一种重组脊髓灰质炎病毒样颗粒及其制备方法与应用与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组脊髓灰质炎Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型病毒样颗粒，并进一步公开其制备方法，以及其在制备疫苗药物领域的应用。

背景技术：

脊髓灰质炎(Poliomyelitis)是一种由脊髓灰质炎病毒(Poliovirus，PV)所致的急性传染病，会严重危害儿童的身体健康。脊髓灰质炎病毒侵袭人的神经系统，可在数小时内造成机体完全瘫痪；脊髓灰质炎病毒还可以通过口腔进入体内并在肠道内繁殖，引起的初期症状可表现为发热、乏力、头痛、呕吐、脖颈僵硬以及四肢疼痛。未免疫人群中几乎所有人均可能感染脊髓灰质炎，感染者中有少数人会出现麻痹症状，由于该症状好发于婴幼儿，故又俗称小儿麻痹症。每200例感染病例就有一例导致不可逆转的瘫痪(通常是两腿瘫痪)，在瘫痪病例中，约有5-10％的患者会因呼吸肌麻痹而死亡。

脊髓灰质炎病毒属于小核糖核酸病毒(Picornaviridae)的肠道病毒属(Enterovirus)。脊髓灰质炎病毒结构为正二十面体结构，直径约为27-30nm，无包膜结构。脊髓灰质炎病毒的基因组为单股正链RNA，由5’非编码区、P1区、P2区、P3区和3’非编码区组成。其中，P1编码病毒的结构蛋白P1前体，可被病毒的蛋白酶前体3CD切割为VP0、VP1和VP3结构蛋白。这三种蛋白与病毒RNA组成病毒颗粒，VP0在组装中进一步裂解为VP2和VP4，完成成熟病毒颗粒的组装。

脊髓灰质炎病毒根据血清型被分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中Ⅰ型脊髓灰质炎在3种类型中最具神经侵袭性，多数脊髓灰质炎流行及地方性流行病例都是由Ⅰ型脊髓灰质炎引起的，其次分别为Ⅲ型和Ⅱ型，且三种血清型之间并无交叉免疫保护作用。

目前，临床上对于脊髓灰质炎的治疗并没有特效药，主要采取的是接种疫苗为主的预防措施。目前国内外普遍使用的用来预防脊髓灰质炎的疫苗有灭活疫苗(Inactivated poliovirus vaccine，IPV)和口服减毒疫苗(Oral poliovirus vaccine，OPV)。其中IPV是由3种类型脊髓灰质炎病毒组成的混合物经过细胞培养、收获上清、纯化以及甲醛灭活等而制备的疫苗。IPV疫苗相较OPV免疫安全性好，但是接种IPV不能形成明显的肠道局部免疫，且成本显著高于OPV。由于IPV需要大量培养活病毒，因此在实验室和制备阶段也存在着泄露的危险。同时IPV中还含有猴病毒(SV40)，来自疫苗早期生产和使用过程中的原代恒河猴肾细胞，研究表明，SV40可以使培养的细胞发生转化，并可导致动物产生肿瘤。而OPV为用脊髓灰质炎病毒减毒株经培养、收获病毒液后制成的用于预防脊髓灰质炎的白色固体糖丸，其优点是价格便宜，但其存在基因回复突变和致病性等问题。目前我国广泛使用的疫苗为OPV疫苗，临床显示，与OPV相关的主要不良反应是疫苗相关麻痹性脊髓灰质炎(VAPP)。年平均VAPP的发病率为每100万人口发生0.14例，而在免疫缺陷人群中发生VAPP的风险性最高。

1988年，世界卫生组织在全球启动了“消灭脊髓灰质炎”行动，通过实施疾病监测、免疫接种等策略，我国自1995年即实现了脊髓灰质炎野病毒的循环阻断。2000年，经世界卫生组织确认，包括中国在内的西太平洋地区已经基本实现了无脊灰目标；至2010年，全球只有4个本土脊灰流行的国家，其中3个和我国接壤，即印度、巴基斯坦和阿富汗，对我国病患的防治也构成一定的隐患。直至今日，全球消灭脊髓灰质炎的目标仍然没有达到，仅在2005-2009年，尼日利亚就出现了3660例脊髓灰质炎病毒感染造成的急性弛缓性麻痹患者，我国新疆维吾尔自治区也于2011年发生了Ⅰ型脊髓灰质炎野毒株输入性疫情。可见，我国对脊髓灰质炎的防治依然不容放松。

