水痘带状疱疹病毒gE抗原及其在检测抗水痘带状疱疹病毒抗体中的用途的制作方法

本发明涉及抗体的免疫检测领域，特别是抗水痘带状疱疹病毒抗体、尤其是中和抗体的免疫检测领域。

背景技术：

水痘是由水痘带状疱疹病毒(varicella-zoster virus， VZV)原发感染引起的疾病。水痘属于高传染性疾病，在世界范围流行性传播。水痘的易感人群主要是儿童，其特征为全身性疱疹并常伴有发热症状。对于绝大多数具有正常免疫能力的儿童而言，水痘属于一种良性的自限性疾病；但是对于因各种原因导致免疫功能低下的人群，VZV感染可能引起严重的、甚至是致命的疾病。研究表明，自然感染或免疫接种水痘减毒活疫苗后，机体可以再次被水痘病毒感染或激活而不产生任何临床症状，临床上二次感染水痘较罕见。

VZV属疱疹病毒科疱疹病毒亚科，为双链DNA病毒。VZV呈现为典型的脂质双层结构。基因组为线性双链DNA分子，由大约124884个碱基对组成，分子量为(80±3)×106道尔顿。该病毒基因组由71个开放读码框(ORF)组成，编码约69种蛋白质。基因产物按立即早期基因(IE)、早期基因(E)、晚期基因(L)顺序进行表达。L基因编码一些结构蛋白，如衣壳蛋白及糖蛋白。VZV病毒基因至少编码9种糖蛋白：gE、gB、gH、gI、gC、gL、gK、gM、gN，他们主要存在于病毒囊膜和感染细胞的细胞膜中，与病毒的致病性和免疫原性有着密切关系。

国内关于水痘方面的研究往往限于疫苗的研制和开发，而缺乏大范围人群正式使用后的评估。只有从病人及人群进行研究才能更好地对疫苗免疫效果进行评估，并且经临床试验证明有效的疫苗应继续进行上市后大规模人群应用后的研究，这样能得到真实的保护效果状况。随着接种水痘疫苗人数的增加，现在迫切需要一种快速、简便同时具有高灵敏度、高特异性优点的检测抗VZV抗体的方法，以此来判断接种疫苗后个体对VZV的敏感度以及对疫苗的免疫应答状况。目前检测VZV抗体的方法主要有酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、兔抗糖蛋白抗体ELISA(gpELISA)、膜抗原荧光抗体测定(fluorescent antibody to membrane antigen assay，FAMA)、间接荧光抗体试验(indirect fluorescent-antibody technique，IFAT)、补体结合试验(CF)、免疫吸附血凝试验((immune adherence hemagglutination assay，IAHA)、放射免疫法(radio immunoassay，RIA)、中和试验(ENT)、乳胶凝集试验(LA)等，其中最常用的是FAMA和ELISA法。

FAMA法是目前进行血清中抗体检测的金标准，是检测人群VZV抗体水平最佳的方法，可以较准确的确定免疫效果，已经成为评价其他方法的标准。FAMA法在VZV与其它疱疹病毒一起时，并不会出现交叉性反应，特异性良好，特别是在血清中抗VZV血清抗体水平比较低时灵敏度也较高，很适合用于疫苗免疫后血清学的评价。但FAMA法存在一些缺点，例如反应时间长，操作繁琐，不能实现自动化、标准化、不宜检测大批量样本，这使FAMA法不适合大批量的检测血清，无法广泛使用。

由于ELISA操作简单、快速，并且可进行大批量检测，因此它是目前使用最为广泛的方法。ELISA检测特异性 IgG抗体水平应用广，ELISA间接法具有方法简单、准确度高、无需特殊仪器等特点，通过包被纯化的表位抗原，以WHO VZV血清抗体参考品为标准品，建立了定量检测抗VZV中和抗体的 ELISA 方法。但目前市售的ELISA试剂盒采用的是全病毒抗原包被，因此敏感性较差。血清学方法检测VZV抗体对于易感人群的确定和鉴别、水痘疫苗免疫策略的研究以及疫苗免疫效果的评价具有重要意义。

