一种与铅离子结合的多肽及其应用的制作方法

本发明属于基因工程、环境生物技术领域，涉及一种与铅离子结合的多肽及其应用，还涉及将所述多肽展示于大肠杆菌外膜的表达载体及展示工程菌，以及它们在富集铅离子中的应用。

背景技术：

铅是天然存在于地壳中的高毒重金属，在岩石圈的含量高达13mg/kg，通过火山活动、化学风化、海雾等方式进行自然播散。伴随人类活动如采矿、冶炼及燃烧化石燃料，特别是工业化的进程，基本就是铅元素的“再分布”过程。值得注意的是，作为不可自然降解的金属毒物，环境中低浓度的铅可由动植物富集后经食物链传递给人。铅对人体无任何生理功能但对人体健康可造成严重危害。消除环境铅残留是耗时耗资的大工程，环境中含铅污染物的检测、吸附和回收一直是学者关注的焦点。

由于大多数重金属离子的电子层、结构、价态等物理和化学性质极为接近，通过化学合成法获得高选择性的金属离子探针难度大。生活在重度污染的极端环境中的微生物，演化出了一套简单、高效的诱导型操纵子系统，用以调节各种有毒金属离子在菌体内的含量。围绕运用生物手段处理环境重金属污染，避免物理化学方法可能对环境造成的二次污染，研究者们结合DNA重组技术和微生物细胞表面展示系统，尝试将一些靶分子展示在模式微生物大肠杆菌及酵母的细胞表面，开发出了一系列微生物金属吸附器。然而由于微生物展示系统的局限性，展示大分子蛋白质难度较大，展示效率不高，因而研究主要集中在金属结合寡肽、金属硫蛋白等的菌体细胞表面展示，应用基础研究仅局限在水体中铅、镉、铜、汞等少数几种重金属污染的治理。金属结合蛋白近几年来被证实是理想的菌体展示靶分子，利用其对金属离子的结合具有高选择特性，已成功开发了多种重金属微生物全细胞吸附器。高效特异识别目的金属离子的生物大分子是开发新型微生物金属吸附器的基础。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种与铅离子结合的多肽及其应用。

本发明首先提供了一种多肽，命名为PbrR81，为如下(a1)或(a2)：

(a1)由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的多肽；

(a2)将序列5的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的多肽。

本发明还保护含有所述多肽的融合蛋白。

所述融合蛋白(命名为Lpp-OmpA-PbrR81)具体可为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)或(b5)：

(b1)具有如下区段的蛋白质：Lpp肽段、OmpA肽段和PbrR81肽段；所述Lpp肽段由序列表的序列4中第1-29位氨基酸残基组成；所述OmpA肽段由序列表的序列4中第32-145位氨基酸残基组成；所述PbrR81肽段由序列表的序列4中第151-231位氨基酸残基组成；

(b2)具有如下区段的蛋白质：所述Lpp肽段、所述OmpA肽段、所述PbrR81肽段和His₆标签；

(b3)由序列表的序列4中第1-231位氨基酸序列组成的蛋白质；

(b4)由序列表的序列4所示的氨基酸氨基酸序列组成的蛋白质；

(b5)将(b1)或(b2)或(b3)或(b4)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的蛋白质。

编码所述多肽的DNA分子(DNA分子甲)也属于本发明的保护范围。所述DNA分子具体可为如下(c1)或(c2)或(c3)：(c1)编码区如序列表的序列3中自5’末端第539-781位核苷酸所示的DNA分子；(c2)在严格条件下与(c1)限定的DNA序列杂交且编码相同多肽的DNA分子；(c3)与(c1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％以上同源性且编码相同多肽的DNA分子。

编码所述融合蛋白的DNA分子(DNA分子乙)也属于本发明的保护范围。所述DNA分子具体可为如下(d1)或(d2)或(d3)：(d1)编码区如序列表的序列3中自5’末端第89-808位核苷酸所示的DNA分子；(d2)在严格条件下与(d1)限定的DNA序列杂交且编码相同蛋白质的DNA分子；(d3)与(d1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％以上同源性且编码相同蛋白质的DNA分子。

含有以上任一所述DNA分子甲或以上任一所述DNA分子乙的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

所述表达盒具体包括如下元件：T7启动区、lac操纵区、DNA分子甲、T7终止子。所述表达盒具体包括如下元件：T7启动区、lac操纵区、DNA分子乙、T7终止子。T7启动区具体可如序列表的序列3中第1-18位核苷酸所示。所述lac操纵区具体可如序列表的序列3中第20-42位核苷酸所示。所述T7终止子具体可如序列表的序列3中第872-919位核苷酸所示。所述表达盒具体可如序列表的序列3所示。

