本发明涉及甜菊糖苷提取技术领域，尤其涉及一种微波-超声复合提取甜叶菊叶中甜菊糖苷的方法。
背景技术：
甜叶菊是原产于南美巴拉圭高原南纬25-26度之间的常绿小灌木，现已被世界各地引种，其叶片中含有一类甜叶菊糖苷物质，为一类四环二萜类衍生物，主要由甜菊苷、甜菊苷A、甜菊苷B和甜菊苷C等8种糖苷组成，其甜度大约是蔗糖的300倍。研究表明，甜叶菊糖苷具有高甜度、低热量、无明显毒副作用的特点，它可抑制高血糖和高血压，并有消炎、抗肿瘤、止泻利尿以及协助免疫调节的作用。目前，南美、日本和中国已把甜叶菊糖苷作为一种天然甜味剂广泛应用于食品和饮料中。甜叶菊糖苷在工业生产中的传统提取工艺有多种，包括热水提取法、透析法、酶法、超临界CO2提取法、超高压法、回流套提法、逆流法等，但是这些方法往往存在提取率低的缺陷。
技术实现要素：
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种微波-超声复合提取甜叶菊叶中甜菊糖苷的方法，其过程简单，条件温和，提取率高，得到的甜菊糖苷纯度高。
本发明提出的一种微波-超声复合提取甜叶菊叶中甜菊糖苷的方法，包括以下步骤：
S1、将甜叶菊叶用清水冲洗干净，然后置于无水乙醇中浸泡30-100min，取出后干燥至含水率为5-10wt％，粉碎后过筛得到甜叶菊叶粉；
S2、将甜叶菊叶粉与水按质量比为1:5-10的比例混合均匀，然后加入复合酶，其中，复合酶的质量为甜叶菊叶粉质量的0.2-0.25％，调节体系的pH值至7-8，然后微波加热至40-50℃，保温浸泡20-50min后升温至70-90℃，超声20-50min，过滤后得到提取液和滤渣；将滤渣与乙醚按质量比为1:3-5的比例加入离心机中，搅拌均匀后进行离心分离，其中，离心的速率为2000-3000r/min，离心的时间为25-60min，静置10-20min后收集上层清液，与提取液合并得到总提取液；
S3、将质量分数为20-30％的三氯化铁溶液、质量分数为20-30％的氢氧化钙溶液、质量分数为0.1-0.5％的聚丙烯酰胺溶液和总提取液按1-5:3-10：5-15：20-50的体积比混合均匀得到混合液，将混合液与质量分数为1-2％的硫酸铝溶液按5-15:1的体积比混合均匀，调节pH值为9-10后搅拌30-50min，然后进行超临界萃取得到萃取液，其中，在超临界萃取过程中，萃取的压力为0.6-1MPa，萃取的温度为90-120℃，萃取的时间为10-30min；
S4、将萃取液通过大孔树脂进行吸附，然后用质量分数为65-75％的乙醇洗脱至流出液无甜味，经减压蒸馏、浓缩、干燥得到甜菊糖苷粗品；
S5、将甜菊糖苷粗品加入水中，其中，水的重量为甜菊糖苷粗品重量的15-30倍，超声溶解后加入凹凸棒土搅拌均匀，其中，凹凸棒土的重量为甜菊糖苷粗品重量的0.1-0.5倍，调节体系的pH值为9-10后，在45-60℃下静置35-60min，经离心、浓缩、干燥得到所述甜菊糖苷。
优选地，在S1中，将甜叶菊叶用清水冲洗干净，然后置于无水乙醇中浸泡50-80min，取出后在60-70℃下干燥至含水率为5-6wt％，粉碎后过50-60目筛得到甜叶菊叶粉。
优选地，在S2中，所述复合酶为纤维素酶、果胶酶按重量比为5-10:1-3的混合物。
优选地，在S2中，在微波加热过程中，微波的功率为420-550W。
优选地，在S2中，在超声过程中，超声的功率为250-500W。
优选地，在S3中，搅拌30-50min的过程中，搅拌速率为50-60r/min。
优选地，所述微波-超声复合提取甜叶菊叶中甜菊糖苷的方法，包括以下步骤：
S1、将甜叶菊叶用清水冲洗干净，然后置于无水乙醇中浸泡60min，取出后在65℃下干燥至含水率为5.5wt％，粉碎后过55目筛得到甜叶菊叶粉；