技术实现要素：

本发明经过对VZV病毒基因组以及表达蛋白进行分析找到了能够特异性检测抗VZV抗体的gE抗原，并且基于所发现的gE抗原可以实现特异性检测人血中抗VZV抗体。

具体而言，在本发明的一个方面中，涉及一种检测抗水痘带状疱疹病毒抗体、尤其是中和抗体的水痘带状疱疹病毒gE抗原，其中所述抗原选自如下氨基酸序列中的一种或一种以上：a. SEQ ID NO.1所示序列，或者通过氨基酸替换、缺失或者增加而与SEQ IDNO.1具有80%以上相似性的序列，或者包含SEQ ID NO.1所示序列或者通过氨基酸替换、缺失或者增加而与SEQ IDNO.1具有80%以上相似性的序列的序列；b. SEQ ID NO.2所示序列，或者通过氨基酸替换、缺失或者增加而与SEQ IDNO.2具有80%以上相似性的序列，或者包含SEQ ID NO.2所示序列或者通过氨基酸替换、缺失或者增加而与SEQ IDNO.2具有80%以上相似性的序列的序列。

在本发明的另一个方面中，涉及上述水痘带状疱疹病毒gE抗原在检测抗水痘带状疱疹病毒抗体、尤其是中和抗体中的用途。在该方面的一些实施方案中使用上述水痘带状疱疹病毒gE抗原通过免疫检测方法检测所述抗水痘带状疱疹病毒抗体、尤其是中和抗体，免疫检测方法例如酶联免疫法、放射免疫法、荧光免疫法、化学发光法、胶体金法、乳胶法以及其它方法，并且其中酶联免疫法例如酶联免疫吸附测定法，荧光免疫法例如时间分辨荧光免疫法。

在本发明的再一个方面中，涉及测定抗水痘带状疱疹病毒抗体、尤其是中和抗体的试剂盒，所述试剂盒包括检测抗水痘带状疱疹病毒抗体、尤其是中和抗体的水痘带状疱疹病毒gE抗原，其中所述抗原选自如下氨基酸序列中的一种或一种以上：a. SEQ ID NO.1所示序列，或者通过氨基酸替换、缺失或者增加而与SEQ IDNO.1具有80%以上相似性的序列，或者包含SEQ ID NO.1所示序列或者通过氨基酸替换、缺失或者增加而与SEQ IDNO.1具有80%以上相似性的序列的序列；b. SEQ ID NO.2所示序列，或者通过氨基酸替换、缺失或者增加而与SEQ IDNO.2具有80%以上相似性的序列，或者包含SEQ ID NO.2所示序列或者通过氨基酸替换、缺失或者增加而与SEQ IDNO.2具有80%以上相似性的序列的序列。除此之外，试剂盒还包括免疫诊断方法例如酶联免疫法、放射免疫法、荧光免疫法、化学发光法、胶体金法或乳胶法等通常所使用的其它试剂。所述的这些试剂例如是检测人IgG、IgM或者IgA的试剂，诸如羊或兔抗人IgG、IgM或IgA的抗体等。

附图说明

图1是描述水痘带状疱疹病毒gE序列抗原性分析的图。

图2显示3种水痘带状疱疹病毒gE抗原纯化后的SDS-PAGE图。

具体实施方式

VZV的gE也称作gpI，是由ORF68编码的包含623个氨基酸的糖蛋白，分子量为60kDa-98kDa，具有典型的I型跨膜蛋白结构，包括一个544aa的亲水性胞外区、17aa的疏水性跨膜区和62aa的富含电荷的胞内区。VZVⅠ型糖蛋白是VZV所有糖蛋白中表达量最大的。gE蛋白主要分布在病毒颗粒的包膜以及感染VZV的细胞质和细胞膜上。基于此，本发明人认为gE糖蛋白可能是潜在的VZV抗体检测用抗原。

目前，水痘带状疱疹病毒中和抗体的检测多以血凝试验检测为主，通过检测待测血清能否抑制由水痘带状疱疹病毒引发的红细胞的凝集作用，确定水痘带状疱疹病毒中和抗体的存在。但该检测过程中使用具有强传染能力的水痘带状疱疹病毒，具有极大的危险性。因此本领域急需一种不使用水痘带状疱疹病毒的检测抗VZV抗体、尤其是中和抗体的安全有效的方法。

