/g。

在本发明的实施方案中，所述聚羟基脂肪酸酯可以选自由phbhhx、phb、phbv和p3hb4hb构成的组。优选地，所述聚羟基脂肪酸酯为phbhhx。

所述抗菌聚羟基脂肪酸酯可以被制成薄膜。

本发明还提供了所述聚羟基脂肪酸酯在制备具有抗菌效应的产品中的应用。例如，所述聚羟基脂肪酸酯可以被制成食品包装、食品容器、厨具、医疗器械、家装建材、家用电器或配件、健康护理产品以及可穿戴设备等。

本发明还提供了抑制微生物生长的方法，包括将所述聚羟基脂肪酸酯与所述微生物进行接触。例如，所述微生物可以为食品中的微生物。

附图说明

图1显示了琼脂扩散法测量的含有乳酸链球菌素的phbhhx膜片的抑菌效应。(a)含有不同浓度nisin的phbhhx薄膜抑制micrococcusluteus(ncib8166)的生长，其中nisin浓度分别为0,25,100,400,1600和6400μg/g。(b)含有不同浓度nisin的phbhhx薄膜的抑制效应(0,0.25和2.5μg/g)。薄膜直径为6mm。

图2显示了phbhhx膜片抗菌效应对nisin含量的依赖关系。nisin浓度分别为0.25,2.5,25,100,400,1600和6400μg/g。误差棒(errorbar)表示6个测试平均值的标准差(standarddeviation)。其中，纵坐标为抑制区直径(cm)。

图3显示了激光共聚焦显微镜层扫观察到的nisin颗粒在phbhhx膜片内部的物理分布。(a)25μg/gnisin；(b)100μg/gnisin.

图4显示了液体培养条件下phbhhx-nisin膜片的抗菌活性随时间的变化。误差棒表示三个测试平均值的标准差。其中，横坐标为时间(h)，纵坐标为活细胞(cfu/ml)，control表示对照。

图5显示了激光共聚焦显微镜下nacl颗粒在phbhhx薄膜内的物理分布。(a)nacl/phbhhx的浓度为0.975mg/g，深色颗粒为nacl颗粒,大小范围是10-40μm。(b)不添加盐的phbhhx空白膜片。

图6显示了琼脂扩散法测量nisin与phb，phbv，p3hb4hb分别混合的薄膜抑菌效应。a代表nisin与phb混合的抑菌效果，所用的nisin浓度为100，25，0.25μg/g(每克pha材料中含有nisin的量)；b代表代表nisin与phbv混合的抑菌效果，所用的nisin浓度为100，25，0.25μg/g；c代表nisin与p3hb4hb混合的抑菌效果，所用的nisin浓度为100，25，0.25μg/g。

具体实施方式

本文所用的术语“聚羟基脂肪酸酯”(polyhydroxyalkanoates,简称pha或phas)，是一系列广泛存在于许多微生物细胞中的天然高分子，种类繁多。pha具 有良好的生物相容性和生物可降解性，同时在加工性能和机械性能方面更具优势。本发明的聚羟基脂肪酸酯，其结构如式(i)所示。

其中，中括号内为结构单元，各结构单元可以相同或不同；n表示结构单元的总数；各结构单元的m独立地选自1～3的整数；各结构单元的r1独立地选自由h、c1-c9的烷基构成的组。

本发明的聚羟基脂肪酸酯既包括聚羟基丁酸酯(poly(hydroxybutyrate)，简称phb)，聚羟基戊酸酯(poly(hydroxyvalerate)，简称phv)，聚羟基辛酸酯(poly(hydroxyoctanoate)，简称pho)等pha类均聚物，也包括羟基丁酸戊酸共聚物(poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate)，简称phbv)，3-羟基丁酸-3-羟基己酸共聚物(poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate)，简称phbhhx)，3-羟基丁酸-4-羟基丁酸共聚物(poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate)，简称p3hb4hb)等pha共聚物以及几种pha形成的混合物。

本发明所采用的聚羟基脂肪酸酯(pha)的重均分子量没有特别限制，优选范围在50,000-2,000,000之间。本领域技术人员可以根据聚合物的种类、所需要的力学性能等因素确定合适的分子量。

本发明所使用的具体的聚羟基脂肪酸酯材料包括phbhhx、phb、phbv和p3hb4hb等。

本文所用的术语“烷基”是指带有给定数量的碳原子的支链和直链的饱和脂族烃基。例如，“c1-c9的烷基”定义为直链或支链的带有1、2、3、4、5、6、7、8或9个碳的饱和脂族烃基基团。例如，“c1-c9的烷基”特别包括甲基、乙基、正-丙基、异-丙基、正-丁基、异-丁基、叔-丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基等。

