与大白菜紫色叶球基因BrPur连锁的分子标记的制作方法

本发明属于蔬菜育种及分子遗传学领域，具体涉及与大白菜紫色叶球基因BrPur连锁的分子标记，还涉及到扩增该分子标记的引物及在大白菜辅助育种中的应用。

背景技术：

白菜 (Brassica rapa L.) 属十字花科芸薹属芸薹种白菜亚种，是起源于我国的主要蔬菜作物之一，也是我国种植面积最大的蔬菜作物之一，同时还是世界三大油菜之一，与人们的日常生活密切相关。近年来，随着人们生活水平的提高，人们对大白菜品质的要求日益提高，而紫色大白菜花青素含量丰富，对于人类健康的营养价值极高，因此，紫色大白菜育种受到越来越多国内外学者和育种家的重视。

研究表明紫色大白菜类黄酮类次生代谢产物丰富，尤其是花青素含量较高，不仅有利于提高白菜类作物自身的抗逆能力，而且其具有抗癌、抗氧化及心血管疾病的功效，对于人类健康具有重要的营养价值，近年来受到国内外的广泛关注。但是，白菜叶球颜色需要在其结球期成熟后才能表现出，而且需要在田间切开叶球逐株观察，操作起来不仅对种质材料的破坏性极大，而且费时费力，极大的延缓了育种进程。因此为了加快紫色叶球大白菜的育种速度，利用现代的分子生物技术，进行分子标记辅助育种十分必要。

随着分子生物学技术的快速发展，多种基于DNA多态性的分子技术应运而生，并广泛应用于遗传育种研究的各个领域。简单序列重复（simple sequence repeats，SSR），又称为微卫星DNA（microsatellite，DNA），是一类由1 - 6个核苷酸串联重复组成的DNA序列如（CA）n，（ATG）n，（TAGG）n等重复，其长度一般较短，广泛分布于基因组的不同位置，由于重复次数的不同和重复程度的不完全造成了每个位点的多态性，包括SSR标记和EST-SSR标记两种类型。其中，SSR标记具有共显性、重复性好、多态性丰富、易于检测等优点，已广泛应用于植物遗传多样性分析、遗传图谱构建、基因定位和分子标记辅助育种等研究领域（Tautz and Schlötterer，1994；Powell et al.，1996）。

因此，基于以上SSR标记的优点，申请人利用大白菜的测序结果，开发并成功筛选出与大白菜叶球紫色基因BrPur紧密连锁的分子标记，并构建了BrPur基因的分子遗传图谱，为克隆该基因及利用该分子标记进行紫色叶球大白菜分子辅助育种，加快育种进程奠定了基础。

技术实现要素：

本发明的目的在于，提供与大白菜叶球颜色基因BrPur紧密连锁的SSR分子标记。

本发明的还一个目的在于，提供可用于PCR扩增与大白菜叶球颜色基因BrPur紧密连锁的SSR分子标记的引物对，以及应用该分子标记引物，通过PCR方法，获得分子标记。以此在苗期即可鉴定区分紫色叶球大白菜和非紫色叶球大白菜，从而淘汰非目标植株，大大提高选择的效率。

为了实现上述任务，本发明采用如下的技术解决方案：

本发明公开了与大白菜紫色叶球基因BrPur紧密连锁的SSR分子标记，所述分子标记Sep ID NO.1和Sep ID NO.3所示的序列。

本发明还公开了与大白菜紫色叶球基因BrPur连锁的SSR分子标记引物，已鉴定出的6对SSR引物，优选引物B-76（序列Sep ID NO.5、Sep ID NO.6）和引物SSR14-36（Sep ID NO.7、Sep ID NO.8）所示的序列，6对中的一对，即可将紫色叶球与非紫色叶球大白菜区分开，同时使用两个标记能提高选择的准确性。

