本发明涉及一种具有多臂结构的聚谷氨酸、可注射用水凝胶及其制备方法，特别是一种以β-环糊精为核的多臂聚谷氨酸、可注射用水凝胶及其制备方法。
背景技术：
水凝胶是由三维网状结构高分子及包含在其中的水分子组成，其通过化学或物理交联凝胶化形成，具有良好的生物相容性、降解性。其中可注射水凝胶在组织工程领域得到广泛的关注，可注射水凝胶可被用于生物活性分子的控制释放、包埋细胞以及作为组织支架材料等。可注射水凝胶通过注射的方式填充体内缺损并原位固化成型，可避免外科手术的高度创伤，具有加速愈合、减少病人痛苦、降低医疗费用的优点。可注射水凝胶因具有自适应性而特别适用于复杂缺损形状的组织修复；同时可注射水凝胶负载的药物不易失活，可达到减少给药次数、延长药物作用周期的效果，在药物控释领域有良好的应用前景。
聚L-谷氨酸是一种具有良好生物相容性的聚氨基酸，然而聚L-谷氨酸水凝胶因其亲水性而难以有效负载疏水性药物。而β-环糊精拥有疏水性空腔特性使其被广泛用于疏水药物的负载。
技术实现要素：
本发明的目的之一在于提供一种以β-环糊精为核的多臂聚谷氨酸。
本发明的目的之二在于采用该醛基化多臂聚谷氨酸为第一组分，以氨基化聚谷氨酸作为第二组分，通过席夫碱反应得到可注射水凝胶。
本发明的目的之三在于提供该水凝胶的制备方法。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种以β-环糊精为核的多臂聚谷氨酸，其特征在于该多臂聚谷氨酸是由多氨基化的β-环糊精作为引发剂，引发L-谷氨酸-N-羧酸酐开环聚合形成臂而得到的接枝共聚物，其中臂的个数为3~5；所述的臂的结构式为：
，10≦n≦40。
一种可注射用的水凝胶，以上述的以β-环糊精为核的多臂聚谷氨酸经醛基化后作为第一组分，以氨基化聚L-谷氨酸作为第二组分，其特征在于该水凝胶是第一组份和第二组份通过席夫碱反应交联形成具有三维交联结构的高分子水凝胶，其固含量为1～10%；所述的第二组份的氨基的总摩尔数与第一组份的醛基的总摩尔数的比为：1：1~3。
一种制备上述的可注射水凝胶的方法，其特征在于该方法的具体步骤：
a. 将β-环糊精和N', N-羰基二咪唑按1：8~15的摩尔比溶解于二甲基亚砜DMSO中，在室温及惰性气体保护条件下搅拌24~36小时，倒入乙醇中，搅拌至产生白色固体，过滤后干燥，将干燥后的粉末溶于少量去离子水，并在透析24h~48h后进行冷冻干燥得到多氨基化β-环糊精；
b. 将步骤a所得多氨基化β-环糊精、L-谷氨酸-N- 羧酸酐以1：20~160 的摩尔比分散于DMSO中，分散浓度按照每克L-谷氨酸-N- 羧酸酐加入1~10mlDMSO；在15～35℃下搅拌反应48～72h，体系变乳白色并且粘稠；将反应液倒入无水乙醇中搅拌，有白色絮状物析出；过滤然后用无水乙醇洗涤、干燥，得到以β-环糊精为核的多臂聚谷氨酸苄酯；
c. 将步骤b所得的以β-环糊精为核的多臂聚谷氨酸苄酯溶于无水二氯甲烷，配制成浓度为0.01~0.05g/ml的溶液，然后加入脱保护剂，每0.5～1.0 g以β-环糊精为核的多臂聚L-谷氨酸苄酯加入0.3～0.5mL 脱保护剂；在惰性气体保护下于35～40℃避光条件下反应12～20h，将反应液倒入石油醚中沉降，经抽滤、石油醚洗涤、真空干燥得到白色固体，即为以β-环糊精为核的多臂聚谷氨酸；