本文所用的术语“有效量”指的是足以引起技术人员所寻找的抗菌效果的nisin的量。本发明的生物塑料中nisin的有效量可由本领域技术人员根据材料的应用场合、对抗菌效果的要求等因素而确定。例如，在pha薄膜材料中，nisin的含量可以为不低于10、15或20μg/g。在本发明特别优选的实施方案中，nisin在薄膜材料中的含量可以为不低于25μg/g。本领域技术人员可以理解，为了获得更强或者更持久的抗菌效果(例如在医疗器械领域)，nisin含量可以更高。 例如，在本发明的具体实施方案中，nisin在薄膜材料中的含量可以为不低于100μg/g。

本文所用的术语“抗菌效应”是指抑制微生物生长的能力。此处所述的微生物包括细菌、真菌、放线菌等。术语“抗菌效应”并不局限于对细菌的抑制作用。在食品包装、医疗器械等许多领域，广泛存在对抗菌效应的需要。技术人员可以根据本领域公知的方法和标准确定材料的抗菌效应，例如，琼脂扩散法或液体培养法。例如，“具有抗菌效应”可以指该材料在琼脂扩散法中表现出明显的抑菌圈，或者在液体培养法中表现出超过90％(例如超过95％，特别是超过99％)的微生物抑制率。

本文所用的术语“乳酸链球菌素”和“nisin”可以互换使用，是本领域公知的大规模商业化应用的高效天然防腐剂。

本发明的抗菌pha可以广泛应用于食品包装、食品容器、厨具、医疗器械、家装建材、健康护理、可穿戴设备、家用电器等领域。由于与人体或者食品存在直接或间接的接触，在这些领域存在对抗菌材料的迫切需要。例如，马桶圈、马桶冲水按钮、把手、食品包装袋、饮水机接口、电冰箱内置塑料等产品，由于频繁与人体或食品接触，如果它们具有抗菌效应将是令人期待的。

为了更加详细地解释本发明，下面将给出本发明的实施例。这些实施例仅仅是出于解释和说明的目的，不应该被理解为是对本发明范围的限制。

研究概述

聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates,phas)作为一类新型的生物高分子材料，因其多样的材料性质与高度的生物可降解性日益受到关注。本发明使用乳酸链球菌素(nisin)，一种被公认为安全的天然食品防腐剂，制备了具有高效、持久抗菌效应的pha塑料。首先采用溶剂浇铸的方法将nisin整合到正3-羟基丁酸-3羟基己酸共聚酯(phbhhx),一种具备高度生物相容性的pha中，从而获得了具有抗菌效应的phbhhx薄膜。激光共聚焦显微镜观察表明nisin在phbhhx中呈颗粒状均匀分布。随后以条件致病菌藤黄微球菌(micrococcusluteus)为测试菌株，通过琼脂扩散法，测定nisin含量与phbhhx薄膜抗菌效应的定量关系；在液体培养条件下测量phbhhx薄膜的nisin释放效果与抗菌效应。结果表明nisin可从phbhhx薄膜顺利释放且nisin的含量高于25μg/g时即表现出显著的抑菌效果且可长时间维持。该研究为工业化生产具有抗菌效应的pha奠定了重要的技术基础，拓展了pha在医学和食品领域的应用潜力。

实施例1

在本试验中，我们首先利用溶剂浇铸的方法将nisin整合入pha(phbhhx)，从而获得了具有抗菌效应的phbhhx薄膜；激光共聚焦显微镜的观察表明nisin在phbhhx薄膜内部呈颗粒状均匀分布^[14]；随后的功能实验表明，仅仅25μg/g的nisin浓度就足以使得phbhhx薄膜对于典型条件致病菌—藤黄微球菌(micrococcusluteusncib8166)的生长起到显著抑制，且抑制效果可长时间持续。本试验成功使用乳酸链球菌素制备了具有高效、持久抗菌效应的pha塑料，并且通过详细的功能表征与显微镜观察，为pha生物塑料在医学与食品领域的应用打下基础。

1、材料与方法

1.1实验材料

1.1.1菌株与试剂

用于抗菌效应检测的菌株为藤黄微球菌(micrococcusluteusncib8166)。培养基为si培养基，培养条件为30℃，静置或200rpm摇动培养。phbhhx塑料粉料由北京蓝晶生物科技有限公司提供。乳酸链球菌素(nisin)样品由中科院微生物研究所提供，纯度为2.5％，剩余杂质为无机盐和蛋白粉。其余所需试剂均购自sigma-aldrich公司。