S2、将甜叶菊叶粉与水按质量比为1:8的比例混合均匀，然后加入复合酶，其中，复合酶的质量为甜叶菊叶粉质量的0.23％，调节体系的pH值至7.5，然后微波加热至45℃，保温浸泡30min后升温至78℃，超声30min，过滤后得到提取液和滤渣；将滤渣与乙醚按质量比为1:4的比例加入离心机中，搅拌均匀后进行离心分离，其中，离心的速率为2500r/min，离心的时间为50min，静置25min后收集上层清液，与提取液合并得到总提取液；
S3、将质量分数为25％的三氯化铁溶液、质量分数为25％的氢氧化钙溶液、质量分数为0.35％的聚丙烯酰胺溶液和总提取液按3:6：10：35的体积比混合均匀，然后与质量分数为1.5％的硫酸铝溶液按10:1的体积比混合均匀，调节pH值为9后搅拌38min，然后进行超临界萃取得到萃取液，其中，在超临界萃取过程中，萃取的压力为0.7MPa，萃取的温度为100℃，萃取的时间为20min；
S4、将萃取液通过大孔树脂进行吸附，然后用质量分数为70％的乙醇洗脱至流出液无甜味，经减压蒸馏、浓缩、干燥得到甜菊糖苷粗品；
S5、将甜菊糖苷粗品加入水中，其中，水的重量为甜菊糖苷粗品重量的25倍，超声溶解后加入凹凸棒土搅拌均匀，其中，凹凸棒土的重量为甜菊糖苷粗品重量的0.25倍，调节体系的pH值为9后，在50℃下静置50min，经离心、浓缩、干燥得到所述甜菊糖苷。
优选地，在S5中，所述凹凸棒土为改性凹凸棒土；所述改性凹凸棒土按照以下工艺进行制备：将凹凸棒土加入浓度为5-10％的硫酸中酸化，然后在450-500℃下焙烧1-1.8h，研磨后过150-300目筛得到。
本发明中，首先对甜叶菊叶进行了冲洗并置于无水乙醇中浸泡，去除了甜叶菊叶表面的杂质，粉碎后加入了复合酶，对细胞壁的组成成分(纤维素、半纤维素和果胶质)进行水解或降解，配合微波和超声配合进行提取，最大程度的提高了甜菊糖甙的溶出量和收率，降低了叶渣中糖甙残留量，同时缩短了提取时间，降低了提取温度，避免了后续提取时甜叶菊叶中一些低温难溶物质如色素、果胶、纤维素等更多的溶出，有利于提高甜菊糖苷的纯度，通过控制复合酶的用量以及微波和超声的工艺参数，最大程度的保留了甜叶菊叶的有效成分，并提高了提取的重现性；之后加入了三氯化铁溶液、氢氧化钙溶液和聚丙烯酰胺溶液作为絮凝剂，并加入了硫酸铝，通过控制工艺参数，使絮凝剂的絮凝效果最佳，絮凝后的清液透光率最大，糖苷的损失率最小；之后用大孔树脂进行吸附并用凹凸棒土进行吸附，提高了甜菊糖苷的纯度和白度，使甜菊糖苷的纯度达到94.1％以上。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
本发明提出的一种微波-超声复合提取甜叶菊叶中甜菊糖苷的方法，包括以下步骤：
S1、将甜叶菊叶用清水冲洗干净，然后置于无水乙醇中浸泡30min，取出后干燥至含水率为10wt％，粉碎后过筛得到甜叶菊叶粉；
S2、将甜叶菊叶粉与水按质量比为1:5的比例混合均匀，然后加入复合酶，其中，复合酶的质量为甜叶菊叶粉质量的0.25％，调节体系的pH值至7，然后微波加热至50℃，保温浸泡20min后升温至90℃，超声20min，过滤后得到提取液和滤渣；将滤渣与乙醚按质量比为1:5的比例加入离心机中，搅拌均匀后进行离心分离，其中，离心的速率为2000r/min，离心的时间为60min，静置10min后收集上层清液，与提取液合并得到总提取液；
S3、将质量分数为30％的三氯化铁溶液、质量分数为20％的氢氧化钙溶液、质量分数为0.1％的聚丙烯酰胺溶液和总提取液按5:3：15：20的体积比混合均匀得到混合液，将混合液与质量分数为2％的硫酸铝溶液按5:1的体积比混合均匀，调节pH值为10后搅拌30min，然后进行超临界萃取得到萃取液，其中，在超临界萃取过程中，萃取的压力为1MPa，萃取的温度为90℃，萃取的时间为30min；
S4、将萃取液通过大孔树脂进行吸附，然后用质量分数为65％的乙醇洗脱至流出液无甜味，经减压蒸馏、浓缩、干燥得到甜菊糖苷粗品；
S5、将甜菊糖苷粗品加入水中，其中，水的重量为甜菊糖苷粗品重量的30倍，超声溶解后加入凹凸棒土搅拌均匀，其中，凹凸棒土的重量为甜菊糖苷粗品重量的0.5倍，调节体系的pH值为9后，在60℃下静置35min，经离心、浓缩、干燥得到所述甜菊糖苷。