所述重组载体具体可为将以上任一所述DNA分子或以上任一所述表达盒插入出发载体得到的重组载体。所述出发载体具体可为载体pET-21a(+)。所述重组载体具体可为将载体pET-21a(+)的Nde I和Xho I酶切位点之间的小片段取代为序列表的序列3自5’末端第92-781位核苷酸所示的DNA分子得到的重组质粒。

所述重组菌具体可为将以上任一所述重组载体导入宿主菌得到的重组菌。所述宿主菌可为大肠杆菌，具体可为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明还保护以上任一所述多肽、以上任一所述融合蛋白、以上任一所述DNA分子或以上任一所述表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌的应用，为如下(1)至(6)中的任意一种：

(1)富集铅离子；

(2)制备用于富集铅离子的试剂盒；

(3)检测铅离子；

(4)制备用于检测铅离子的试剂盒；

(5)结合铅离子；

(6)制备用于结合铅离子的试剂盒。

本发明还保护一种试剂盒，其活性成分为以上任一所述多肽、以上任一所述融合蛋白、以上任一所述DNA分子或以上任一所述表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌；

所述试剂盒的用途为如下(Ⅰ)至(Ⅲ)中的任意一种：

(Ⅰ)富集铅离子；

(Ⅱ)检测铅离子；

(Ⅲ)结合铅离子。

本发明对于解决铅污染具有重大价值。

附图说明

图1为载体pET-21a(+)的MCS区域示意图

图2为实施例2中的15％SDS-PAGE图谱。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。载体pET-21a(+)：Novagen公司，产品目录号为69740；载体pET-21a(+)的MCS区域示意图见图1。大肠杆菌BL21(DE3)：Novagen公司，产品目录号为69450。

实施例1、重组质粒的构建

1、合成序列表的序列1所示的双链DNA分子。

2、用限制性内切酶Nde I和Sal I双酶切步骤1得到的双链DNA分子，回收酶切产物。

3、用限制性内切酶Nde I和Sal I双酶切载体pET-21a(+)，回收约5385bp的载体骨架。

4、将步骤2的酶切产物与步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pLOA。

5、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。

6、用限制性内切酶Hind III和Xho I双酶切步骤5得到的双链DNA分子，回收酶切产物。

7、用限制性内切酶Hind III和Xho I和双酶切重组质粒pLOA，回收约5847bp的载体骨架。

8、将步骤6的酶切产物与步骤7的载体骨架连接，得到重组质粒pLOA-PbrR81。

根据测序结果，对重组质粒pLOA-PbrR81进行结构描述如下：将载体pET-21a(+)的Nde I和Xho I酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列3自5’末端第92-781位核苷酸所示的DNA分子。重组质粒pLOA-PbrR81中具有序列表的序列3所示表达盒。

序列表的序列3中，第1-18位核苷酸为T7启动区，第20-42位核苷酸为lac操纵区，第89-808位核苷酸为Lpp-OmpA-PbrR81基因(第89-175位核苷酸编码Lpp肽段、第182-523位核苷酸编码OmpA肽段、第539-781位核苷酸编码PbrR81肽段、第788-805位核苷酸编码His₆标签，第806-808位核苷酸为终止密码子)，第872-919位核苷酸为T7终止子。

Lpp-OmpA-PbrR81基因编码序列表的序列4所示的Lpp-OmpA-PbrR81蛋白。序列表的序列4中，第1-29位氨基酸残基组成Lpp肽段，第32-145位氨基酸残基组成OmpA肽段，第151-231位氨基酸残基组成PbrR81肽段，第234-239位氨基酸残基组成His₆标签。Lpp肽段由大肠杆菌的脂蛋白信号肽(20个氨基酸残基)和N端最初的9个氨基酸残基组成，负责定位于细胞外膜。OmpA肽段负责外膜锚定。借助Lpp-OmpA展示系统，可以将PbrR81肽段展示于细胞外膜。

实施例2、重组菌的构建

1、将载体pET-21a(+)导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌Ⅰ。

2、将重组质粒pLOA导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌Ⅱ。

3、将重组质粒pLOA-PbrR81导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌Ⅲ。

4、重组菌Ⅲ的诱导培养

(1)将重组菌Ⅲ接种至含50μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃、250rpm振荡培养至OD_600nm值＝0.6。