1.1.2含有nisin的phbhhx塑料薄膜

选取二氯甲烷作为溶剂浇铸的溶剂；这是因为二氯甲烷具备化学惰性和高挥发性且已有工作表明pha在二氯甲烷中可高效溶解^[15]。称取不同质量梯度的nisin，各自加入一份溶解了1gphbhhx粉料的15ml二氯甲烷中；nisin样品的用量分别是0.01mg，0.1mg，1mg，4mg，16mg，64mg和256mg，换算为nisin纯净物则为0.25μg，2.5μg，25μg，100μg，400μg，1.6mg和6.4mg(后文中nisin浓度与用量皆指纯净物)。用磁棒搅拌直至nisin样品粉末完全分散到聚合物溶液中，将混匀的溶液浇铸到9cm的玻璃培养皿中，通风橱内静置24h。待二氯甲烷完全挥发，phbhhx成膜；塑料膜的厚度约1mm，面积约为63.5cm²，因此nisin在薄膜中的分布浓度为(x*0.394)μg/cm²，x代表含有nisin的混合物样品的质量数值(以mg单位记)。用6mm直径的打孔器将塑料膜加工为圆形薄膜，保存在密闭容器中待用。

1.2实验方法

1.2.1利用琼脂扩散法测试phbhhx-nisin薄膜的抑菌效应

将藤黄微球菌单克隆菌落接种到5mlsi液体培养基中；30℃，200rmp条件下培养16h，获得种子液(od600＝1.9)。取500μl种子液加到50mlsi固体培养基中，混匀以制备琼脂扩散法所需的平板，每个平板含有约25ml的si固体培养基。 将6mm直径的phbhhx-nisin圆形薄膜平放在si固体培养基表面，每种nisin含量的薄膜有6个重复，30℃静置培养24h；对照组为不含nisin、等直径的phbhhx薄膜。用卡尺测量每个抑菌圈的大小并记录。

1.2.2nisin在phbhhx薄膜中的物理分布

将直径6mm的phbhhx-nisin薄膜固定在载玻片上，nisin的浓度分别为100μg/g和25μg/g。phbhhx-nacl薄膜和不添加任何盐的phbhhx薄膜分别作为对照组；phbhhx-nacl薄膜中的nacl浓度是0.975mg/g(与25μg/gnisin含量的膜片所对应的盐含量相同)。采用leicatcssp2激光共聚焦显微镜，层扫观察nisin的分布情况。nisin在425nm波长的激发光(ex)下可发出475nm波长(em)的自发荧光。

1.2.3液体培养条件下测量phbhhx-nisin的抑菌效应

获得种子液的方法同琼脂扩散法。所用nisin的浓度为100μg/g，25μg/g和2.5μg/g。将种子液稀释10⁴倍，即每毫升稀释过的菌液约含10⁵个菌落形成单位(colony-formingunit,cfu)，加入3片加工好的phbhhx-nisin薄膜到5mlsi液体培养基中，30℃，200rmp培养。每隔一段时间取样，从培养液中取出200μl菌液测量od600，根据od600数值用新鲜si培养基将取出样品进行不同倍数的稀释后涂板，30℃静置培养20h后计算活菌数目得出统计结果。每种nisin含量的薄膜进行三次实验重复，对照组为不含nisin的phbhhx薄膜和不含nisin的纸片。

2结果与分析

2.1琼脂扩散法测定phbhhx-nisin薄膜的抑菌效应

藤黄微球菌是一种广泛分布于空气、土壤、水及动植物表面的条件致病菌，被用作抑菌素(如nisin)的指示菌株^[16,17]。琼脂扩散法观测到含有nisin的phbhhx薄膜对于藤黄微球菌的生长表现出显著的抑制效应。使用纸片和不含nisin的phbhhx薄膜的对照组并没有抑菌效应(见图1a和图1b的0μg/g)，说明抑菌效应的来源正是nisin。nisin含量达到25μg/g以上时表现出稳定大小的抑菌圈(图1a)；nisin含量在2.5μg/g及以下时的抑菌效果则不稳定(图1b)；这暗示nisin在phbhhx薄膜内部的分布并不均匀，因此nisin浓度越低则抑菌效果平行性越差。随着nisin浓度的增加，phbhhx薄膜抑菌效果显著增强，详细统计的变化趋势见图2。

2.2nisin在phbhhx薄膜中的物理分布

通过leicatcssp2激光共聚焦显微镜清晰地观察到nisin在phbhhx薄膜中分布情况。图3展示了100μg/g和25μg/g两种nisin浓度的phbhhx薄膜的显微结果。nisin在薄膜内部呈颗粒状分布；图中的绿色亮点为nisin蛋白质颗粒的自发荧光，直径约为10-70μm。为了分析深色斑点的来源，我们采用phbhhx-nacl膜片(nacl浓度是0.975mg/g，与实验组所对应的盐含量相同)与不添加任何盐的空白phbhhx膜片分别作为25μg/gphbhhx-nisin膜片的对照组进行激光共聚焦显微镜观察。尽管空白phbhhx膜片(图5b)中可以观察到深色斑点，但斑点的直径和密度与phbhhx-nacl膜片(图5a)相比有显著差别；与此同时，phbhhx-nacl膜片(图5a)中深色斑的直径和密度与实验组(图3a)更为相似，说明深色斑点为无机盐颗粒。