实施例2
本发明提出的一种微波-超声复合提取甜叶菊叶中甜菊糖苷的方法，包括以下步骤：
S1、将甜叶菊叶用清水冲洗干净，然后置于无水乙醇中浸泡100min，取出后干燥至含水率为5wt％，粉碎后过筛得到甜叶菊叶粉；
S2、将甜叶菊叶粉与水按质量比为1:10的比例混合均匀，然后加入复合酶，其中，复合酶的质量为甜叶菊叶粉质量的0.2％，调节体系的pH值至8，然后微波加热至40℃，保温浸泡50min后升温至70℃，超声50min，过滤后得到提取液和滤渣；将滤渣与乙醚按质量比为1:3的比例加入离心机中，搅拌均匀后进行离心分离，其中，离心的速率为3000r/min，离心的时间为25min，静置20min后收集上层清液，与提取液合并得到总提取液；
S3、将质量分数为20％的三氯化铁溶液、质量分数为30％的氢氧化钙溶液、质量分数为0.5％的聚丙烯酰胺溶液和总提取液按1:10：5：50的体积比混合均匀得到混合液，将混合液与质量分数为1％的硫酸铝溶液按15:1的体积比混合均匀，调节pH值为9后搅拌50min，然后进行超临界萃取得到萃取液，其中，在超临界萃取过程中，萃取的压力为0.6MPa，萃取的温度为120℃，萃取的时间为10min；
S4、将萃取液通过大孔树脂进行吸附，然后用质量分数为75％的乙醇洗脱至流出液无甜味，经减压蒸馏、浓缩、干燥得到甜菊糖苷粗品；
S5、将甜菊糖苷粗品加入水中，其中，水的重量为甜菊糖苷粗品重量的15倍，超声溶解后加入凹凸棒土搅拌均匀，其中，凹凸棒土的重量为甜菊糖苷粗品重量的0.1倍，调节体系的pH值为10后，在45℃下静置60min，经离心、浓缩、干燥得到所述甜菊糖苷。
实施例3
本发明提出的一种微波-超声复合提取甜叶菊叶中甜菊糖苷的方法，包括以下步骤：
S1、将甜叶菊叶用清水冲洗干净，然后置于无水乙醇中浸泡80min，取出后在60℃下干燥至含水率为6wt％，粉碎后过50目筛得到甜叶菊叶粉；
S2、将甜叶菊叶粉与水按质量比为1:6的比例混合均匀，然后加入复合酶，其中，所述复合酶为纤维素酶、果胶酶按重量比为5:3的混合物，复合酶的质量为甜叶菊叶粉质量的0.24％，调节体系的pH值至7.2，然后微波加热至48℃，在微波加热过程中，微波的功率为550W，保温浸泡25min后升温至88℃，超声30min，超声的功率为250W，过滤后得到提取液和滤渣；将滤渣与乙醚按质量比为1:4.8的比例加入离心机中，搅拌均匀后进行离心分离，其中，离心的速率为2200r/min，离心的时间为55min，静置12min后收集上层清液，与提取液合并得到总提取液；
S3、将质量分数为23％的三氯化铁溶液、质量分数为28％的氢氧化钙溶液、质量分数为0.15％的聚丙烯酰胺溶液和总提取液按4:4：14：25的体积比混合均匀得到混合液，将混合液与质量分数为1.8％的硫酸铝溶液按6.8:1的体积比混合均匀，调节pH值为10后搅拌32min，其中，搅拌速率为60r/min，然后进行超临界萃取得到萃取液，其中，在超临界萃取过程中，萃取的压力为0.89MPa，萃取的温度为96℃，萃取的时间为28min；
S4、将萃取液通过大孔树脂进行吸附，然后用质量分数为68％的乙醇洗脱至流出液无甜味，经减压蒸馏、浓缩、干燥得到甜菊糖苷粗品；
S5、将甜菊糖苷粗品加入水中，其中，水的重量为甜菊糖苷粗品重量的28倍，超声溶解后加入凹凸棒土搅拌均匀，其中，凹凸棒土的重量为甜菊糖苷粗品重量的0.2倍，调节体系的pH值为10后，在50℃下静置55min，经离心、浓缩、干燥得到所述甜菊糖苷；其中所述凹凸棒土为改性凹凸棒土；所述改性凹凸棒土按照以下工艺进行制备：将凹凸棒土加入浓度为5％的硫酸中酸化，然后在500℃下焙烧1h，研磨后过300目筛得到
实施例4
本发明提出的一种微波-超声复合提取甜叶菊叶中甜菊糖苷的方法，包括以下步骤：
S1、将甜叶菊叶用清水冲洗干净，然后置于无水乙醇中浸泡50min，取出后在70℃下干燥至含水率为5wt％，粉碎后过60目筛得到甜叶菊叶粉；