为了实现对接种水痘疫苗后人群中是否产生抗VZV抗体、尤其是中和抗体进行安全有效的检测，本发明人基于上述gE的特点确定尝试使用gE糖蛋白抗原对VZV抗体、尤其是中和抗体进行检测。首先本发明人对gE的抗原表位进行了生物信息学研究，找到了3段可能的高抗原性的抗原片段，即SEQ ID NO.1、2或3所示序列，并对该3段gE抗原进行了克隆表达，并且基于间接酶联免疫技术使用水痘疫苗接种者血清对3种纯化后的抗原片段的抗原特异性和灵敏度进行检验，结果发现此3段抗原中片段1（20-100aa），2（101-190aa）能特异性地检测感染水痘带状疱疹病毒或者接种水痘疫苗后人体内的抗VZV抗体，尤其是中和抗体。

本领域众所周知，与某一个抗原片段具有一定相似性的另一个氨基酸序列片段会具有相同或相似的免疫反应，因此通常认为，通过替换、添加或者缺失某些氨基酸而与本发明的2个gE抗原片段SEQ ID NO.1或2中的一个片段具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%、大于99%相似性的序列具有与SEQ ID NO.1或2相同或者相似的免疫反应，因而这些序列片段可以用于实施本发明的方案中，因此这些序列处于权利要求书要求保护的范围内。

并且本领域亦众所周知，包含SEQ ID NO.1或2所示序列的序列、或者包含通过氨基酸替换、添加或者缺失而与SEQ ID NO.1或2中的一个片段具有大于80%、大于81%、大于82%、大于83%、大于84%、大于85%、大于86%、大于87%、大于88%、大于89%、大于90%、大于91%、大于92%、大于93%、大于94%、大于95%、大于96%、大于97%、大于98%、大于99%相似性的序列的序列同样具有与SEQ ID NO.1或2相同或者相似的免疫反应，因而这些序列片段也可以用于实施本发明的方案中，因此这些序列也处于权利要求书要求保护的范围内。

由于本发明采用了间接免疫酶联检测技术检测抗水痘带状疱疹病毒中和抗体，有效地避免了在检测过程中使用具有强传染能力的水痘带状疱疹病毒，降低了整个实验的危险性。并且本发明的技术方案还具有简单、易操作、重复性好等特点，容易得到推广和应用。

本领域众所周知，本发明的3个gE抗原片段SEQ ID NO.1或2可以适用于任何免疫检测方法以检测感染水痘带状疱疹病毒或者接种水痘疫苗后人体内的抗VZV抗体、尤其是中和抗体。这些检测方法包括但不限于例如酶联免疫法、放射免疫法、荧光免疫法、化学发光法、胶体金法或乳胶法。其中实施例中使用的间接免疫酶联检测技术属于酶联免疫法中的酶联免疫吸附测定法。再例如，荧光免疫法可以是例如时间分辨荧光免疫法。这些方法均可以用来实施本发明，因此处于权利要求书中要求保护的范围内。

抗体或者中和抗体可以是IgG、IgM或者IgA亚类，因此在使用本发明的gE抗原实现抗VZV抗体、尤其是中和抗体检测的过程中有时会使用到检测人IgG、IgM或者IgA的试剂，这是本领域众所周知的。而所述的这些检测试剂也是本领域众所周知的，例如但不限于诸如羊或兔抗人IgG、IgM或IgA的抗体等。因此在本发明要求保护的试剂盒中，除了本发明的gE抗原片段外还包含这些检测IgG、IgM或者IgA的试剂，以及任选的其他试剂，例如缓冲液等。

下面通过如下实施例对本发明做详细描述，但是以下实施例仅仅是作为例证，并不对本发明构成任何限制。

实施例1 候选抗原中和表位的选择

本发明人通过生物信息学软件对水痘带状疱疹病毒gE序列进行抗原性预测，结果如图1所示，含有3个主要的抗原区段，其序列分别示于SEQ ID NO.1、2或3中。

实施例2 两种水痘带状疱疹病毒gE抗原的克隆、表达与活性鉴定

1. gE抗原基因的设计与合成

为了有利于水痘带状疱疹病毒gE基因在E.coli中获得高效的表达，基于实施例1中确定的3种水痘带状疱疹病毒gE抗原的氨基酸序列，选择大肠杆菌的偏性密码子设计gE基因，并委托上海英潍捷基生物技术服务有限公司合成上述序列的基因。

