本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种发酵液中提取纯化他克莫司的方法。
背景技术：
他克莫司(Tacrolimus)又名普乐可复，为白色或类白色结晶体，化学式为C44H69NO12·H2O，分子量为822.05，易溶解于乙醇、甲醇、丙酮、乙腈、乙酸乙酯和氯仿，几乎不溶于水。他克莫司是由日本藤泽制药公司率先提取得到的一种真菌代谢产物，属于免疫抑制性大环内酯类药物。
现代工业主要采用筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)、链霉菌等进行微生物发酵，进而进行提取纯化获得他克莫司。由于他克莫司的结构复杂，发酵液中还含有他克莫司类似物，如子囊霉素和二氢他克莫司，因此，难以通过常规的纯化技术纯化得到高纯度的他克莫司，通常需要通过硅胶柱层析进行纯化。
中国专利申请CN101712686公开了一种发酵液中他克莫司的分离纯化方法，包括过滤收集菌体、有机溶剂浸提菌体、大孔树脂吸附、萃取浓缩、硅胶柱层析等步骤，使用含乙酸乙酯的正己烷溶液、含乙酸乙酯的环己烷溶液、含丙酮的正己烷溶液、含丙酮的环己烷溶液、含乙醇的正己烷溶液或含乙醇的环己烷溶液作为硅胶柱层析的洗脱液，虽然得到的他克莫司纯度高达95.8％，但仍无法达到原料药的要求。
技术实现要素：
为解决现有技术中存在的问题，发明人通过大量试验对大孔树脂柱和硅胶柱的操作条件进行摸索，预料不到地发现：通过添加一定量的醋酸，以正己烷、乙酸乙酯和醋酸组成的洗脱组合物进行洗脱，可以实现他克莫司与他克莫司类似物的高效分离，提高了他克莫司的纯度。基于上述发现，从而完成本发明。
发明人通过色谱检测发现，目标产物他克莫司是一水化合物，易在含水溶媒中形成互变异构体。由于大孔树脂的流动相往往需要使用水作为溶剂，对此，发明人对大孔树脂柱的柱温进行考察，令发明人惊奇的是：通过降低大孔树脂柱的柱温至16～19℃，可以避免他克莫司的互变异构体形成，解吸液中检测不到他克莫司的互变异构体，减少了他克莫司的损失，提高了他克莫司的收率和纯度。
本发明提供一种发酵液中提取纯化他克莫司的方法，包括如下步骤：
S1发酵液的固液分离：向发酵液中，加入过滤助剂，搅拌，过滤，收集滤渣；
S2丙酮浸提：向所述滤渣中以3～8mL/g滤渣的比例加入丙酮，超声提取2～3次，过滤并合并滤液，得到浸提液；
S3浸提液浓缩及大孔树脂处理：将所述浸提液减压浓缩得到第一浓缩液，经大孔树脂柱床吸附，大孔树脂柱床与第一浓缩液的体积比为1：4～8，使用4～8倍大孔树脂柱床体积的体积浓度30～45％的丙酮溶液进行冲洗，柱床温度为16～19℃，然后使用0.5～2倍大孔树脂柱床体积的体积浓度65～80％的丙酮溶液进行解吸，收集解吸液；
S4解吸液处理：将所述解吸液减压浓缩得到第二浓缩液，加入第二浓缩液2～4倍体积的乙酸乙酯萃取2～3次，减压浓缩得到油状物，加入油状物1～3倍体积的正己烷溶解，得到待层析液；
S5硅胶柱层析：将所述待层析液上硅胶柱层析，柱温18～22℃，使用正己烷、乙酸乙酯和醋酸组成的洗脱组合物进行洗脱，收集层析液；
S6层析液处理：将所述层析液减压浓缩得到第三浓缩液，加入第三浓缩液2～4倍体积的乙酸乙酯萃取2～3次，加入乙酸乙酯体积4～5％的正己烷，冷却至1～10℃析晶，收集晶体，真空干燥，得到他克莫司。
优选地，所述洗脱包括：正己烷、乙酸乙酯和醋酸以3～5：2～3：0.1～0.4的体积比组成的组合物4～6倍柱体积，正己烷、乙酸乙酯和醋酸以1～2：3～5：0.1～0.4的体积比组成的组合物8～15倍柱体积。
更优选地，所述洗脱包括：正己烷、乙酸乙酯和醋酸以4：2：0.2的体积比组成的组合物5倍柱体积，正己烷、乙酸乙酯和醋酸以2：4：0.2的体积比组成的组合物12倍柱体积。
优选地，所述超声的频率为35～40kHz，时间为20～30min。
优选地，所述大孔树脂为非极性大孔树脂。具体的如非极性大孔树脂D4020、非极性大孔树脂LX1180等。
优选地，所述过滤助剂包括：0.5～2％(w/v)的硫酸锌、0.5～2％(w/v)的无水氯化钙和1～5％(w/v)的硅藻土，以发酵液体积计。
