本发明涉及发酵领域，尤其涉及一种耐高温脂肪酶的制备方法。
背景技术：
脂肪酶(triacylglycerol lipase EC3.1.1.3)是一种广泛存在的水解酶，能够催化甘油三酯键的断裂。因其催化功能的多样性及作为一种生物催化剂的优越性，广泛应用于食品、制革、饲料、洗涤、油脂化工等领域。脂肪酶作为饲料添加剂应用于动物养殖中具有广阔的应用前景，首先脂肪酶可以消除植物性饲料原料中的脂质抗营养因子，同时可以弥补幼禽幼畜消化道内脂肪酶的不足。但是在已实现产业化生产的脂肪酶产品中，pH稳定性多在中性偏碱范围内，对酸的耐受性较差，适合于饲料用的品种很少。
脂肪酶的制备法主要有提取法和微生物发酵法。脂肪酶的来源主要是植物、动物以及微生物。植物中如油料作物的种子，动物中如高等动物的胰脏和脂肪组织都是提取法提取脂肪酶的来源，提取法资源有限、工艺复杂、产量低；微生物发酵法它不受环境影响，资源丰富，产酶周期短，产物较单纯且成本低，生产上易于管理，易于实现工业化生产，但是目前采用微生物发酵法制备的脂肪酶的耐温性能都比较差。
芽孢杆菌属是微生物中产脂肪酶的重要成员，其所产的脂肪酶具有能耐受较高的温度、较宽的pH作用范围和对有机溶剂良好的耐受性等特点，但是在自然条件下，该菌的酶产量低，利用常规育种方法难以满足工业化生产的要求。如果能够研究一种新的采用脂肪酶的制备方法，既克服现有技术中微生物发酵法制备的脂肪酶不耐高温，同时又能保证该制备方法工业化生产是非常有必要的。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种耐高温脂肪酶的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
一种耐高温脂肪酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的耐高温脂肪酶基因克隆至毕赤酵母(Pichia pastoris)中；
(2)对经步骤(1)处理后的毕赤酵母进行活化处理，然后将活化处理后的毕赤酵母单菌落接种于摇瓶中进行摇瓶培养；活化处理采用YPD斜面培养基培养直至长出单菌落；
(3)将摇瓶培养的菌液移至种子罐中进行培养；
(4)将种子罐培养的菌液移至发酵罐中进行发酵培养；
(5)在步骤(4)得到的发酵液中加入脂肪酶协同剂，经吸附、干燥后，即得到所述脂肪酶。
上述的制备方法，优选的，所述发酵培养包括菌体数量增殖阶段、菌体饥饿阶段和甲醇溶液诱导阶段。
上述的制备方法，优选的，所述菌体数量增殖阶段的操作步骤包括：将种子罐培养的菌液接种至发酵罐后，控制培养温度为30℃±0.5℃，并调pH至5.0±0.1；控制发酵初期发酵罐中的转速为100-120rpm，通风量为1:(1.8-2.2)vvm；随着发酵菌体增多，调节转速和通风量控制发酵罐中的溶氧大于25％；培养14-16小时后，当发酵罐中的溶氧迅速回升到95％以上时，加入浓度为30-35％葡萄糖液，控制发酵罐培养基中糖的浓度始终在0.5％以下，当菌体湿重达到160±10g/L时停止补糖。
上述的制备方法，优选的，所述菌体饥饿阶段是葡萄糖液补料完毕后，发酵罐中的溶氧从25％迅速上升到95％以上时，维持饥饿状态10-15分钟。
上述的制备方法，优选的，观测饥饿状态时的菌液pH值有上升的趋势时，开始流加甲醇溶液诱导：先以3.0±0.2ml/L/h速度(每小时每升的发酵液中补甲醇3.0±0.2ml)流加甲醇溶液2小时，控制发酵罐中的溶氧在50％以上；再缓慢提高甲醇溶液的流加速度，控制发酵罐中的溶氧在10％以上，其中溶液的流加速度最大不超过10.0±0.2ml/L/h。
上述的制备方法，优选的，甲醇溶液诱导时间达到110-120h后结束发酵。
上述的制备方法，优选的，所述种子罐培养分为一级种子罐培养和二级种子罐培养；所述一级种子罐培养过程是指将摇瓶中培养的菌液移至以YPD为培养基的一级种子罐中培养，其接种量为1.5-2％，搅拌速度200-300rpm；培养温度为30℃±0.5℃，通风量为1:(1-1.2)vvm；培养时间为20-24小时；所述二级种子罐培养是指将一级种子罐培养的菌体以10％的接种量移种到以BSM为培养基的二级种子罐中扩大培养，二级种子罐培养为恒温培养，培养温度为30℃±0.5℃，搅拌速度180-200rpm，培养时间为15-18小时，通风量为1:(1-1.2)vvm；所述二级种子罐培养过程中菌液的pH为5.0±0.1。
上述的制备方法，优选的，所述摇瓶培养阶段采用的培养基为YPD培养基，培养的温度为30℃±0.5℃，培养的时间为24-32小时，培养过程的转速200-220rpm；