2. gE抗原表达质粒的构建与转化

为了便于将基因克隆到表达载体中，在连接臂的两端引入Xho I和Xba I两个酶切位点，以适合表达载体pBVIL1( 参见中国专利ZL00100695.9：表达载体pBVIL1及其构建方法和用途)。双酶切后插入载体pBVIL1中，构建相应的表达质粒。

2.1 酶切：取以上合成基因产物及pBVIL1表达载体各82μl分别放于Eeppendorf 离心管中，各加入10×buffer(H)10μl、Xba I (10u/μl)和Xho I (12u/μl) 各3μl，BSA 2μl，置37℃ 水浴酶切过夜。

2.2酶切产物的纯化和回收：基因产物及载体pBVIL1经双酶切后，按照《分子克隆》(科学出版社，第二版)中所述的方法进行用2%琼脂糖凝胶进行分离，并用上海华舜生物工程有限公司生产的小量胶回收试剂盒进行纯化回收。即在紫外灯下分别切下含质粒和目的基因的琼脂糖凝胶，放于Eeppendorf 离心管中，各加入溶胶/结合液，置65℃水浴5分钟使胶溶解，然后分别移入吸附柱后， 按试剂盒说明书进行纯化。

2.3 连接：于灭菌Eeppendorf 离心管中加入上述酶切并纯化后的载体 1μl、目的基因3μl，T4 DNA Ligase 4μl，置16℃连接5h以上。

2.4 转化：在超净工作台中，用无菌吸头取100μl HB101感受态细胞(感受态细胞按照《分子克隆》(科学出版社，第二版)的方法制备)悬液于Eppendorf中， 加入上述连接物8μl，轻轻旋转混匀，冰浴30分钟。立即转移到42℃水浴中放置2分钟，每管加入1ml LB培养基(不加抗生素)，30℃水浴摇床培养60分钟后，各取 0.2ml分别涂于LB琼脂培养基平皿上(含抗生素)，室温晾干后， 置37℃恒温箱倒置培养过夜。

2.5 鉴定：挑选菌落分别接种于LB中(5 ml/管)，培养过夜，次日各取0.1ml转移到LB中(2 ml /管)，32℃培养3小时，42℃水浴摇床中诱导培养4h，收菌，用SDS-PAGE鉴定，选择目的基因获得高表达菌株，并经测序鉴定载体中所插入的基因片段完全正确。

3．gE抗原的表达与纯化

3.1表达菌株的培养：取-70℃保存的表达菌株20μl接种于LB培养基中(100 ml LB/500 ml三角瓶)，37℃空气摇床培养过夜，次日按5%的比例转种于LB培养基(同上)，30℃空气摇床培养约3小时，当OD600值达到0.7时，立即将培养瓶转到42℃水浴摇床中，诱导培养4小时。将菌液合并，6000 rpm离心20分钟，弃上清，收集沉淀部分。

3.2提取包涵体：将沉淀称湿重，用10倍体积的20 mmol/L pH8.5 TE缓冲液将沉淀悬起，加入溶菌酶(1 mg/ml悬液)，在室温下磁力搅拌10分钟。在冰浴中超声波破碎菌，每次超声3秒钟，间隔7秒钟，共超声20分钟。4℃，12000 rpm，离心10分钟，弃上清，沉淀用1 mol/L NaCl(用TE配制)洗一次，再用TE洗2次，收集沉淀。沉淀用6M脲(用pH8.5 TE配制)溶解，加1%β-巯基乙醇。再过滤去沉淀取上清。

3.3纯化：将上述溶解的包涵体溶液过Q-SepgEroseFF阴离子交换柱，用平衡液(pH8.5，25 mmol/L TE，含6mol/L脲，0.1％β-巯基乙醇)清洗后，用不同浓度的NaCl(用平衡液配制)洗脱，收集各洗脱峰，经SDS-PAGE鉴定，收集0.05 mol/L NaCl洗脱峰。再过SepgErdexG-50凝胶过滤柱，收集第一洗脱峰。各种纯化重组表位抗原均用SDS-PAGE鉴定。通过上述的离子交换柱和凝胶过滤纯化，获得了两种电泳纯的水痘带状疱疹病毒gE抗原纯品。

4. gE抗原的活性鉴定

将纯化的候选抗原用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释为2.5μg/ml，三个抗原分别包被ELISA测定板，经封闭后，对本室保存的内质控血清(含国内10份水痘疫苗接种者血清和10份未接种疫苗健康献血者血清)进行了测定。原始测定结果如表1所示。经分析的不同gE抗原的活性分析结果如表2所示，其中抗原1和抗原2具有很高的特异性和灵敏度。