随着现代生物技术的快速发展，基因工程疫苗成为了近年来新型病毒预防性疫苗主要的发展趋势。其中，基于病毒样颗粒(Virus-like particles，VLPs)的基因工程疫苗备受关注。病毒样颗粒是由病毒衣壳蛋白自组装而形成的不含病毒核酸的空心颗粒，具有与天然病毒衣壳蛋白相同或相似的空间构型及抗原表位，具有很强的免疫原性，能有效刺激机体产生体液免疫和细胞免疫应答。并且由于病毒样颗粒不含有病毒的基因组，因此不具备复制能力，其安全性要优于传统的减毒活疫苗和灭活疫苗，所以病毒样颗粒疫苗的出现为研发更为安全有效的疫苗提供了一个新的契机。

技术实现要素：

为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种重组脊髓灰质炎Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型病毒样颗粒，并进一步公开其制备方法，以及其在制备疫苗药物领域的应用。

为解决上述技术问题，本发明所述的重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的制备方法，包括如下步骤：

(1)取脊髓灰质炎病毒的P1基因和3CD基因分别克隆到共表达载体中，随后通过转化感受态细胞得到能够表达脊髓灰质炎病毒样颗粒的重组病毒载体；

(2)用步骤(1)得到的重组病毒载体转染昆虫细胞，培养后获得含有编码病毒样颗粒蛋白基因的重组病毒；

(3)将步骤(2)获得的重组病毒感染至宿主细胞进行扩增以提高病毒滴度，随后接种高滴度的重组病毒侵染昆虫细胞，以表达上述P1基因和3CD基因，并按照常规纯化方法获得脊髓灰质炎病毒样颗粒。

优选的，所述步骤(1)中，所述P1基因和所述3CD基因均为根据宿主细胞的偏好性进行密码子优化的基因。

所述密码子优化是指在不改变野生型脊髓灰质炎病毒P1蛋白和3CD蛋白氨基酸序列的前提下，将野生型脊髓灰质炎病毒P1基因和3CD基因的密码子替换为昆虫细胞偏好的密码子。

所述步骤(1)中：所述脊髓灰质炎病毒包括Ⅰ型、Ⅱ型或Ⅲ型病毒，所述脊髓灰质炎病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型病毒的P1基因和3CD基因分别属于野生型脊髓灰质炎病毒的Mahoney株、MEF-1株和Saukett株。

更具体的，所述脊髓灰质炎病毒为Ⅰ型病毒，其优化的P1基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，其优化的3CD基因具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

所述脊髓灰质炎病毒为Ⅱ型病毒，其优化的P1基因具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，其优化的3CD基因具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；

所述脊髓灰质炎病毒为Ⅲ型病毒，其优化的P1基因具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，其优化的3CD基因具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。

所述步骤(1)中，所述共表达载体为将所述P1基因和所述3CD基因分别插入到pFastBac^TMDual载体或者Dual-CMV改造载体的两个多克隆位点处各由一个启动子驱动转录得到的重组质粒；

所述Dual-CMV改造载体为在pFastBac^TMDual载体基础上将p10启动子改造为CMV启动子获得的改造载体。

所述步骤(1)中，所述P1基因和所述3CD基因在所述重组表达载体中各由一个启动子驱动转录，驱动所述P1基因的启动子方向和驱动所述3CD基因的启动子方向相反。

所述步骤(1)中，所述感受态细胞为DH10Bac感受态细胞，所获得的所述重组病毒载体为重组昆虫杆状病毒载体。

所述步骤(2)中，所述目的昆虫细胞选自草地贪夜蛾卵巢细胞系sf9、sf21以及粉纹夜蛾胚胎细胞系High Five。

本发明还公开了由上述方法制备得到的重组脊髓灰质炎病毒样颗粒。进一步的，所述重组脊髓灰质炎病毒样颗粒为脊髓灰质炎病毒Ⅰ型、Ⅱ型或Ⅲ型病毒样颗粒。

本发明还公开了所述的重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的中和抗体试验结果。结果表明本发明制备的脊髓灰质炎病毒样颗粒具有较好的免疫原性，对脊髓灰质炎的疫苗药物研发具有广阔的应用前景。