(2)完成步骤(1)后，在培养体系中加入IPTG(IPTG在培养体系中的浓度为0.5mM)，37℃、250rpm振荡培养4小时。

(3)完成步骤(2)后，取整个培养体系，3500rpm离心，取菌体，进行15％SDS-PAGE。

5、重组菌Ⅱ的诱导培养

用重组菌Ⅱ代替重组菌Ⅲ，其他同步骤4。

6、重组菌Ⅱ的非诱导培养

(1)将重组菌Ⅱ接种至含50μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃、250rpm振荡培养至OD_600nm值＝0.6。

(2)完成步骤(1)后，37℃、250rpm振荡培养4小时。

(3)完成步骤(2)后，取整个培养体系，3500rpm离心，取菌体，进行15％SDS-PAGE。

15％SDS-PAGE的结果见图2。图2中，1为步骤6得到的菌体，2为步骤5得到的菌体(Lpp-OmpA的理论分子量约为17kDa，具有该目标条带)，3为步骤4得到的菌体(Lpp-OmpA-PbrR81的理论分子量约为27kDa，具有该目标条带)。

实施例3、吸附铅离子能力考察

待测菌分别为大肠杆菌BL21(DE3)、实施例2制备的重组菌Ⅰ、重组菌Ⅱ或重组菌Ⅲ。

1、将待测菌接种至含50μg/mL氨苄青霉素和150μM/L硝酸铅的液体LB培养基中，37℃、250rpm振荡培养至OD_600nm值＝0.6。

2、完成步骤1后，在培养体系中加入IPTG(IPTG在培养体系中的浓度为0.5mM)，37℃、250rpm振荡培养12小时。

3、完成步骤2后，取整个培养体系，3500rpm离心10min，收集菌体。

4、取步骤3得到的菌体，用无菌水清洗3次，然后在80℃烘箱烘至恒重(称量后即为菌体干重)。

5、取1mg步骤4得到的烘干至恒重的菌体，加入5ml纯硝酸溶液，然后进行微波消化(500W，140℃，2小时)，然后用双蒸水定容至50ml，得到待测溶液。采用原子吸收法检测待测溶液中的铅浓度(具体方法参照：WS/T18-1996尿中铅的石墨炉原子吸收光谱测定方法)。计算每g干重的菌体的铅含量。

重组菌Ⅲ的铅含量为60μmol/g干重，重组菌Ⅱ的铅含量为15.6μmol/g干重，重组菌Ⅰ的铅含量为15.01μmol/g干重，大肠杆菌BL21(DE3)的铅含量为14.98μmol/g干重。结果表明，重组菌Ⅲ的铅含量显著高于重组菌Ⅱ、重组菌Ⅰ以及大肠杆菌BL21(DE3)，重组菌Ⅱ、重组菌Ⅰ和大肠杆菌BL21(DE3)的铅含量基本一致。结果表明，重组菌Ⅲ具有强效的铅吸附能力，也就是说PbrR81肽段具有与铅离子结合的功能。

实施例4、特异性考察

方法基本同实施例3，差异仅在于用等浓度的氯化铬或氯化铜代替硝酸铅。

采用原子吸收法检测待测溶液中的铬浓度(具体方法参照：WS/T37-1996尿中铬的石墨炉原子吸收光谱测定方法)。重组菌Ⅲ的铬含量为4.8μmol/g干重，重组菌Ⅱ的铬含量为4.6μmol/g干重，重组菌Ⅰ的铬含量为4.5μmol/g干重，大肠杆菌BL21(DE3)的铬含量为4.2μmol/g干重。结果表明，重组菌Ⅲ、重组菌Ⅱ、重组菌Ⅰ以及大肠杆菌BL21(DE3)的铬含量基本一致。结果表明，PbrR81肽段不具有与铬离子结合的功能。

采用原子吸收法检测待测溶液中的铜浓度(具体方法参照：WS/T 94-1996尿中铜的石墨炉原子吸收光谱测定方法)。重组菌Ⅲ的铜含量为3.6μmol/g干重，重组菌Ⅱ的铜含量为3.9μmol/g干重，重组菌Ⅰ的铜含量为3.0μmol/g干重，大肠杆菌BL21(DE3)的铜含量为2.9μmol/g干重。结果表明，重组菌Ⅲ、重组菌Ⅱ、重组菌Ⅰ以及大肠杆菌BL21(DE3)的铜含量基本一致。结果表明，PbrR81肽段不具有与铜离子结合的功能。