2.3phbhhx薄膜中nisin的释放情况

根据琼脂扩散法的测量结果，选取四种nisin浓度(100μg/g，25μg/g，2.5μg/g，0.25μg/g)的phbhhx薄膜做液体培养抑菌实验。将phbhhx-nisin薄膜加到藤黄微球菌生长所需的si液体培养基中进行细菌培养，在特定时间点取样后用新鲜si液体培养基将样品稀释不同的倍数后涂板，30℃静置培养20h，统计平板上的活菌数目，结果如图4所示。对照组(加入了不含nisin的phbhhx薄膜的培养基)在培养22h时达到稳定期(～8.8logcfu/ml)。含有2.5μg/gphbhhx-nisin薄膜的样品中，菌的密度在早期生长中急速下降约3个数量级，原因可能是大量菌体被薄膜释放的nisin杀死；但由于含量不高的nisin被耗尽，少数幸存的活菌导致8h后菌体密度迅速上升，在22h也达到了稳定期(图4)。25μg/g与100μg/g的phbhhx-nisin薄膜所在培养液没有出现藤黄微球菌菌体复苏的现象，说明薄膜释放的nisin可以在细菌生长早期就将其完全杀灭(图4)。这些结果证明了分布在薄膜中的nisin可以被顺利释放出来且抑菌效应能得到长时间的维持。

3讨论

本研究首次将nisin经过溶剂浇铸的方法嵌入到phbhhx中，使得phbhhx具有抗菌活性，其生产方法简便，极易应用于工业放大。当前国内外的同类研究将目光集中在pla和pbs系列的生物塑料上，而针对性能更为多样化、生物降解性与相容性更高的pha系列的工作则是空白。为了进一步说明本文方法对于pha系列的通用性，我们采用另外三种pha(phb，phbv，p3hb4hb)分别制备了phb-nisin，phbv-nisin与p3hb4hb-nisin共三种抗菌pha材料并进行了的琼脂扩散法实验。实验结果表明，虽然不同的材料间表现出一定的差异，但三种含有nisin的pha材料均呈现出灵敏的、显著的抗菌活性(图6)。

nisin可以通过共价和非共价的方式整合到其他介质中。考虑到nisin需要被充分释放才能最大程度发挥抑菌活性，因此我们选择溶剂浇铸这一非共价结合的方法将nisin整合到pha中。本研究中nisin以“不溶颗粒”的形式混在pha中；实验结果也表明利用此种方法，在5ml液体培养基中仅仅0.33μg的nisin(换算为nisin浓度则为0.07μg/ml)就足以抑制细菌的生长；这是截止到目前已报道的抑菌活性最高的抗菌塑料。

验证pha-nisin薄膜在液体培养条件下的抑菌情况时我们观察到，25μg/g和100μg/gnisin含量的pha薄膜在藤黄微球菌生长初期就没有了生长迹象。然而，当nisin的含量为2.5μg/g时，在生长前8个小时活菌数急剧下降后，菌体密度反而出现复苏现象。这说明此时被释放到液体中的nisin尚不足以杀灭全部的菌体，且后续释放乏力。因此，2.5μg/g的nisin含量对于液体培养条件下的抑菌来说是不够的。关于固体与液体之间的抑菌浓度差别，有两个潜在的影响因素：一是nisin的扩散方式不同，在液体震荡的条件下nisin比在固体平板上更容易扩散稀释；二是不同的生长条件导致细菌的代谢物不同，而后者会显著影响nisin的活性^[18]。

nisin是由34个氨基酸组成的、硫醚键形成五个内环的短肽，常为二聚体或四聚体。nisin作为食品防腐剂的实践经验表明其在偏酸性条件下保存时间长，高压处理后活性保持良好，在合适的条件下甚至可以忍受一定程度的高温。前人报道，在ph5-7时，经历巴氏消毒后nisin可保持至少80％的活性^[7]。在偏酸性条件下，常规高压蒸汽灭菌后nisin的活性仍能保持50％以上；一些nisin突变体甚至可以忍受100摄氏度及以上的高温处理10分钟而保持80％抑菌活性^[19]。这些物理条件符合工业实践中pha的加工窗口，因此抗菌pha塑料的工业生产过程nisin的降解失活很可能不是难题。

本研究为工业化生产具有抗菌效应的生物可降解塑料pha提供了重要参考。特别值得注意的是，这里使用nisin这一被公认为安全食品防腐剂的天然产物作为抗菌成分，可以有效遏制食品腐败菌和条件致病菌的生长。因此抗菌pha塑料在医学和食品领域可预见的应用范围相当可观，包括食品包装袋、饮水机接口、电冰箱内置塑料等等。

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