本发明所述制备重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的方法，在昆虫表达系统中成功的制备了脊髓灰质炎Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型病毒样颗粒，在动物水平的免疫中和性试验结果显示，纯化获得的脊髓灰质炎病毒样颗粒有较高的免疫原性，且由于其不含有病毒核酸，其安全性会优于传统的减毒和灭活疫苗，故所述脊髓灰质炎Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型病毒样颗粒可有效应用于制备基于病毒样颗粒的脊髓灰质炎疫苗。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，

图1为Ⅰ-P1-Dual、Ⅱ-P1-Dual和Ⅲ-P1-Dual质粒及酶切鉴定结果；

图2为Ⅰ-P13CD-Dual、Ⅱ-P13CD-Dual和Ⅲ-P13CD-Dual质粒及酶切鉴定结果；

图3为Dual-CMV质粒及酶切鉴定结果；

图4为Ⅰ-P1-CMV、Ⅱ-P1-CMV和Ⅲ-P1-CMV质粒及酶切鉴定结果；

图5为Ⅰ-P13CD-CMV、Ⅱ-P13CD-CMV和Ⅲ-P13CD-CMV质粒及酶切鉴定结果；

图6为重组脊髓灰质炎Ⅰ型病毒样颗粒120KV负染电镜图；

图7为重组脊髓灰质炎Ⅱ型病毒样颗粒120KV负染电镜图；

图8为重组脊髓灰质炎Ⅲ型病毒样颗粒120KV负染电镜图。

具体实施方式

实施例1表达基因的选择与密码子的优化设计

分别选取脊髓灰质炎Ⅰ型Mahoney株、Ⅱ型MEF-1株和Ⅲ型Saukett株，所述各病毒株的P1蛋白和3CD蛋白的DNA序列参照GenBank，分别为：NC_002058.3、AY238473.1和L23845.1。

由金斯瑞公司利用软件对上述编码P1蛋白和3CD蛋白的野生型DNA序列进行改造，密码子采用昆虫细胞中使用频率较高的密码子，同时避免了可能影响基因表达的转录因子结合区、重复序列和RNA高级结构。

设计5’端和3’端分别含有EcoRⅠ酶切位点和HindⅢ酶切位点的优化后P1蛋白表达序列并进行基因合成，获得编码脊髓灰质炎Ⅰ型Mahoney株P1蛋白的基因序列如SEQ ID NO:1所示；获得编码脊髓灰质炎Ⅱ型MEF-1株P1蛋白的基因序列如SEQ ID NO:3所示；获得编码脊髓灰质炎Ⅲ型Saukett株P1蛋白的基因序列如SEQ ID NO:5所示。

设计5’端和3’端分别含有NcoⅠ酶切位点和KpnⅠ酶切位点的优化后3CD蛋白表达序列并进行基因合成，获得编码脊髓灰质炎Ⅰ型Mahoney株3CD蛋白的基因序列如SEQ ID NO:2所示；获得编码脊髓灰质炎Ⅱ型MEF-1株3CD蛋白的基因序列如SEQ ID NO:4所示；获得编码脊髓灰质炎Ⅲ型Saukett株3CD蛋白的基因序列如SEQ ID NO:6所示。