[f1] 对SSR引物对的脱氧核糖核苷酸引物序列如下：

引物对B-31：

上游引物（F）：5＇－GGTCAAAACCTTTCAGAACTCCC－3＇；

下游引物（R）：5＇－AATCTTATCTTTTGGTTTGGTGCTG－3＇；

引物对B-51：

上游引物（F）：5＇－TGGATTTGGTTAGGTGGTCAGC－3＇

下游引物（R）：5＇－CATGCACTTTGGGTGGAGATAC－3＇

引物对B-76：

上游引物（F）：5＇－TGGAACGCAAATGAACCCTC－3＇

下游引物（R）：5＇－GATGGCAAAATTCACATAAGTTCAG－3＇

引物对SSR14-36：

上游引物（F）：5＇－TAAACCTAAAAATACATCTGCTTCC－3＇

下游引物（R）：5＇－TTTAACGTGAGAGCTTGAATGC－3＇

引物对SSR14：

上游引物（F）：5＇－CGAGTTGACCTGCGAACATTG－3＇

下游引物（R）：5＇－CGATTCCTTCATATTTGGTTTCAC－3＇

引物对SSR17：

上游引物（F）：5＇－CTCTCAATCCCTCAATCAAACC－3＇

下游引物（R）：5＇－AGGAGGCGTGCGGTTATG－3＇

本发明公开的分子标记，是由优选的引物对B-76（Sep ID NO.5、Sep ID NO.6）和引物对SSR14-36(Sep ID NO.7、Sep ID NO.8)经过PCR扩增获得的。

[A2]

采用上述与大白菜紫色叶球基因BrPur紧密连锁的SSR分子标记引物，通过DNA扩增在苗期即可鉴定区分紫色叶球和非紫色叶球大白菜，从而淘汰非目标植株，大大提高选择的效率。同时大白菜紫色叶球基因BrPur分子遗传图谱的构建可加快克隆该基因。

本发明首次获得了与大白菜紫色叶球基因BrPur最为紧密连锁的分子标记引物，具有检测方便，扩增稳定，重复性和准确率高等优点。其具体有益效果表现在：

（1）获得了在第7连锁群（A07）上大白菜紫色叶球基因BrPur的分子遗传图谱，且首次获得与BrPur基因紧密连锁的分子标记B-76和SSR14-36，可在紫色大白菜分子标记辅助育种及BrPur基因克隆中发挥重要的作用。

[A3] [A4]

（3）鉴定方便。这2个标记均为共显性标记，具有扩增稳定、检测方便、快速等优点。用这2个分子标记检测BrPur基因，可以确定BrPur的存在与否及存在的状态，进而快速筛选携有BrPur基因的植株，并用于紫色大白菜品种的选育。同时利用分子标记进行检测时还可以避免环境对品种的影响，提高选择的准确性。

（4）提高紫色大白菜的选择效率。在传统的紫色大白菜鉴定过程中，必须等到白菜结球期成熟后才能对叶球颜色性状进行观察统计，因此紫色大白菜的选育不仅费时费力，而且难度大，成本高，育种周期长。用本发明的分子标记引物，通过检查与大白菜紫色叶球基因BrPur紧密连锁的分子标记，可将表型鉴定的工作大大减少，在苗期即可区分紫色和非紫色叶球大白菜，从而淘汰非目标植株，因此，利用本发明的与BrPur基因紧密连锁的分子标记，不仅节约成本，而且大大的提高了育种效率，加快了育种进程。

（5）可用于克隆大白紫色叶球基因的研究。图位克隆大白菜紫色基因BrPur的前提在于获得与BrPur紧密连锁的分子标记。B-76和SSR14-36在所有已知的A07分子标记中是首次报道的位于BrPur两侧并且与之连锁最为紧密标记，这为克隆该基因提供了分子生物学基础和遗传学依据。