表1水痘带状疱疹病毒gE抗原活性检测数据

表2 水痘带状疱疹病毒gE抗原活性分析结果

实施例3 VZV抗体检测

采用gE抗原1(SEQ ID NO.1)和抗原2(SEQ ID NO.2)包被酶联板，利用间接ELISA法使用羊抗人IgG的抗体对血清中疫苗引起的水痘带状疱疹病毒中和抗体进行检测，测定结果以及分析结果如表3所示：抗原1(SEQ ID NO.1)50例水痘带状疱疹疫苗接种前标本组中有1例gE-IgG检测结果为阳性，49例阴性，阳性率为 2%。100例疫苗组中90例gE-IgG检测为阳性，10例阴性，阳性率为90%。抗原2(SEQ ID NO.2)50例水痘带状疱疹疫苗接种前标本组中有8例gE-IgG检测结果为阳性，42例阴性，阳性率为 16%。100例疫苗组中89例gE-IgG检测为阳性，11例阴性，阳性率为89%。疫苗组阳性率显著高于疾病流行前组(P<0.01)。因此抗原1或抗原2包被作为抗体检测试剂具有较高的特异性和灵敏度，在水痘疫苗的疗效评价中具有实用价值。

表3 水痘带状疱疹病毒抗体检测分析结果

序列表

<110> 北京市华信行生物科技有限公司

<120> 水痘带状疱疹病毒gE抗原及其在检测抗水痘带状疱疹病毒抗体中的用途

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 81

<212> PRT

<213> 水痘带状疱疹病毒(Varicella zoster)

<400> 1

Gly Thr Leu Arg Ile Thr Asn Pro Val Arg Ala Ser Val Leu Arg Tyr

1 5 10 15

Asp Asp Phe His Ile Asp Glu Asp Lys Leu Asp Thr Asn Ser Val Tyr

20 25 30

Glu Pro Tyr Tyr His Ser Asp His Ala Glu Ser Ser Trp Val Asn Arg

35 40 45

Gly Glu Ser Ser Arg Lys Ala Tyr Asp His Asn Ser Pro Tyr Ile Trp

50 55 60

Pro Arg Asn Asp Tyr Asp Gly Phe Leu Glu Asn Ala His Glu His His

65 70 75 80

Gly

<210> 2

<211> 90

<212> PRT

<213> 水痘带状疱疹病毒

<400> 2

Val Tyr Asn Gln Gly Arg Gly Ile Asp Ser Gly Glu Arg Leu Met Gln

1 5 10 15

Pro Thr Gln Met Ser Ala Gln Glu Asp Leu Gly Asp Asp Thr Gly Ile

20 25 30

His Val Ile Pro Thr Leu Asn Gly Asp Asp Arg His Lys Ile Val Asn

35 40 45

Val Asp Gln Arg Gln Tyr Gly Asp Val Phe Lys Gly Asp Leu Asn Pro

50 55 60

Lys Pro Gln Gly Gln Arg Leu Ile Glu Val Ser Val Glu Glu Asn His

65 70 75 80

Pro Phe Thr Leu Arg Ala Pro Ile Gln Arg

85 90

<210> 3

<211> 110

<212> PRT

<213> 水痘带状疱疹病毒

<400> 3

Lys Glu Asp Gln Leu Ala Glu Ile Ser Tyr Arg Phe Gln Gly Lys Lys

1 5 10 15

Glu Ala Asp Gln Pro Trp Ile Val Val Asn Thr Ser Thr Leu Phe Asp

20 25 30

Glu Leu Glu Leu Asp Pro Pro Glu Ile Glu Pro Gly Val Leu Lys Val

35 40 45

Leu Arg Thr Glu Lys Gln Tyr Leu Gly Val Tyr Ile Trp Asn Met Arg

50 55 60

Gly Ser Asp Gly Thr Ser Thr Tyr Ala Thr Phe Leu Val Thr Trp Lys

65 70 75 80

Gly Asp Glu Lys Thr Arg Asn Pro Thr Pro Ala Val Thr Pro Gln Pro

85 90 95

Arg Gly Ala Glu Phe His Met Trp Asn Tyr His Ser His Val

100 105 110