专利名称：一种快速免标记检测铅离子的方法
技术领域：
本发明涉及一种铅离子的检测方法，特别涉及一种快速免标记检测铅离子的方法。
背景技术：
铅离子对人体危害严重，是环境监测的重要指标。其主要毒性效应是导致贫血、神经机能失调和肾损伤、生殖系统损伤等。美国环境保护署规定饮用水中铅离子的最大允许量不得超过72nM。目前，环境中痕量铅离子的常规检测方法主要有原子吸收法、原子荧光光谱法、电感耦合等离子体发射光谱法、电化学方法等。但是这些方法操作繁琐，需要麻烦的前处理、专门的分析技术人员以及昂贵的仪器，不利于现场快速分析检测。近年来，利用对铅离子敏感的DNA酶(17E DNAzyme)和铅离子介导的G四聚体来检测铅离子的方法备受关注(参考文献:H. Wang, L. Μ. L. 0u, Y. Suo and H. Yu. Computer-readable DNAzyme assay on disc for ppb-level lead detection, Anal. Chem. , 2011, 83, 1557-1563; T. Li, S. Dong and E. Wang. A lead(II)-driven DNA molecular device for turn-on fluorescence detection of lead(II) ion with high selectivity and sensitivity, J. Am. Chem. Soc. , 2010, 132，13156-13157.)。但这些方法需要特异性的核酸序列，因而限制了它的广泛应用。若能采用随机的核酸序列用于铅离子的常规检测，将会大大简化实验操作，提高实验效率，更加有利于环境中铅离子的现场实时定量分析。荧光共振能量转移技术是近年来兴起的一种光学实时监测技术，已广泛应用于分析检测领域。但往往需要标记荧光基团和淬灭基团，操作麻烦，费时耗力，不利于快速检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简便可行的铅离子浓度检测方法。本发明所采取的技术方案是
一种快速免标记检测铅离子的方法，包括如下步骤
1)将随机互补双链DNA序列溶解，得到DNA溶液；
2)在DNA溶液中加入还原剂，混合均勻，之后加入二价铜离子，混勻；
3)避光还原反应得到含有铜纳米颗粒的随机DNA双链，该DNA双链为检测用DNA链；
4)将标准浓度的铅离子溶液与检测用DNA链混合，避光反应，测量检测用DNA链的荧光值，得到标准曲线；
5)将待测样本液与检测用DNA链混合，避光反应，检测其荧光值，计算得到铅离子浓度。优选的，还原剂是维生素C或其盐中的至少一种。优选的，随机互补双链DNA序列的长度不小于10 bp。优选的，随机互补双链DNA序列的长度为15 35 bp。优选的，二价铜离子源自硫酸铜、乙酸铜和硝酸铜中的至少一种。
本发明的有益效果是
本发明的检测原理是随机双链DNA在340nm激发光下没有荧光，当加入二价铜离子和抗坏血酸钠的时候，能够在双链DNA上形成荧光铜纳米颗粒，340 nm激发光下于585nm处会有荧光。当再加入铅离子的时候，随着铅离子浓度的增加，585nm处的荧光会逐渐降低，并与铅离子的浓度呈很好的线性相关性，从而达到免标记荧光快速检测铅离子的目的。本发明的检测方法，无需对样品进行复杂的前处理，待测样品可以是环境水样，临床样本，或经过离心，过滤等简单处理的样品。检测过程操作简单。本发明的检测方法，特异性好，不易受其他金属离子的影响，检测精度高，灵敏度高，检测限低达5nM。
图1是本发明检测方法的原理图； 图2和3是本发明检测方法的表征图4是不同二价金属离子与含纳米铜离子的随机DNA双链反应的荧光值比较图。
具体实施例方式一种快速免标记检测铅离子的方法，包括如下步骤
1)将随机互补双链DNA序列溶解，得到DNA溶液；