附图说明

图1是白菜紫色叶球基因BrPur的遗传连锁图，右侧为遗传连锁图的标记，左侧数据为标记间的遗传距离（cM）。

图2 是B-76在紫色和橙色亲本及F₂代单株中的扩增结果；泳道信息：（从左到右）M，50 bp DNA ladder；5个纯合紫色单株；5个杂合紫色单株；6个纯合非紫色单株；P是紫色亲本；O是橙色亲本。

图3是SSR14-36在紫色和橙色亲本及F₂代单株中的扩增结果；泳道信息：（从左到右）M，50 bp DNA ladder；P是紫色亲本；O是橙色亲本；5个纯合紫色单株；5个杂合紫色单株；5个纯合非紫色单株；。

图4是标记B-76的引物在亲本14S839和14S162间的扩增序列差异。B-76-14S839表示标记B-76的引物在亲本14S839中的扩增结果；B-76-14S162表示标记B-76的引物在亲本14S162中的扩增结果。

图5是标记SSR14-36的引物在亲本14S839和14S162间的扩增序列差异。SSR14-36-14S839表示标记SSR14-36的引物在亲本14S839中的扩增结果；SSR14-36-14S162表示标记SSR14-36的引物在亲本14S162中的扩增结果。

图6 P1、P2分别是紫色亲本材料14S839成熟期的叶球外观和紫色球叶性状；O1、O2分别是橙色亲本材料14S162成熟期的叶球外观和非紫色球叶性状。

以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。

具体实施方式

以下实施例中的实验方法均为常规方法，所涉及的实验试剂均为常规生化试剂。

本发明的与白菜紫色叶球基因BrPur紧密连锁的SSR分子标记引物是通过以下步骤获得的：

（1）群体材料准备

以紫色大白菜“14S839” （西北农林科技大学学报（自然科学版）2011（3）11：146-151）为父本，橙色大白菜“14S162”（秦白6号大白菜的亲本之一，陕西农业科学，1999 (3)，5-6）为母本杂交产生的F1群体，然后通过单株自交获得相应的F2群体。

（2）白菜单株基因组总DNA的提取

A、取0.2 g去掉主脉的新鲜嫩叶，塞入装有钢珠（钢珠需要由质量分数为75%的酒精清洗过）的2 mL的离心管中，放入液氮中速冻，利用组织研磨仪磨成粉末；

B、向离心管中加700 μL经65 ℃预热的CTAB提取液（CTAB：2％，Tris-HCl（pH 8.0）：100 mmol/L，EDTA：20 mmol/L，NaCl：1.4 mol/L），再加入10 µL的β-巯基乙醇，迅速混匀；

C、随后将离心管放入65 ℃烘箱中，中间每间隔5-10 min分钟摇一次，温浴45 min；

D、取出离心管，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）的混合物，摇匀15 min后，常温下10000 r/min 离心10 min；

E、将上层液相（约700μL）转移到另一离心管中，加入等体积的氯仿和异戊醇混合溶液（氯仿：异戊醇＝24：1），轻轻摇匀10 min，常温下10000 r/min离心10 min；

F、取上清（约500μL），加入2倍体积经预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA抱团，-20℃条件下沉淀30 min，4℃条件下8000 r/min离心5 min；

G、弃上清，加入500 μL质量百分数为75%的乙醇洗涤沉淀2次后，沉淀物室温晾干；

H、加入500 μL的无菌蒸馏水溶解DNA，加入0.29 μL的RNase A（10 µg/µl），混匀后稍离心，37 ℃保温30 min；

I、加入3 mol/L的NaAc溶液50 µL和2倍体积经预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA抱团，-20 ℃条件下沉淀30 min；

J、在4℃条件下，8000 r/min离心5 min，弃上清，加入质量百分数为75％的乙醇清洗沉淀1～2次后，沉淀物室温晾干，加入400～500 µL的灭菌ddH₂O溶解使用，或加入质量百分数为75％的乙醇-20 ℃保存备用；