实施例2脊髓灰质炎病毒P1基因和3CD基因共表达载体的构建

(1)pFastBac^TMDual共表达P1基因和3CD基因的构建

采用EcoRⅠ酶和HindⅢ酶(购于NEB)双酶切分别处理上述如序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5所示序列结构的P1蛋白基因与pFastBac^TMDual载体质粒，于37℃水浴反应4小时后，使用小量DNA片段快速胶回收试剂盒(购于博大泰克)进行片段回收。将酶切后三种P1核苷酸片段分别与酶切后pFastBac^TMDual载体按照摩尔比9:1的比例混合，加入2×Solution I连接酶(购于大连宝生物工程有限公司)，反应体系为10μL，于16℃水浴连接过夜。取10μL连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并涂布于含有氨苄抗性的LB固体琼脂板，于37℃培养箱培养16小时。从平板上挑取单菌落接种到含有5mL氨苄抗性的液体LB培养基中，于37℃转速为200rpm的摇床中培养过夜。使用质粒小量快速提取试剂盒(购于博大泰克)提取重组质粒，得到Ⅰ-P1-Dual、Ⅱ-P1-Dual和Ⅲ-P1-Dual(质粒跑胶结果见图1，分别对应泳道1、4、6)。分别使用EcoR Ⅰ酶和Hind Ⅲ酶进行双酶切鉴定，酶切后结果分别对应图1中泳道2、5、7，与预期结果相符。将上述重组质粒送测序公司进行测序，测序结果进一步证实重组质粒构建成功。

采用Nco Ⅰ酶和Kpn Ⅰ酶(购于NEB)双酶切分别处理上述如序列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6所示序列结构的3CD蛋白基因与上述获得的Ⅰ-P1-Dual、Ⅱ-P1-Dual和Ⅲ-P1-Dual质粒，于37℃水浴反应4小时后，使用小量DNA片段快速胶回收试剂盒进行片段回收。将酶切后三种3CD核苷酸片段分别与酶切后Ⅰ-P1-Dual、Ⅱ-P1-Dual和Ⅲ-P1-Dual载体按照摩尔比9:1的比例混合，加入2×Solution I连接酶，反应体系为10μL，于16℃水浴连接过夜。取10μL连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并涂布于含有氨苄抗性的LB固体琼脂板，于37℃培养箱培养16小时。从平板上挑取单菌落接种到含有5mL氨苄抗性的液体LB培养基中，于37℃转速为200rpm的摇床中培养过夜。使用质粒小量快速提取试剂盒提取重组质粒，得到Ⅰ-P13CD-Dual、Ⅱ-P13CD-Dual和Ⅲ-P13CD-Dual(质粒跑胶结果见图2，分别对应泳道1、4、6)。分别使用NcoⅠ酶和KpnⅠ酶进行双酶切鉴定，酶切后结果分别对应图2中泳道2、5、7，与预期结果相符。将上述重组质粒送测序公司进行测序，测序结果进一步证实共表达载体构建成功。

(2)基于pFastBac^TMDual共表达载体的改造及共表达载体的构建

为了进一步提高脊髓灰质炎病毒样颗粒的表达产量，我们将pFastBac^TMDual载体的p10启动子替换为了CMV启动子。采用如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示序列的引物，以pcDNA3.0质粒为模板，经过PCR扩增得到CMV启动子插入片段(序列结构如SEQ ID NO:9所示)。采用SmaI酶和Sna I酶(购于大连宝生物工程有限公司)双酶切分别处理上述扩增得到的CMV启动子插入片段和pFastBac^TMDual，于37℃水浴反应4小时后，使用小量DNA片段快速胶回收试剂盒进行片段回收。将酶切后的CMV启动子核苷酸片段与酶切后pFastBac^TMDual载体按照摩尔比9:1的比例混合，加入2×Solution I连接酶，反应体系为10μL，于16℃水浴连接过夜。取10μL连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并涂布于含有氨苄抗性的LB固体琼脂板，于37℃培养箱培养16小时。从平板上挑取单菌落接种到含有5mL氨苄抗性的液体LB培养基中，于37℃转速为200rpm的摇床中培养过夜。使用质粒小量快速提取试剂盒提取重组质粒，得到Dual-CMV改造载体(质粒跑胶结果见图3，对应泳道1)。分别使用SmaI酶和Sna I酶进行双酶切鉴定，酶切后结果对应图3泳道3，与预期结果相符。将上述重组质粒送测序公司进行测序，测序结果进一步证实CMV启动子改造载体构建成功。