2)在DNA溶液中加入还原剂，混合均勻，之后加入二价铜离子，混勻；
3)避光还原反应得到含有铜纳米颗粒的随机DNA双链，该DNA双链为检测用DNA链；
4)将标准浓度的铅离子溶液与检测用DNA链混合，避光反应，测量检测用DNA链的荧光值，得到标准曲线；
5)将待测样本液与检测用DNA链混合，避光反应，检测其荧光值，计算得到铅离子浓度。优选的，还原剂是维生素C或其盐中的至少一种。当然，根据本说明书的教导，本领域的技术人员也可以采用其他的还原剂，只要该还原剂可以将二价铜离子还原为铜即可。优选的，随机互补双链DNA序列的长度不小于10 bp,更佳的，随机互补双链DNA序列的长度为15 35 bp。只要该段随机序列可以容纳纳米铜颗粒即可。过长的DNA双链合成较为困难，故其序列也不宜过长，避免增加成本。优选的，二价铜离子源自硫酸铜、乙酸铜和硝酸铜中的至少一种。本发明的检测原理如图1所示。实施例1
基于随机双链DNA为模板形成的荧光铜纳米颗粒用于铅离子的免标记检测的步骤如
下
1)用含有150 mM乙酸钠的3-(N-吗啉)丙磺酸钠盐(MOPS)缓冲溶液(10 mM, pH=7. 5) 溶解随机互补的双链DNA，随机采用的DNA的序列是5’-TACTCATACGCTCATACGTTCATCACGAC TACACA-3，(SEQ ID NO :1)(由生工生物工程(上海)有限公司合成)，500 nM的两条随机互补DNA混合均勻，在90°C水浴反应10分钟，再缓慢降至室温，得到500 nM随机互补双链DNA溶液；
2)在500mL 500 nM的互补双链DNA中加入1 mM的抗坏血酸钠，充分混勻，再加入 IOOmM的乙酸铜，充分混勻，室温避光反应约20分钟，即得到基于随机双链DNA为模板形成的荧光铜纳米颗粒；
3)向上一步骤制得的溶液中加入不同浓度的铅离子，室温避光反应5分钟后用荧光分光光度计(Perkin-Elmer LS-55 Fluorescence Spectrometer (Perkin-Elmer，USA))检测溶液的荧光强度，荧光检测的激发峰是340nm，发射峰是585nm。其荧光检测结果如图2和3所示。从图2可以看出，基于随机双链DNA为模板合成的荧光铜纳米颗粒具有很好的荧光特征。其激发峰为340 nm，发射峰为585 nm。其中在585 nm处的发射峰峰值用来后续监测加入不同浓度的铅离子后荧光强度变化情况。从图3可以看出，铅离子的浓度与585 nm处的荧光强度响应具有很好的相关性， 对铅离子检测的线性范围为5-100 nM;该方法对铅离子的检测限为5 nM。实施例2
为了考察基于随机双链DNA为模板合成的荧光铜纳米颗粒用于免标记检测铅离子的特异性，按如下步骤进行了选择性实验
1)用含有150mM乙酸钠的3-(N-吗啉)丙磺酸钠盐(MOPS)缓冲溶液(10 mM, pH=7. 5) 溶解随机互补的双链DNA，随机采用的DNA的序列是5，-ATGAACGTATGAGCG-3，(SEQ ID NO 2)(由生工生物工程(上海)有限公司合成)。500 nM的两条随机互补DNA混合均勻，在 90°C水浴反应10分钟，再缓慢降至室温，得到500 nM随机互补双链DNA溶液；
2)在500mL 500 nM的互补双链DNA中加入1 mM的抗坏血酸钠，充分混勻，再加入100 mM的硫酸铜，充分混勻，室温避光反应约20分钟，即得到基于随机双链DNA为模板形成的荧光铜纳米颗粒；
3)向上一步骤所制得的溶液中加入不同的二价离子(铅离子的浓度为0.3mM； Zn2+, Mg2+，Cd2+，Ni2+，Mn2+，Fe3+, Sn2+，Ca2+，Co2+，Hg2+，Ba2+浓度为 3 mM)，室温避光反应 5 分钟后用荧光分光光度计(Perkin-Elmer LS-55 Fluorescence Spectrometer (Perkin-Elmer, USA))检测溶液的荧光强度，荧光检测的激发峰是340nm，发射峰是 585nm。检测结果如图4所示。从图4的检测结果可以看出，3 mM的Si2+，Mg2+，Cd2+，Ni2+， Mn2+，Fe3+, Sn2+，Ca2+，Co2+，Hg2+，Ba2+对检测没有影响，只有当加入铅离子后才会淬灭荧光铜纳米颗粒的荧光，使荧光信号下降。这证明该方法对铅离子的荧光检测具有很好的特异性。实施例3