（3）SSR序列的获得

根据http://brassicadb.org/brad/index 中公布的已知引物，共选取大白菜10对染色体上已知的引物120对，利用亲本材料对120对引物进行筛选，共筛选出20对差异引物，然后选择紫色较深的F2单株和非紫色F2单株各10株，对这20对引物进行再次筛选，发现1对差异引物A710，随后继续选取A710引物两侧已知引物，发现了另一对差异引物A731。进一步沿A731到BrPur方向设计SSR引物。利用SSRHunter软件对该区间序列内的SSR位点进行检索，检索标准为：含二、三、四、五和六核苷酸类型的SSR基序（motif）的最小重复数分别为5，4，3，3和3次。将检索得到的含SSR位点的序列在芸薹属基因组网站（http://www.brassica.bbsrc.ac.uk/）进行同源性比对，SSR序列选取条件为比对相似性85%以上，同时有3条以上的同源序列与该序列存在SSR位点差异。

（4）SSR分子标记引物设计

根据SSR差异位点两端的序列，采用Primer 5.0 软件对符合条件的目标序列设计引物。设计引物参数原则：退火温度为50℃~70℃，最佳温度为57℃；引物长度18bp ~26bp；产物大小为100 bp ~300bp；引物（G+C）含量为40%~60%，引物不出现二级结构、发夹结构和二聚体。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，设计合成了SSR引物297对。

（5）多态性引物筛选和SSR分子标记分析

选用所设计的297对引物，将在紫色亲本和非紫色亲本间表现出相同多态性的引物重复分析3次，然后选择在F₂群体中30株极端个体间进行多态性验证，如果扩增结果与在两亲本间扩增结果一致，则将确实存在多态性的引物用于F₂代单株的SSR分析。最后根据连锁交换规律，结合单株基因型材料与田间对叶球颜色调查统计的结果，利用JoinMap4.0软件构建了大白菜紫色叶球基因BrPur的分子遗传连锁图1，获得了与BrPur紧密连锁的6个SSR标记，图1是白菜紫色叶球基因BrPur的遗传连锁图，右侧为遗传连锁图的标记，左侧数据为标记间的遗传距离（cM）。

6对SSR引物对的脱氧核糖核苷酸引物序列如下：

引物对B-31：

上游引物（F）：5＇－GGTCAAAACCTTTCAGAACTCCC－3＇；

下游引物（R）：5＇－AATCTTATCTTTTGGTTTGGTGCTG－3＇；

引物对B-51：

上游引物（F）：5＇－TGGATTTGGTTAGGTGGTCAGC－3＇

下游引物（R）：5＇－CATGCACTTTGGGTGGAGATAC－3＇

引物对B-76：

上游引物（F）：5＇－TGGAACGCAAATGAACCCTC－3＇

下游引物（R）：5＇－GATGGCAAAATTCACATAAGTTCAG－3＇

引物对SSR14-36：

上游引物（F）：5＇－TAAACCTAAAAATACATCTGCTTCC－3＇

下游引物（R）：5＇－TTTAACGTGAGAGCTTGAATGC－3＇

引物对SSR14：

上游引物（F）：5＇－CGAGTTGACCTGCGAACATTG－3＇

下游引物（R）：5＇－CGATTCCTTCATATTTGGTTTCAC－3＇

引物对SSR17：

上游引物（F）：5＇－CTCTCAATCCCTCAATCAAACC－3＇

下游引物（R）：5＇－AGGAGGCGTGCGGTTATG－3＇

所述的PCR扩增包括：20 μL PCR 反应体系为： 50ng/μL的模板 DNA 为2μL， 2×TaqMaster Mix 10μLM的上、下游引物各1μL，用无菌蒸馏水补充反应体系至20 μL；

PCR 反应程序为：

B-76引物：先94 ℃预变性5min；然后94 ℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共 30个循环；最后72℃再延伸10min，4℃保存。

SSR14-36引物：先94 ℃预变性5min；然后94 ℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸 30s，共 30个循环；最后72℃再延伸10min，4℃保存。