采用EcoR I酶和Hind III酶双酶切处理上述Dual-CMV改造载体，于37℃水浴反应4小时后，使用小量DNA片段快速胶回收试剂盒进行片段回收。将(1)中酶切后的三种P1核苷酸片段分别与上述酶切后的Dual-CMV改造载体按照摩尔比9:1的比例混合，加入2×Solution I连接酶，反应体系为10μL，于16℃水浴连接过夜。取10μL连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并涂布于含有氨苄抗性的LB固体琼脂板，于37℃培养箱培养16小时。从平板上挑取单菌落接种到含有5mL氨苄抗性的液体LB培养基中，于37℃转速为200rpm的摇床中培养过夜。使用质粒小量快速提取试剂盒提取重组质粒，得到Ⅰ-P1-CMV、Ⅱ-P1-CMV和Ⅲ-P1-CMV(质粒跑胶结果见图4，分别对应泳道1、3、6)。分别使用EcoR I酶和Hind III酶进行双酶切鉴定，酶切后结果分别对应图4泳道2、4、7，与预期结果相符。将上述重组质粒送测序公司进行测序，测序结果进一步证实重组质粒构建成功。

以(1)中所述三种3CD蛋白基因作为模板，通过PCR扩增在片段两端分别引入NheI酶和KpnI酶的酶切位点。其中，

PCR上游引物为5’–CTAGCTAGCATGGGACCAGGTTTCGACTA–3’；

PCR下游引物分别为:

5’–CGGGGTACCTTAGAAAGAGTCCAACCAAC–3’(I-3CD)；

5’–CGGGGTACCTTAGAAGGAGTCCAACCAAC–3’(II-3CD)；

5’–CGGGGTACCTTAGAAACTGTCCAACCATC–3’(III-3CD)。

采用NheI酶和KpnI酶双酶切分别处理上述扩增得到的3CD蛋白基因和Ⅰ-P1-CMV、Ⅱ-P1-CMV和Ⅲ-P1-CMV质粒，于37℃水浴反应4小时后，使用小量DNA片段快速胶回收试剂盒进行片段回收。将酶切后三种3CD核苷酸片段分别与酶切后Ⅰ-P1-CMV、Ⅱ-P1-CMV和Ⅲ-P1-CMV载体按照摩尔比9:1的比例混合，加入2×Solution I连接酶，反应体系为10μL，于16℃水浴连接过夜。取10μL连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并涂布于含有氨苄抗性的LB固体琼脂板，于37℃培养箱培养16小时。从平板上挑取单菌落接种到含有5mL氨苄抗性的液体LB培养基中，于37℃转速为200rpm的摇床中培养过夜。使用质粒小量快速提取试剂盒提取重组质粒，得到Ⅰ-P13CD-CMV、Ⅱ-P13CD-CMV和Ⅲ-P13CD-CMV(质粒跑胶结果见图5，分别对应泳道1、3、6)。分别使用NheI酶和KpnI酶进行双酶切鉴定，酶切后结果分别对应图5泳道2、4、7，与预期结果相符。将上述重组质粒送测序公司进行测序，测序结果进一步证实改造后的共表达载体构建成功。

实施例3重组脊髓灰质炎杆状病毒的表达和纯化方法

将前述实施例1和2中所述的表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体Ⅰ-P13CD-Dual/CMV、Ⅱ-P13CD-Dual/CMV和Ⅲ-P13CD-Dual/CMV分别按照Invitrogen的Bac-to-Bac表达系统说明书，转化至大肠杆菌感受态细胞DH10Bac，于37℃培养箱培养48h后，通过蓝白斑筛选获得重组杆状病毒载体。

将上一步获得的重组杆状病毒载体使用Invitrogen的Cellfectin转染试剂转染sf9昆虫细胞获得相应的第一代重组杆状病毒，即重组脊髓灰质炎杆状病毒，分别命名为Ⅰ-V1-Dual/CMV、Ⅱ-V1-Dual/CMV和Ⅲ-V1-Dual/CMV。继续对上述一代毒进行扩增培养，至获得高病毒滴度的三代病毒Ⅰ-V3-Dual/CMV、Ⅱ-V3-Dual/CMV和Ⅲ-V3-Dual/CMV。