d. 将步骤c所得的以β-环糊精为核的多臂聚谷氨酸和氨基丙二醇按0.1g：（0.1~0.5）mL的质量体积比配制成水溶液，再加入活化剂1-羟基苯并三唑HOBT 或者N-羟基琥珀酰亚胺NHS，以活化聚谷氨酸链段上的羧基；反应5～24h后通过去离子水透析除去的小分子杂质，取出冻干后将得到的产物；所述的以β-环糊精为核的多臂聚谷氨酸中臂上的聚谷氨酸的重复结构单元的摩尔数与活化剂的摩尔数的比为1：1~5；
e. 将步骤d所得产物溶于去离子水中，在室温下加入氧化剂，氧化剂的摩尔数为步骤d中被改性的羧基摩尔数的10~20%，反应5~10min后再次透析、冻干后得到所需的第一组分，即经醛基化后的以β-环糊精为核的多臂聚谷氨酸；
f. 将聚L-谷氨酸溶于水中，加入碳二亚胺活化剂搅拌溶解，所述的聚L-谷氨酸重复结构单元的摩尔数与碳二亚胺活化剂的摩尔数的比为1：1~5，以活化聚谷氨酸链段上的羧基；加入氨化剂反应5～24h；再通过去离子水透析除去的小分子杂质，取出冻干后得到所需的第二组分；所述的碳二亚胺活化剂与聚L-谷氨酸重复结构单元数的摩尔比为1～3：1；所述的氨化剂为己二胺、乙二胺、对苯二胺、己二酸二酰肼、顺丁烯二酰肼或癸二酸二酰肼，氨化剂的摩尔数与聚L-谷氨酸结构单元的摩尔数的比为3～10：1；
g. 将步骤e所得醛基化的多臂聚谷氨酸和步骤f所得的第二组份氨基化的聚L-谷氨酸分别配制成水溶液，溶液的浓度为1~10wt%，两组分混合后通过席夫碱反应原位交联得到可注射水凝胶；
上述的脱保护剂为：三甲基碘硅烷、三甲基氯硅烷、三甲基溴硅烷的任一种。
上述的氧化剂为高碘酸钠、重铬酸钾或双氧水。
本发明的水凝胶具有良好的生物相容性和生物降解性，能够适应不同的形状。另外β-环糊精的引入，可增加交联点，有利于提高水凝胶的机械强度，并且能够对疏水药物进行负载和控制释放。因此该水凝胶在组织工程和再生医学、药物控释等领域有广阔的应用前景。
具体实施方式
下面结合实例对本发明进行详细描述。
实施例一：
1.取一干燥的圆底烧瓶（100mL），加入DMSO（20mL）和β-环糊精（0.88 mmoL），搅拌充分溶解后加入CDI (7.04mmoL)，在惰性气体保护下反应12~24h，随后加入乙二胺（2.4mL）并继续反应12~24h，将反应液倒入过量的无水乙醇后析出大量的白色物质，将产物过滤干燥后溶于去离子水中，经过去离子水透析后冻干可得到约0.5g的白色产物，即为多氨基β-环糊精，其结构式为：
其中R的结构式为：
。
2.在一无水的圆底烧瓶（100mL）内放入多氨基β-环糊精（0.5g），加入无水DMSO(125mL)，溶解后加入L-谷氨酸-N-羧酸酐（3.2g），抽真空通氮气，在室温下搅拌反应72h。在玻璃棒搅拌下，将此反应液倒入无水乙醇（500mL）中，有大量白色絮状物质析出。过滤并且真空干燥后得到的产物即为以β-环糊精为核的多臂聚谷氨酸苄酯，其结构式为：
其中R的结构式为：
，10≦n≦40 。
3. 采用三甲基碘硅烷脱去聚L-谷氨酸苄酯的苄基制备聚L-谷氨酸：室温下，取以β-环糊精为核的多臂聚谷氨酸苄酯0.5克溶于无水二氯甲烷中，再加入三甲基碘硅烷（25mL）的比例加入，在35~40℃集热式搅拌器中反应10~12h，自然冷却后，加入到石油醚中沉降，过滤并反复用石油醚和蒸馏水分别洗涤三遍，真空干燥24h，得到白色块状物质，即为以β-环糊精为核的多臂聚L-谷氨酸，平均分子量约为6600道尔顿；其结构式为：
其中R的结构式为：
，10≦n≦40 。
其平均分子量的测试方法采用粘度法，具体过程为：配制NaCl和NaH2PO4的混合溶液。NaCl和NaH2PO4的浓度分别为0.4mol/L和0.01mol/L。以上述混合溶液为溶剂配制浓度为1mg/mL的多臂聚L-谷氨酸的稀溶液。实验温度为25℃，pH=6.8，分子量计算公式为[η]=2.93×10-5M0.923。