以下是发明人给出的具体实施例。

实施例：SSR14-36引物的应用

（一）采用CTAB法提取大白菜基因组DNA，提取步骤如下所示：

A. 取0.2 g去掉主脉的新鲜嫩叶片，塞入装有钢珠（钢珠需要由质量分数为75%的酒精清洗过）的2 mL的离心管中，放入液氮中速冻，利用组织研磨仪磨成粉末；

B. 向离心管中加700 μL经65 ℃预热的CTAB提取液（CTAB：2％，Tris-HCl（pH 8.0）：100 mmol/L，EDTA：20 mmol/L，NaCl：1.4 mol/L），再加入8 µl的β-巯基乙醇，迅速混匀；

C. 随后将离心管放入65 ℃水浴中，中间每间隔5-10 min分钟摇一次，水浴45 min；

D. 取出离心管，加入等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合物（酚：氯仿：异戊醇=25：24：1），摇匀15 min后，常温下10000 r/min离心10 min；

E. 将上层液相（约700 μL）转移到另一离心管中，加入等体积的氯仿和异戊醇的混合物（氯仿：异戊醇=24：1），轻轻摇匀10 min，常温下10000 r/min离心10 min；

F. 取上清（约500 μL），加入2倍体积预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA抱团，-20℃条件下沉淀30 min，4 ℃条件下8000 r/min离心5 min；

G. 弃上清，加入500 μL质量分数为75%的乙醇洗涤沉淀2次后，沉淀物室温晾干；

H. 加入500 μL的无菌蒸馏水溶解DNA，加入0.29 μL的RNaseA（10 µg/µL），混匀后离心，37 ℃保温30 min；

I.加入3 mol/L NaAc溶液50 µL和2倍体积经预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA抱团，-20 ℃条件下沉淀30 min；

J. 在4 ℃条件下，8000 r/min离心5 min，弃上清，加入质量分数为75％的乙醇清洗沉淀1～2次后，沉淀物室温晾干，加入400 -500 μL灭菌的ddH₂O溶解使用，或加入质量百分数为75％乙醇-20℃保存备用；

（二）PCR扩增

用紫色亲本和非紫色亲本DNA作模板，按照下述PCR扩增条件和程序进行分析

PCR扩增条件：

20 μL PCR 反应体系为： 50ng/μL的模板 DNA 为2 μL，2×Taq Master Mix 10μL，10 μ M的上、下游引物各1 μL，用无菌蒸馏水补充反应体系至20 μL；

② PCR反应程序为：先94 ℃预变性5 min；然后94 ℃变性30 s，53 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，共 30个循环；最后72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。PCR反应在Bio-Rad S1000 96型PCR仪中进行。

（三）9%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

（1）9%非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备方法如下：

①玻璃板的清洗：用清水将玻璃板冲洗干净，再用无水乙醇冲洗并空置晾干，洗板时应将带有磨砂条的玻璃板和光滑玻璃板分开。

②装板：将带有磨砂条的玻璃板和光滑玻璃板两侧对齐，光滑玻璃板下侧突出插入到带有凹槽的橡皮封条中，利用1%的琼脂糖凝胶将磨砂玻璃板与橡皮封条之间的间隙封住，琼脂糖凝胶凝固后待用。

③灌胶：封底之后，取25 mL，9％的非变性聚丙烯酰胺凝胶溶液，加250 μL浓度为10％的过硫酸氨（APS）和25 μL的TEMED，轻轻混匀，灌完后，将梳子插入适当位置，再将板调至水平，室温下胶板凝固30 min。

（2）电泳：

①点样：往胶槽内倒入适量1×TBE电泳缓冲液（中间槽的电泳液需要高于光滑玻璃板的高度，两侧液体高度10 cm以上），将梳子从胶板中轻轻地拔出，用移液器将梳孔中残余的凝胶和气泡清除干净，加入2 μL由SSR14-36引物扩增出的PCR扩增产物。

