1.一种利用含凝块的恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)含凝块的恶性胸腹水的收集:无菌条件下,收集含凝块的恶性胸腹水,并加入肝素,使得所述恶性胸腹水中含有所述肝素的浓度为11.0~16.5U/mL;
(2)含凝块的恶性胸腹水中游离细胞与凝块的分离:将所述含凝块的恶性胸腹水进行过滤,使恶性胸腹水中的凝块与游离细胞分离,得游离细胞-A;
(3)凝块的分解与游离细胞的释放:将所述凝块置于AIM-V完全培养基-Ⅰ中在适宜的条件下培养3~5天,过滤,得游离细胞-B;
(4)单个核细胞的分离:将所述游离细胞-A和所述游离细胞-B分别移入离心管中,离心,弃去上清液;将沉淀细胞重悬,平铺于比重为1.076~1.078的Ficoll分层液上,离心;
(5)单个核细胞的洗涤:收集Ficoll分层液界面上的单个核细胞,加入AIM-V无血清培养基,混匀,离心,弃去上清液;
(6)TIL细胞的定向诱导活化:用所述AIM-V完全培养基-Ⅰ重悬细胞,并调节细胞密度为1.5×106~3.0×106个/mL,在适宜的条件下培养4~6天,培养期间用所述AIM-V完全培养基-Ⅰ半量换液至少1次;
(7)TIL细胞的优势扩增:从培养第5~7天起,用AIM-V完全培养基-Ⅱ重悬细胞,并调节细胞密度为1.0×106~2.0×106个/mL,在适宜的条件下继续培养,每日进行细胞计数并用所述AIM-V完全培养基-Ⅱ将细胞密度调整为1.0×106~2.0×106个/mL;
(8)TIL细胞的收集:培养第21~28天时,收集细胞悬液,离心,用0.9%NaCl溶液洗涤,将细胞重悬于0.9%NaCl混合溶液中,备用。
2.根据权利要求1所述的利用含凝块的恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法,其特征在于,
所述步骤(3)凝块的分解与游离细胞的释放和步骤(6)TIL细胞的定向诱导活化中,所述AIM-V完全培养基-Ⅰ含有IFN-γ、IL-2和灭活血清;
所述步骤(7)TIL细胞的优势扩增中,所述AIM-V完全培养基-Ⅱ含有IL-2、IFN-γ、抗CD3单克隆抗体和灭活血清。
3.根据权利要求1或2所述的利用含凝块的恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)含凝块的恶性胸腹水的收集:无菌条件下,收集含凝块的恶性胸腹水,并加入肝素,使得所述恶性胸腹水中含有所述肝素的浓度为12.5~15.0U/mL;
(2)含凝块的恶性胸腹水中游离细胞与凝块的分离:将所述含凝块的恶性胸腹水进行过滤,使恶性胸腹水中的凝块与游离细胞分离,得游离细胞-A;
(3)凝块的分解与游离细胞的释放:将所述凝块置于AIM-V完全培养基-Ⅰ中在适宜的条件下培养3~5天,过滤,得游离细胞-B;
(4)单个核细胞的分离:将所述游离细胞-A和所述游离细胞-B分别移入离心管中,离心,弃去上清液;将沉淀细胞重悬,平铺于比重为1.077的Ficoll分层液上,离心;
(5)单个核细胞的洗涤:收集Ficoll分层液界面上的单个核细胞,加入AIM-V无血清培养基,混匀,离心,弃去上清液;
(6)TIL细胞的定向诱导活化:用所述AIM-V完全培养基-Ⅰ重悬细胞,并调节细胞密度为2.2×106个/mL,在适宜的条件下培养5天,培养期间用所述AIM-V完全培养基-Ⅰ半量换液1次;
(7)TIL细胞的优势扩增:从培养第6天起,用AIM-V完全培养基-Ⅱ重悬细胞,并调节细胞密度为1.5×106个/mL,在适宜的条件下继续培养,每日进行细胞计数并用所述AIM-V完全培养基-Ⅱ将细胞密度调整为1.5×106个/mL;
(8)TIL细胞的收集:培养第21~28天时,收集细胞悬液,离心,用0.9%NaCl溶液洗涤,将细胞重悬于0.9%NaCl混合溶液中,备用。
4.根据权利要求1-3任一项所述的利用含凝块的恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法,其特征在于,
所述步骤(3)凝块的分解与游离细胞的释放和步骤(6)TIL细胞的定向诱导活化中,所述AIM-V完全培养基-Ⅰ含有500~1000U/mL IFN-γ、10~100U/mL IL-2和3%灭活血清;
所述步骤(7)TIL细胞的优势扩增中,所述AIM-V完全培养基-Ⅱ含有500~2000U/mL IL-2、100~300U/mL IFN-γ、20~50ng/mL抗CD3单克隆抗体和3%灭活血清。
5.根据权利要求1-4任一项所述的利用含凝块的恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法,其特征在于,
所述步骤(4)单个核细胞的分离中,用AIM-V无血清培养基、RPMI1640无血清培养基或PBS缓冲液将沉淀细胞重悬。
6.根据权利要求1-5任一项所述的利用含凝块的恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法,其特征在于,
所述步骤(5)单个核细胞的洗涤中,所述单个核细胞为淋巴细胞、DC细胞和肿瘤细胞的混合物。
7.根据权利要求1-6任一项所述的利用含凝块的恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法,其特征在于,
所述步骤(5)单个核细胞的洗涤中,还包括重复至少一次以下步骤:加入AIM-V无血清培养基重悬细胞,混匀,离心,弃去上清液。
8.根据权利要求1-7任一项所述的利用含凝块的恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法,其特征在于,
所述步骤(8)TIL细胞的收集中,所述0.9%NaCl混合溶液含有IL-2、人血Alb和葡萄糖。
9.根据权利要求1-8任一项所述的利用含凝块的恶性胸腹水大量制备高杀伤活性TIL细胞的方法,其特征在于,
所述步骤(8)TIL细胞的收集中,所述0.9%NaCl混合溶液含有1000U/mL IL-2、3%人血Alb和6mM葡萄糖。
10.权利要求1-9任一项所述的方法制备得到的TIL细胞。