3.将以β-环糊精为核的多臂聚L-谷氨酸（0.1g），倒入去离子水（20mL）中并滴加氢氧化钠溶液（3M）得到其水溶液，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（0.42g）、1-羟基苯并三唑（0.18g）与氨基丙二醇（0.1mL）反应12小时，透析冻干，得到的产物溶于去离子水（20mL）中，加入高碘酸钠（0.15g）避光氧化5min后加入乙二醇（2μL），在反应12h后将反应液透析并冻干得到醛基化的多臂聚L-谷氨酸；其结构式为：
其中R的结构式为：
，10≦n+m≦40 。
4.称取0.1g聚L-谷氨酸，倒入去离子水（20mL）中并滴加氢氧化钠溶液（3M）得到其水溶液，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（0.42g）、1-羟基苯并三唑（0.18g）与己二酰二肼（0.4g），取出透析冻干得到氨基化聚L-谷氨酸。
5. 分别将醛基化的多臂聚谷氨酸与氨基化聚L-谷氨酸配制成6wt%的溶液，等体积混合，获得水凝胶，成胶时间75s，该成胶时间为两组分相混合后自制液体凝固不在流动所需要的时间。储能模量为78Pa（旋转流变仪，37℃，剪切应变: 1%，角频率范围: 0.1~500rad-1）。
实施例二：
本实施例的醛基化的多臂聚L-谷氨酸的制备与实施例一基本相同，所不同的是：在步骤2中，加入多氨基β-环糊精（1.0g），加入DMSO(125mL)，溶解后加入L-谷氨酸-N-羧酸酐（3.2g）。最终得到的多臂聚L-谷氨酸，平均分子量约为2200道尔顿。其他试剂用量及操作条件不变。最后得到的可注射水凝胶，成胶时间81s，储能模量为81Pa。
实施例三：
本实施例的醛基化的多臂聚L-谷氨酸的制备与实施例一基本相同，所不同的是：在步骤2中，加入多氨基β-环糊精（0.25g），加入DMSO(125mL)，溶解后加入L-谷氨酸-N-羧酸酐（3.2g）。最终得到的多臂聚L-谷氨酸，平均分子量约为11000道尔顿。其他试剂用量及操作条件不变。最后得到的可注射水凝胶，成胶时间86s，储能模量为196Pa。
实施例四：
本实施例与实施例二基本相同，所不同的是：在步骤5中，分别将改性多臂聚L-谷氨酸与改性聚L-谷氨酸配制成7wt%的溶液，等体积混合，获得水凝胶，成胶时间88s，储能模量为446Pa。
实施例五：
本实施例与实施例二基本相同，所不同的是：在步骤5中，分别将改性多臂聚L-谷氨酸与改性聚L-谷氨酸配制成8wt%的溶液，等体积混合，获得水凝胶，成胶时间73s，储能模量为576Pa。
实施例二、实施例三要分别给出臂数不同的多臂聚谷氨酸胶束的制备过程，并给出以β-环糊精为核的多臂聚谷氨酸的表征参数。实施例2和实施例3中并非改变多臂聚L-谷氨酸的臂数而是改变臂长，也就是臂上的重复单元数，这种调控只需要通过调节多氨基环糊精与L-谷氨酸-N-羧酸酐的摩尔比便可实现，其他的实验步骤不变。
以β-环糊精为核的多臂聚谷氨酸平均分子量的测试方法采用粘度法，具体过程为：配制NaCl和NaH2PO4的混合溶液。NaCl和NaH2PO4的浓度分别为0.4mol/L和0.01mol/L。以上述混合溶液为溶剂配制浓度为1mg/mL的多臂聚L-谷氨酸的稀溶液。实验温度为25℃，pH=6.8，分子量计算公式为[η]=2.93×10-5M0.923。