②电泳检测：接通电源，恒压180 V电泳检测，时间约为90 min，待二甲苯氰跑出胶底部，停止电泳。

③卸板：将电泳完毕的凝胶从玻璃板上剥离下来，该过程在水中进行，可以减少凝胶的损坏。

（3）银染步骤：

①冲洗：将电泳完毕的凝胶从玻璃板上剥离下来后，放入盛有蒸馏水的盘子里，轻晃5-6 s，倒掉，以洗去凝胶表面的残余电泳液；

②染色：将胶转入0.1 % 的硝酸银溶液中震荡染色8-10 min；

③水洗：将染完色的凝胶转入蒸馏水中漂洗2-3次，洗去凝胶表面的硝酸银残余；

④显色：将冲洗完毕的凝胶转入显色液（1.5% NaOH，0.4％甲醛）中显色至条带清楚显示；

⑤冲洗：将显色液倒掉，用自来水冲洗胶片2-3次；

⑥保存：将冲洗后的凝胶放在胶片观察灯上统计分析、照相，然后用保鲜膜封存，4 ℃可保存数月。

（四）结果判断

纯合紫色材料扩增出大约140bp的产物、纯合非紫色材料扩增出大约128bp的产物，杂合紫色材料扩增出共显性的产物见图3，图3是SSR14-36在紫色和橙色亲本及F₂代单株中的扩增结果；泳道信息：（从左到右）M，50 bp DNA ladder；P是紫色亲本；O是橙色亲本；5个纯合紫色单株；5个杂合紫色单株；5个纯合非紫色单株。图5是标记SSR14-36的引物在亲本14S839和14S162间的扩增序列差异。SSR14-36-14S839表示标记SSR14-36的引物在亲本14S839中的扩增结果；SSR14-36-14S162表示标记SSR14-36的引物在亲本14S162中的扩增结果。

实施例：B-76引物的应用

（一）采用CTAB法提取大白菜基因组DNA，提取步骤如下所示：

A. 取0.2 g去掉主脉的新鲜嫩叶片，塞入装有钢珠（钢珠需要由质量分数为75%的酒精清洗过）的2 mL的离心管中，放入液氮中速冻，利用组织研磨仪磨成粉末；

B. 向离心管中加700 μL经65 ℃预热的CTAB提取液（CTAB：2％，Tris-HCl（pH 8.0）：100 mmol/L，EDTA：20 mmol/L，NaCl：1.4 mol/L），再加入8 μL的β-巯基乙醇，迅速混匀；

C. 随后将离心管放入65 ℃水浴中，中间每间隔5－10 min分钟摇一次，水浴45 min；

D. 取出离心管，加入等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合物（酚：氯仿：异戊醇=25：24：1），摇匀15 min后，常温下10000 r/min离心10 min；

E. 将上层液相（约700 μL）转移到另一离心管中，加入等体积的氯仿和异戊醇的混合物（氯仿：异戊醇=24：1），轻轻摇匀10 min，常温下10000 r/min离心10 min；

F. 取上清（约500 μL），加入2倍体积预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA抱团，-20 ℃条件下沉淀30 min，4 ℃条件下8000 r/min离心5 min；

G. 弃上清，加入500 μL质量分数为75%的乙醇洗涤沉淀2次后，沉淀物室温晾干；

H. 加入500 μL的无菌蒸馏水溶解DNA，加入0.29 μL的RNaseA（10 µg/µL），混匀后离心，37 ℃保温30 min；

I.加入3 mol/L NaAc溶液50 µL和2倍体积经预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA抱团，-20 ℃条件下沉淀30 min；