上述的制备方法，优选的，所述步骤(5)中，所述脂肪酶协同剂主要由聚乙烯胺、环糊精和玉米淀粉组成；其中所述聚乙烯胺的质量与发酵液体积比值为0.1％±0.02％；环糊精的添加与发酵液体积的比值为1％±0.1％；所述比值单位为Kg/L。
上述的制备方法，优选的，所述步骤(5)中，干燥的过程采用喷雾干燥，干燥的温度不超过100℃；最终得到的脂肪酶产品水分不超过10％。
巴斯德毕赤酵母是近年来兴起的一个真核高效表达系统，具有许多独特的优点，已迅速发展成为分子生物学领域中被广泛用于重组蛋白生产的主要表达系统之一。其有以下优势：(1)具有精确调控的启动子，可以精确表达目的外源蛋白；(2)表达效率高，其表达的外源蛋白可占总表达蛋白的90％以上，有利于目的蛋白的分离纯化；(3)在简单合成培养基中可实现高密度培养。
本发明对枯草芽孢杆菌产耐热脂肪酶的基因进行克隆，构建了产耐高温脂肪酶的基因工程菌；然后将来源于芽孢杆菌的耐高温脂肪酶基因在毕赤酵母中表达，实现了耐高温脂肪酶的工业化生产。
环糊精(Cyclodextrin，简称CD)是一系列环状低聚糖的总称，通常含有6～12个D-吡喃葡萄糖单元。构成环糊精分子的每个D()-吡喃葡萄糖都是椅式构象。各葡萄糖单元均以1，4-糖苷键结合成环。由于连接葡萄糖单元的糖苷键不能自由旋转，环糊精不是圆筒状分子而是略呈锥形的圆环。其中环糊精的伯羟基围成了锥形的小口，而其仲羟基围成了锥形的大口。本发明利用环糊精的外缘(Rim)亲水而内腔(Cavity)疏水的特殊结构，在发酵液中添加环糊精可以对酶蛋白起到保护作用；同时在发酵液中还加入聚乙烯胺，它与环糊精之间存在着协同催化效应，两种物质的协同作用，可进一步提高脂肪酶的耐热性、稳定性。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明获得的耐高温脂肪酶的基因来源于枯草芽孢杆菌，能耐受较高温度，较宽的pH作用范围和对有机溶剂良好的耐受性等特点，扩大了脂肪酶的应用领域，解决了饲料制粒中脂肪酶不耐温的问题。
(2)本发明的脂肪酶制备方法，添加了脂肪酶的协同剂，进一步提高脂肪酶的耐热性、稳定性。
(3)本发明制备方法过程中脂肪酶发酵液中的菌体可用作畜禽饲料，是一种很好的单细胞蛋白饲料；因而本发明的制备方法基本实现了零污染，零排放，回收率高。
(4)本发明获得的耐高温脂肪酶，85℃保温5min酶活性保留50％以上，优于现有市售的商品酶制剂，可以满足饲料高温制粒的要求。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合较佳的实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除有特别说明，本发明中用到的各种试剂、原料均为可以从市场上购买的商品或者可以通过公知的方法制得的产品。
下述实施例中的所使用的培养基以及原料配方见表1所示。
表1培养基以及原料配方
实施例1：
一种本发明的耐高温脂肪酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)基因克隆过程：将来源于枯草芽孢杆菌的耐高温脂肪酶基因克隆至毕赤酵母中，克隆过程为常规的工艺过程；
(2)种子制备阶段：将步骤(1)后得到的毕赤酵母经YPD斜面培养基培养长出毕赤酵母菌单菌落，然后接种于摇瓶(500mL摇瓶中装量100mLYPD培养基)中进行培养，控制摇瓶转速220rpm、30℃恒温摇床培养26h左右，得到摇瓶种子，湿重56g/L。
(3)一级200L种子罐培养：种子罐中放有100L YPD培养基，将步骤(1)培养好的摇瓶种子以2％接种量接种到一级种子罐中，控制搅拌速度为200rpm，恒温30℃，风量6m3/h(1：1vvm)，培养24小时，得到湿重70g/L的菌液。
(4)二级2000L种子罐培养：种子罐中有1000L BSM培养基，将一级种子罐培养好的菌液移种至二级种子罐，接种量为10％，控制搅拌速度180rpm，恒温30℃，风量60m3/h(1：1vvm)，培养18小时，整个培养过程用25％氨水控制pH5.0，最后得到湿重100g/L的菌液。
(5)发酵阶段：
将步骤(4)得到的菌液以10％接种量接种至20吨发酵罐中(发酵罐中有10吨BSM培养基)，控制培养温度30℃，用25％氨水调pH至5.0，最初控制转速100rpm，通风量1200m3/h(1：2vvm)，随着菌体增多，调节转速和通风量控制溶氧大于25％。培养16小时，溶氧迅速回升后流加30％葡萄糖液，控制培养基中糖的浓度始终在0.5％以下。
