1.一种基于CRISPR/Cas9系统构建TCR-/PD-1-双阴性T细胞的sgRNA,其特征在于:靶向人TCR-α基因的sgRNA序列选自SEQ ID NO:1~15中的任意一种,靶向人PD-1基因的sgRNA序列选自SEQ ID NO:16~33中的任意一种。
2.一种基于CRISPR/Cas9系统构建TCR-/PD-1-双阴性T细胞的sgRNA,其特征在于:靶向人TCR-α基因的sgRNA序列选自SEQ ID NO:1~4中的任意一种,靶向人PD-1基因的sgRNA序列选自SEQ ID NO:16~19中的任意一种。
3.一种基于CRISPR/Cas9系统构建TCR-/PD-1-双阴性T细胞的sgRNA,其特征在于:靶向人TCR-α基因的sgRNA序列的反向互补DNA为SEQ ID NO:34~48中的任意一种,靶向人PD-1基因的sgRNA序列的反向互补DNA为SEQ ID NO:49~66中的任意一种。
4.一种基于CRISPR/Cas9系统构建TCR-/PD-1-双阴性T细胞的sgRNA,其特征在于:靶向人TCR-α基因的sgRNA序列的反向互补DNA为SEQ ID NO:34~37中的任意一种,靶向人PD-1基因的sgRNA序列的反向互补DNA为SEQ ID NO:49~52中的任意一种。
5.一种基于CRISPR/Cas9系统构建TCR-/PD-1-双阴性T细胞的DNA寡核苷酸,其特征在于:靶向人TCR-α基因的sgRNA所对应的DNA寡核苷酸选自由SEQ ID NO:67和68互补配对形成的双链DNA寡核苷酸、由SEQ ID NO:69和70互补配对形成的双链DNA寡核苷酸、由SEQ ID NO:71和72互补配对形成的双链DNA寡核苷酸、由SEQ ID NO:73和74互补配对形成的双链DNA寡核苷酸中的任意一种;
靶向人PD-1基因的sgRNA所对应的DNA寡核苷酸选自由SEQ ID NO:75和76互补配对形成的双链DNA寡核苷酸、由SEQ ID NO:77和78互补配对形成的双链DNA寡核苷酸、由SEQ ID NO:79和80互补配对形成的双链DNA寡核苷酸、由SEQ ID NO:81和82互补配对形成的双链DNA寡核苷酸中的任意一种。
6.一种TCR-/PD-1-双阴性T细胞的构建方法,其特征在于:包括以下步骤:
1)分别构建CRISPR/Cas9-TCR-sgRNA和CRISPR/Cas9-PD1-sgRNA载体
CRISPR/Cas9-TCR-sgRNA载体的构建:将权利要求5所述的靶向人TCR-α基因的sgRNA所对应的DNA寡核苷酸与线性化的骨架载体进行连接,重组载体CRISPR/Cas9-TCR-sgRNA;
CRISPR/Cas9-PD1-sgRNA载体的构建:将权利要求5所述的靶向人PD-1基因的sgRNA所对应的DNA寡核苷酸与线性化的骨架载体进行连接,重组载体CRISPR/Cas9-PD1-sgRNA;
2)TCR-/PD-1-双阴性T细胞的获得:将分离的外周血单核细胞激活成T细胞,然后将上步制得的载体CRISPR/Cas9-TCR-sgRNA和CRISPR/Cas9-PD1-sgRNA共同转染T细胞,对转染后T细胞进行分离纯化,即可获得TCR-/PD-1-双阴性T细胞。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于:所述骨架载体选自px601-AAV-CMV、px602-AAV-CMV、px603-AAV-CMV、px552中的一种。
8.TCR-/PD-1-双阴性T细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。
9.TCR-/PD-1-双阴性T细胞在制备防治病毒或细菌引起的感染性疾病药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于:所述病毒或细菌引起的感染性疾病包括乙肝病毒引起的乙型肝炎、HIV病毒引起的艾滋病。