J. 在4 ℃条件下，8000 r/min离心5 min，弃上清，加入质量分数为75％的乙醇清洗沉淀1～2次后，沉淀物室温晾干，加入400－500 μL灭菌的ddH₂O溶解使用，或加入质量百分数为75％乙醇﹣20 ℃保存备用；

（二）PCR扩增

用紫色亲本和非紫色亲本DNA作模板，按照下述PCR扩增条件和程序进行分析

PCR扩增条件：

20 μL PCR 反应体系为： 50 ng/μL的模板 DNA 为2 μL，2×Taq Master Mix 10 μL，10 μ M的上、下游引物各1 μL，用无菌蒸馏水补充反应体系至20 μL；

② PCR反应程序为：先94 ℃预变性5 min；然后94 ℃变性30 s，55 ℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，共 30个循环；最后72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。PCR反应在Bio-Rad S1000 96型PCR仪中进行。

（三）9%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

（1）9%非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备方法如下：

①玻璃板的清洗：用清水将玻璃板冲洗干净，再用无水乙醇冲洗并空置晾干，洗板时应将带有磨砂条的玻璃板和光滑玻璃板分开。

②装板：将带有磨砂条的玻璃板和光滑玻璃板两侧对齐，光滑玻璃板下侧突出插入到带有凹槽的橡皮封条中，利用1%的琼脂糖凝胶将磨砂玻璃板与橡皮封条之间的间隙封住，琼脂糖凝胶凝固后待用。

③灌胶：封底之后，取25 mL，9％的非变性聚丙烯酰胺凝胶溶液，加250 μL浓度为10％的过硫酸氨（APS）和25 μL的TEMED，轻轻混匀，灌完后，将梳子插入适当位置，再将板调至水平，室温下胶板凝固30 min。

（2）电泳：

①点样：往胶槽内倒入适量1×TBE电泳缓冲液（中间槽的电泳液需要高于光滑玻璃板的高度，两侧液体高度10 cm以上），将梳子从胶板中轻轻地拔出，用移液器将梳孔中残余的凝胶和气泡清除干净，加入2 μL由B-76引物扩增出的PCR扩增产物。

②电泳检测：接通电源，恒压180 V电泳检测，时间约为90 min，待二甲苯氰跑出胶底部，停止电泳。

③卸板：将电泳完毕的凝胶从玻璃板上剥离下来，该过程在水中进行，可以减少凝胶的损坏。

（3）银染步骤：

①冲洗：将电泳完毕的凝胶从玻璃板上剥离下来后，放入盛有蒸馏水的盘子里，轻晃5－6 s，倒掉，以洗去凝胶表面的残余电泳液；

②染色：将胶转入0.1 % 的硝酸银溶液中震荡染色8-10 min；

③水洗：将染完色的凝胶转入蒸馏水中漂洗2－3次，洗去凝胶表面的硝酸银残余；

④显色：将冲洗完毕的凝胶转入显色液（1.5% NaOH，0.4％甲醛）中显色至条带清楚显示；

⑤冲洗：将显色液倒掉，用自来水冲洗胶片2－3次；

⑥保存：将冲洗后的凝胶放在胶片观察灯上统计分析、照相，然后用保鲜膜封存，4 ℃可保存数月。

（四）结果判断

纯合紫色材料扩增出大约152bp的产物、纯合非紫色材料扩增出大约160bp的产物，杂合紫色材, 料扩增出共显性的产物见图2，图2是B-76在紫色和橙色亲本及F₂代单株中的扩增结果；泳道信息：（从左到右）M，50 bp DNA ladder；5个纯合紫色单株；5个杂合紫色单株；6个纯合非紫色单株；P是紫色亲本；O是橙色亲本。图4是标记B-76的引物在亲本14S839和14S162间的扩增序列差异。B-76-14S839表示标记B-76的引物在亲本14S839中的扩增结果；B-76-14S162表示标记B-76的引物在亲本14S162中的扩增结果。

