一种人12号染色体着丝粒探针试剂盒及其制备方法和应用与流程

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种高特异性的人12号染色体着丝粒探针试剂盒及其制备方法和应用。

背景技术：
人类第12号染色体占人类基因组的4.5％，共包含1400多个编码基因，与阿尔茨海默病、大骨节病、慢性淋巴细胞白血病等疾病相关。其中12号染色体上13个短串联重复序列位点中的D12S1725和D12S1638两个位点与大骨节病患者存在显著的关联；12q13～14区间包含的MDM2基因在很多病程进展迅速的患者中有过度表达。有报道表明，12号染色体三体和不典型的形态学及免疫表型特征之间有明显的相关性，还与淋巴细胞增殖活性高、分期级别高及预后有关系。12号染色体三体是慢性淋巴细胞白血病中常见的染色体异常现象，12号染色体三体的慢性淋巴细胞白血病具有临床及生物学上的特殊性，如早期出现淋巴结及器官的浸润，并可转化为幼稚淋巴细胞白血病或其它侵袭性淋巴瘤(Richter’s综合症)，研究认为存在12号染色体三体的患者预后普遍较差，Stilgenbauer等的报道表明，正常核型患者的平均存活期为15年，而核型异常患者的平均存活期为7.7年。因此，12号染色体计数对慢性淋巴细胞白血病的治疗及预后判断有重要意义。目前常用的人12号染色体着丝粒探针的制备一般采用NCBI提供序列的特异性重复单元序列标记，实际杂交时存在特异性较低、杂信号多、杂交背景差等缺点，主要表现在以下两个方面：一方面，该片段为685bp，直接用该片段制成的探针较大，另一方面，该片段中仍有与其它染色体着丝粒相近的序列，酶切标记后，这些序列可能形成杂信号。以上表明，现有探针不利于临床的正确诊断及治疗，因此研发一种特异性高的人12号染色体着丝粒探针非常必要。

技术实现要素：
本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种高特异性的人12号染色体着丝粒探针试剂盒及其制备方法和应用。为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：一种高特异性的人12号染色体着丝粒探针试剂盒，包括：荧光材料标记的CEP12着丝粒探针和杂交缓冲液，所述CEP12着丝粒探针的序列号如SEQIDNO.1所示。上述方案中，所述荧光材料为异硫氰酸荧光素(FITC)。上述方案中，所述杂交缓冲液为10％硫酸葡聚糖、0.01M的PBS缓冲液(PH＝7.4)与去离子甲酰胺按照1:6:3的体积比混合的混合液。上述方案中，所述荧光材料标记的标记效率为1％～5％。上述高特异性的人12号染色体着丝粒探针试剂盒的制备方法，包括如下步骤：(1)制备高特异性的人12号染色体着丝粒探针：a.查找并筛选人12号染色体着丝粒的高特异性区域，人工合成该区域序列，获得pUc-CEP12质粒；b.根据步骤a所得pUc-CEP12质粒的序列设计引物；c.以步骤a所得pUc-CEP12质粒为模板，加入已用荧光材料标记的dUTP，利用步骤b设计的引物进行PCR扩增，得到荧光材料标记的PCR产物，所述PCR产物经纯化后即为CEP12着丝粒探针；(2)将步骤(1)所得CEP12着丝粒探针用杂交缓冲液稀释至终浓度为2ng/μL，然后、分装、贴标签、组装后即得到高特异性的人12号染色体着丝粒探针试剂盒。上述方案中，步骤(1)中所述高特异性区域的序列号如SEQIDNO.1所示。上述方案中，步骤(1)中所述引物为F:GAACGCTAGAAAGAAGAAT；R:CATTTGGCCTAAAAGCGCTTG。上述方案中，步骤(1)中所述PCR扩增的反应体系为：5μL、10Xbuffer，2μL引物(F/R，浓度均为10μM)，1μL、1ng/μLpUc-CEP12质粒，1μL、10mMdATP，1μL、10mMdCTP，1μL、10mMdGTP，0.75μL、10mMdTTP，2.5μL、1mMFluorescein-12-dUTP，0.5μL、TaqDNApolymerase，35.25μL去离子水。上述方案中，步骤(1)中所述PCR扩增的程序为：94℃5min；55℃5min；72℃1min、94℃1min、55℃1min，30cycles；72℃5min，4℃保存。上述高特异性的人12号染色体着丝粒探针试剂盒在制备用于检测人12号染色体着丝粒产品中的应用。本发明的有益效果如下：(1)本发明所述试剂盒中，CEP12着丝粒探针的大小为148bp，较一般探针小，更容易进入细胞与靶区域杂交；(2)细胞滴片原位杂交时，一般无前处理过程，细胞通透性不好，一般探针较难杂交，本发明所述CEP12着丝粒探针较一般探针小，且大小均一，非常容易杂交，因此，本发明所述CEP12着丝粒探针试剂盒也适用于细胞荧光原位杂交；(3)本发明所述CEP12着丝粒探针序列是12号染色体着丝粒序列中的高特异性序列，提高了探针的特异性，进而增加了探针杂交检测结果判读的准确性。附图说明图1为PCR产物(CEP12着丝粒探针)电泳结果图，其中a是Mark，b是PCR产物。图2为CEP12着丝粒探针与正常人外周血淋巴细胞荧光原位杂交实验结果。具体实施方式为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。实施例1CEP12着丝粒探针的制备高特异性的人12号染色体着丝粒探针(CEP12着丝粒探针)的制备：(1)查找并筛选人...