当菌体湿重达到160g/L时停止补糖，溶氧迅速上升后，维持饥饿状态15分钟，观测溶氧上升至接近100％，pH值有上升的趋势时，再开始流加甲醇诱导。
先以3.0ml/L/h速度流加甲醇溶液(含PTM112ml/L)2小时，控制溶氧在50％以上，随着菌体逐步适应甲醇环境，再缓慢增加甲醇流量，最大流加甲醇速度为10.0ml/L/h，控制溶氧10％以上。整个甲醇诱导时间为120h，最终检测发酵液中的菌体活力为12280U/mL(国标方法测定)，然后结束发酵，放罐体积为11500L。
(6)将步骤(5)得到的发酵液中添加11.5kg聚乙烯胺、115kg环糊精，充分搅拌均匀后，再添加870kg玉米淀粉作为载体搅拌均匀，在不超过100℃下进行喷雾干燥，控制水分在10％以下，得到脂肪酶成品2564kg。
(7)耐温性能测定：
称取成品脂肪酶1克，精确至0.0002克，按照国标测定方法，稀释220000倍后(市售样稀释100000倍)，40℃，反应15分钟，测定酶活为44062.4U/g，再分别取1.2ml待测样液装1.5ml离心管中，将其放在浮板上，分别放入65℃、75℃、85℃、95℃温度水浴锅，立刻计时5分钟，热处理完毕立刻取出放入自来水中冷却备用，以产品初始的酶活作为对照(100％)，计算相对酶活，85℃保温5min酶活性保留55％，结果见表2：
表2脂肪酶耐温性对照结果表
实施例2：
一种本发明的耐高温脂肪酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)基因克隆过程：将来源于枯草芽孢杆菌的耐高温脂肪酶基因克隆至毕赤酵母中，克隆过程为常规的工艺过程；
(2)种子制备阶段：将步骤(1)后得到的毕赤酵母经YPD斜面培养基培养长出毕赤酵母菌单菌落，然后接种于摇瓶(500mL摇瓶中装量100mLYPD培养基)中进行培养，控制摇瓶转速200rpm、30℃恒温摇床培养31h左右，得到摇瓶种子，湿重59g/L。
(3)一级200L种子罐培养：种子罐中放有100L YPD培养基，将步骤(1)培养好的摇瓶种子以2％接种量接种到一级种子罐中，控制搅拌速度为260rpm，恒温30℃，风量7m3/h(1：1.16vvm)，培养21小时，得到湿重80g/L的菌液。
(4)二级2000L种子罐培养：种子罐中放有1000L BSM培养基，将一级种子罐培养好的菌种移种至二级种子罐，接种量为10％，控制搅拌速度200rpm，恒温30℃，风量70m3/h(1：1.16vvm)，培养15小时，整个培养过程用25％氨水控制pH5.0，最后得到湿重116g/L的菌液。
(5)发酵阶段：
将步骤(3)得到的菌液以10％接种量接种至20吨发酵罐中(发酵罐有10吨BSM培养基)，控制培养温度30℃，用25％氨水调pH至5.0，最初控制转速110rpm，通风量1300m3/h(1：2.16vvm)，随着菌体增多，调节转速和通风量，控制溶氧大于25％。培养14小时，溶氧迅速回升后流加30％葡萄糖液，控制培养基中糖的浓度始终在0.5％以下。
当菌体湿重达到160g/L时停止补糖，溶氧迅速上升后，维持饥饿状态12分钟，观测溶氧上升至98％，pH值有上升的趋势时，再开始流加甲醇诱导。
先以3.0ml/L/h速度流加甲醇溶液(含PTM112ml/L)2小时，控制溶氧在50％以上，随着菌体逐步适应甲醇环境，再缓慢增加甲醇流量，最大流加甲醇速度为10.0ml/L/h，控制溶氧10％以上。整个甲醇诱导时间为110h，最终检测发酵液中的菌体活力为13459U/mL(国标方法测定)，然后结束发酵，放罐体积为11000L。
(6)将步骤(5)得到的发酵液中添加11kg聚乙烯胺、110kg环糊精，充分搅拌均匀后，再添加830kg玉米淀粉作为载体搅拌均匀，在不超过100℃下进行喷雾干燥，控制水分在10％以下，得到脂肪酶成品2493kg。
(7)耐温性能测定：
称取成品脂肪酶1克，精确至0.0002克，按照国标测定方法，稀释240000倍后(市售样稀释100000倍)，40℃，反应15分钟，测定酶活为48696.4U/g，再分别取1.2ml待测样液装1.5ml离心管，将其放在浮板上，分别放入65℃、75℃、85℃、95℃温度水浴锅，立刻计时5分钟，热处理完毕立刻取出放入自来水中冷却备用，以产品初始的酶活作为对照(100％)，计算相对酶活，85℃保温5min酶活性保留54％，结果见表3：
表3脂肪酶耐温性对照结果表