图6中的 P1、P2分别是紫色亲本材料14S839成熟期的叶球外观和叶球剖面；O1、O2分别是橙色亲本材料14S162成熟期的叶球外观和叶球剖面。

<110> 西北农林科技大学

<120> 与大白菜紫色叶球基因BrPur连锁的SSR分子标记扩增产物序列

<160> 16

<210> 1

<211> 152bp

<212> DNA

<213> B-76-14S839.sep

<400> 1

TGGAACGCAA ATGAACCCTC ATAGAACACT TTCGTTTTGA TTTTAGTTGA TAAAT 55

TTTCTCTTAG GATTAAATTT TGATATATAT ATATATATAT ATA....... .ACTT 102

TAATTGATCT TCTGATACGC TAAAACTGAA CTTATGTGAA TTTTGCCATC 152

<210> 2

<211> 160bp

<212> DNA

<213> B-76-14S162.sep

<400> 2

TGGAACGCAA ATGAACCCTC ATAGAACACT TTCGTTTTGA TTTTAGTTGA TAAAT 55

TTTCTCTTAG GATTAAATTT TGATATATAT ATATATATAT ATATATATAT AACTT 110

TAATTGATCT TCTGATACGC TAAAACTGAA CTTATGTGAA TTTTGCCATC 160

<210> 3

<211> 140bp

<212> DNA

<213> SSR14-36-14S839.sep

<400> 3

TAAACCTAAA AATACATCTG CTTCCATATA TATATATATA TATATATATA ACAAT 55

GATATACTAC ATTTTATCAA AATAAATTAA TAATCTATAT TAGTATTTAA AAAGT 110

AATTTTTCGC ATTCAAGCTC TCACGTTAAA 140

<210> 4

<211> 128bp

<212> DNA

<213> SSR14-36-14S162.sep

<400> 4

TAAACCTAAA AATACATCTG CTTCCATATA TATATGTA.. .......... ACAAT 43

GATATACT ACATTTTA TCAAAATA AATTAATA ATCTATAT TAGTATTT AAAAAGT 98

AATTTTTC GCATTCAA GCTCTCAC GTTAAA 128

<210> 5

<211> 20bp

<212> DNA

<213> 引物对B-76上游人工序列

<400> 5

TGGAACGCAA ATGAACCCTC 20

<210> 6

<211> 25bp

<212> DNA

<213> 引物对B-76下游人工序列

<400> 6

GATGGCAAAA TTCACATAAG TTCAG 25

<210> 7

<211> 25bp

<212> DNA

<213> 引物对SSR14-36上游人工序列

<400> 7

TAAACCTAAA AATACATCTG CTTCC 25

<210> 8

<211> 22bp

<212> DNA

<213> 引物对SSR14-36上游人工序列

<400> 8

TTTAACGTGA GAGCTTGAAT GC 22

<210> 9

<211> 22bp

<212> DNA

<213> 引物对B-31上游人工序列

<400> 9

GGTCAAAACC TTTCAGAACT CCC 23

<210> 10

<211> 25p

<212> DNA

<213> 引物对B-31下游人工序列

<400> 10

AATCTTATCT TTTGGTTTGG TGCTG 25

<210> 11

<211> 22bp

<212> DNA

<213> 引物对B-51上游人工序列

<400> 11

TGGATTTGGT TAGGTGGTCA GC 22

<210> 12

<211> 22bp

<212> DNA

<213> 引物对B-51下游人工序列

<400> 12

CATGCACTTT GGGTGGAGAT AC 22

<210> 13

<211> 21bp

<212> DNA

<213> 引物对SSR14上游人工序列

<400> 13

CGAGTTGACC TGCGAACATT G 21

<210> 14

<211> 21bp

<212> DNA

<213> 引物对SSR14下游人工序列

<400> 14

CGATTCCTTC ATATTTGGTT TCAC 24

<210> 15

<211> 22bp

<212> DNA

<213> 引物对SSR17上游人工序列

<400> 15

CTCTCAATCC CTCAATCAAA CC 22

<210> 16

<211> 21bp

<212> DNA

<213> 引物对SSR17下游人工序列

<400> 16

AGGAGGCGTG CGGTTATG 18