为了考察基于随机双链DNA为模板合成的荧光铜纳米颗粒用于实际样品中铅离子的免标记检测，按如下步骤进行了回收率实验
1)用含有150 mM乙酸钠的3-(N-吗啉)丙磺酸钠盐(MOPS)缓冲溶液(IOmM, pH=7. 5) 溶解随机互补的双链DNA，随机采用的DNA的序列是5，-AGTTGCAAGAAGATGACAGAGAAGT-3， (SEQ ID NO :3)(由生工生物工程(上海)有限公司合成)。500 nM的两条随机互补DNA 混合均勻，在90°C水浴反应10分钟，再缓慢降至室温，得到500 nM随机互补双链DNA ；2)在500mL 500 nM的互补双链DNA中加入1 mM的抗坏血酸钠，充分混勻，再加入100 mM的硝酸铜，充分混勻，室温避光反应约20分钟，即得到基于随机双链DNA为模板形成的荧光铜纳米颗粒；
3)取4份河水样品用0.2mm的滤膜过滤后添加不同浓度的铅离子(浓度分别为10， 20，40，80 nM)，将上述4份实际样品加入到(2)中所制备的荧光铜纳米颗粒溶液中，室温避光反应5分钟后用荧光分光光度计(Perkin-Elmer LS-55 Fluorescence Spectrometer (Perkin-Elmer, USA))检测溶液的荧光强度。荧光检测的激发峰是340nm，发射峰是 585nm。从表1的检测结果可以看出，河水实际样品中铅离子检测的回收率为86-108%，说
明本发明所设计的铅离子检测方法能够满足实际样品检测的需要。
权利要求
1.一种快速免标记检测铅离子的方法，包括如下步骤1)将随机互补双链DNA序列溶解，得到DNA溶液；2)在DNA溶液中加入还原剂，混合均勻，之后加入二价铜离子，混勻；3)避光还原反应得到含有铜纳米颗粒的随机DNA双链，该DNA双链为检测用DNA链；4)将标准浓度的铅离子溶液与检测用DNA链混合，避光反应，测量检测用DNA链的荧光值，得到标准曲线；5)将待测样本液与检测用DNA链混合，避光反应，检测其荧光值，计算得到铅离子浓度。
2.根据权利要求1所述的快速免标记检测铅离子的方法，其特征在于还原剂是维生素C或其盐中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的快速免标记检测铅离子的方法，其特征在于随机互补双链 DNA序列的长度不小于10 bp。
4.根据权利要求4所述的快速免标记检测铅离子的方法，其特征在于随机互补双链 DNA序列的长度为15 35 bp。
5.根据权利要求1所述的快速免标记检测铅离子的方法，其特征在于二价铜离子源自硫酸铜、乙酸铜和硝酸铜中的至少一种。
全文摘要
本发明公开了一种快速免标记检测铅离子的方法。二价铜离子在有还原剂存在的情况，在随机DNA双链中形成纳米铜颗粒，加入铅离子后会淬灭荧光铜纳米颗粒的荧光，并且铅离子浓度与荧光强度具有很好的相关性，从而达到检测铅离子的目的。该检测方法具有很好的灵敏度，检出限为5nM。该检测方法具有很好的特异性，其他离子对检测不产生影响，可用于实际样品检测，回收率为86-108%。本发明设计的对铅离子的检测方法操作简单，使用方便，灵敏度高，选择性高，无需特意的核酸序列和复杂的仪器，为实际样品中铅离子含量的快速检测提供了一种新的检测手段。
文档编号G01N21/64GK102519924SQ20111038703
公开日2012年6月27日 申请日期2011年11月29日 优先权日2011年11月29日
发明者曾令文, 陈俊华 申请人:中国科学院广州生物医药与健康研究院