实施例4脊髓灰质炎病毒样颗粒的表达和纯化方法

将实施例3制得的重组脊髓灰质炎杆状病毒Ⅰ-V3-Dual/CMV、Ⅱ-V3-Dual/CMV和Ⅲ-V3-Dual/CMV分别以10MOI的接毒量感染sf9悬浮细胞，以Expression Systems的ESF921昆虫细胞培养基为悬浮培养基，于27℃转速为100rpm摇床中培养3-4天后收获病毒上清。

将离心收获的培养上清经过0.22μm滤膜抽滤去除杂质后使用100kD膜包浓缩10倍以上得到浓缩液。于超速离心管底部加入8mL的20％(W/V)蔗糖溶液，蔗糖上层加入浓缩液。经过超速离心3h后倒掉上清，用PBST(1‰Tween-20)溶液重悬超速离心沉淀获得重悬液。将重悬液进行高速离心取上清进行15％-45％(W/V)蔗糖密度梯度离心，经过超速离心5h，从上至下依次取出蔗糖梯度组分(600μL每管)，病毒样颗粒即富及于8-10号组分中。收集相应组分，用100kD浓缩管进行浓缩脱糖处理，即得纯化的脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白样品。pFastBac^TMDual和改造后的Dual-CMV载体表达和纯化病毒样颗粒的方法一致，且经过启动子改造后的Dual-CMV载体表达的病毒样颗粒的产量在同等条件下比未经改造的pFastBac^TMDual提高了四倍以上。

实施例5脊髓灰质炎病毒样颗粒VLPs的电镜检查

分别将实施例4中纯化得到的脊髓灰质炎Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型病毒样颗粒取5μL加在镀碳支持膜(购于中镜科仪)上吸附1min，滤纸吸干镀碳支持膜表面残余液体后，用ddH2O清洗镀碳支持膜表面两次，吸干ddH2O，加5μL 2％磷钨酸(购于中镜科仪)染色40s，吸干镀碳支持膜表面残液，室温放置干燥后用120KV透射电子显微镜观察其形态结构，结果分别见附图6-8所示。电镜负染结果表明脊髓灰质炎Ⅰ型(图6)、Ⅱ型(图7)和Ⅲ型(图8)病毒样颗粒纯化样品在电镜下可见直径约30nm左右的病毒样颗粒的存在。本实施例的结果表明，携带有密码子优化后的脊髓灰质炎P1基因和3CD基因的重组表达载体在昆虫杆状病毒表达系统中，可以成功的包装出脊髓灰质炎Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型的病毒样颗粒。

实施例6脊髓灰质炎病毒样颗粒免疫原性的测定

稀释实施例4中制备的脊髓灰质炎病毒样颗粒，并加入Al(OH)3佐剂混合。利用以上纯化的I型病毒样颗粒对大鼠分别在第一周和第三周进行免疫两次，每次每只免疫10μg或25μg。同时设置进口IPV灭活疫苗作为阳性对照和不含有病毒样颗粒样品的佐剂对照。四周后对大鼠进行采血，收集血清，分装后冷冻保存。

倍比稀释大鼠血清样品，与稀释到100TCID50的脊髓灰质炎减毒株Sabin I混合均匀，于37℃培养箱中孵育1小时。取100μl的中和液加到96孔Vero细胞中，于37℃培养箱中孵育3-4小时，观察细胞病变效应即CPE。结果显示两次免疫各10μg的脊髓灰质炎I型病毒样颗粒的实验组在血清稀释1024倍时可以完全保护细胞不受病毒侵袭；两次免疫各25μg的脊髓灰质炎I型病毒样颗粒的实验组在血清稀释2048倍时可以完全保护细胞不受病毒侵袭；两次免疫各半只进口IPV灭活疫苗的阳性对照组在血清稀释4096倍时可以完全保护细胞不受病毒侵袭。可见，所述病毒样颗粒的效果较好且其纯化及优化的空间更大，而且病毒样颗粒相比减毒疫苗和灭活疫苗具有更高的安全性。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。