S2、将甜叶菊叶粉与水按质量比为1:9的比例混合均匀，然后加入复合酶，其中，所述复合酶为纤维素酶、果胶酶按重量比为10:1的混合物，复合酶的质量为甜叶菊叶粉质量的0.22％，调节体系的pH值至7.8，然后微波加热至42℃，在微波加热过程中，微波的功率为420W，保温浸泡45min后升温至75℃，超声48min，超声的功率为500W，过滤后得到提取液和滤渣；将滤渣与乙醚按质量比为1:3.2的比例加入离心机中，搅拌均匀后进行离心分离，其中，离心的速率为2800r/min，离心的时间为30min，静置18min后收集上层清液，与提取液合并得到总提取液；
S3、将质量分数为28％的三氯化铁溶液、质量分数为22％的氢氧化钙溶液、质量分数为0.45％的聚丙烯酰胺溶液和总提取液按2:9：7：43的体积比混合均匀得到混合液，将混合液与质量分数为1.2％的硫酸铝溶液按13:1的体积比混合均匀，调节pH值为9后搅拌47min，其中，搅拌速率为50r/min，进行超临界萃取得到萃取液，其中，在超临界萃取过程中，萃取的压力为0.65MPa，萃取的温度为114℃，萃取的时间为14min；
S4、将萃取液通过大孔树脂进行吸附，然后用质量分数为73％的乙醇洗脱至流出液无甜味，经减压蒸馏、浓缩、干燥得到甜菊糖苷粗品；
S5、将甜菊糖苷粗品加入水中，其中，水的重量为甜菊糖苷粗品重量的20倍，超声溶解后加入凹凸棒土搅拌均匀，其中，凹凸棒土的重量为甜菊糖苷粗品重量的0.4倍，调节体系的pH值为9后，在58℃下静置40min，经离心、浓缩、干燥得到所述甜菊糖苷；其中，所述凹凸棒土为改性凹凸棒土；所述改性凹凸棒土按照以下工艺进行制备：将凹凸棒土加入浓度为10％的硫酸中酸化，然后在450℃下焙烧1.8h，研磨后过150目筛得到。
实施例5
本发明提出的一种微波-超声复合提取甜叶菊叶中甜菊糖苷的方法，包括以下步骤：
S1、将甜叶菊叶用清水冲洗干净，然后置于无水乙醇中浸泡60min，取出后在65℃下干燥至含水率为5.5wt％，粉碎后过55目筛得到甜叶菊叶粉；
S2、将甜叶菊叶粉与水按质量比为1:8的比例混合均匀，然后加入复合酶，其中，所述复合酶为纤维素酶、果胶酶按重量比为7:2的混合物，复合酶的质量为甜叶菊叶粉质量的0.23％，调节体系的pH值至7.5，然后微波加热至45℃，在微波加热过程中，微波的功率为480W，保温浸泡30min后升温至78℃，超声30min，超声的功率为380W，过滤后得到提取液和滤渣；将滤渣与乙醚按质量比为1:4的比例加入离心机中，搅拌均匀后进行离心分离，其中，离心的速率为2500r/min，离心的时间为50min，静置25min后收集上层清液，与提取液合并得到总提取液；
S3、将质量分数为25％的三氯化铁溶液、质量分数为25％的氢氧化钙溶液、质量分数为0.35％的聚丙烯酰胺溶液和总提取液按3:6：10：35的体积比混合均匀得到混合液，将混合液与质量分数为1.5％的硫酸铝溶液按10:1的体积比混合均匀，调节pH值为9后搅拌38min，其中，搅拌速率为55r/min，然后进行超临界萃取得到萃取液，其中，在超临界萃取过程中，萃取的压力为0.7MPa，萃取的温度为100℃，萃取的时间为20min；
S4、将萃取液通过大孔树脂进行吸附，然后用质量分数为70％的乙醇洗脱至流出液无甜味，经减压蒸馏、浓缩、干燥得到甜菊糖苷粗品；
S5、将甜菊糖苷粗品加入水中，其中，水的重量为甜菊糖苷粗品重量的25倍，超声溶解后加入凹凸棒土搅拌均匀，其中，凹凸棒土的重量为甜菊糖苷粗品重量的0.25倍，调节体系的pH值为9后，在50℃下静置50min，经离心、浓缩、干燥得到所述甜菊糖苷；其中，所述凹凸棒土为改性凹凸棒土；所述改性凹凸棒土按照以下工艺进行制备：将凹凸棒土加入浓度为8％的硫酸中酸化，然后在480℃下焙烧1.5h，研磨后过220目筛得到。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。