优选地，所述减压浓缩的温度为35～55℃。
优选地，所述析晶的温度为3～6℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了一种发酵液中提取纯化他克莫司的方法，通过降低大孔树脂柱的柱温至16～19℃，可以避免他克莫司的互变异构体形成，解吸液中检测不到他克莫司的互变异构体，减少了他克莫司的损失，提高了他克莫司的收率和纯度；通过添加一定量的醋酸，以正己烷、乙酸乙酯和醋酸组成的洗脱组合物进行洗脱，可以实现他克莫司与他克莫司类似物的高效分离，提高了他克莫司的纯度，最终得到的他克莫司的含量高达98.5％以上，子囊霉素和二氢他克莫司的含量均低于0.2％，可以满足原料药的要求。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做进一步的详细说明。
本发明实施例中，所使用的材料和试剂均为常规市售产品，或可通过本领域的常规方法获得。
实施例一 滤渣的获得及浸提
向筑波链霉菌的发酵液中，加入发酵液体积1％(w/v)的硫酸锌、1％(w/v)的无水氯化钙和2％(w/v)的硅藻土，搅拌，过滤，收集滤渣；向所述滤渣中以6mL/g滤渣的比例加入丙酮，超声提取2次，超声的频率为35kHz，时间为25min，过滤并合并滤液，得到浸提液。
实施例二 大孔树脂处理
将按实施例一方法得到的浸提液减压浓缩得到第一浓缩液，经大孔树脂LX1180柱床吸附，大孔树脂柱床与第一浓缩液的体积比为1：6，使用6倍大孔树脂柱床体积的体积浓度35％的丙酮溶液进行冲洗，柱床温度为18℃，然后使用1.5倍大孔树脂柱床体积的体积浓度70％的丙酮溶液进行解吸，收集解吸液。
对比例一 大孔树脂处理
将按实施例一方法得到的浸提液减压浓缩得到第一浓缩液，经大孔树脂LX1180柱床吸附，大孔树脂柱床与第一浓缩液的体积比为1：6，使用6倍大孔树脂柱床体积的体积浓度35％的丙酮溶液进行冲洗，柱床温度为25℃，然后使用1.5倍大孔树脂柱床体积的体积浓度70％的丙酮溶液进行解吸，收集解吸液。对比例一与实施例二的区别在于柱床温度由18℃变为25℃。
对比例二 大孔树脂处理
将按实施例一方法得到的浸提液减压浓缩得到第一浓缩液，经大孔树脂LX1180柱床吸附，大孔树脂柱床与第一浓缩液的体积比为1：6，使用6倍大孔树脂柱床体积的体积浓度35％的丙酮溶液进行冲洗，柱床温度为22℃，然后使用1.5倍大孔树脂柱床体积的体积浓度70％的丙酮溶液进行解吸，收集解吸液。对比例二与实施例二的区别在于柱床温度由18℃变为22℃。
实施例三 解吸液的检测
分别对实施例二、对比例一和对比例二的解吸液进行色谱检测，并进行图谱的对比，结构发现：发现对比例一和对比例二分别在相对保留时间(RRT)1.1和1.3处有明显的特征峰，经质谱检测为他克莫司的互变异构体；而实施例二并未出现该特征峰，未检出他克莫司的互变异构体。
实施例四 硅胶柱层析及后处理
将按实施例二方法得到的解吸液减压浓缩得到第二浓缩液，加入第二浓缩液3倍体积的乙酸乙酯萃取2次，减压浓缩得到油状物，加入油状物2倍体积的正己烷溶解，得到待层析液；将所述待层析液上硅胶柱层析，柱温20℃，使用正己烷、乙酸乙酯和醋酸组成的洗脱组合物进行洗脱，洗脱包括：正己烷、乙酸乙酯和醋酸以4：2：0.2的体积比组成的组合物5倍柱体积，然后正己烷、乙酸乙酯和醋酸以2：4：0.2的体积比组成的组合物12倍柱体积，收集12倍柱体积部分，得到含他克莫司的层析液；将所述层析液减压浓缩得到第三浓缩液，加入第三浓缩液3倍体积的乙酸乙酯萃取2次，加入乙酸乙酯体积5％的正己烷，冷却至4℃析晶，收集晶体，真空干燥，得到他克莫司，以按实施例一方法得到的浸提液中他克莫司含量计，他克莫司的的质量收率为84.6％。经色谱检测，他克莫司的含量高达99.2％，子囊霉素的含量为0.08％，二氢他克莫司的含量为0.11％，可以满足原料药的要求。
对比例三 硅胶柱层析及后处理
将按实施例二方法得到的解吸液减压浓缩得到第二浓缩液，加入第二浓缩液3倍体积的乙酸乙酯萃取2次，减压浓缩得到油状物，加入油状物2倍体积的正己烷溶解，得到待层析液；将所述待层析液上硅胶柱层析，柱温20℃，使用正己烷和乙酸乙酯组成的洗脱组合物进行洗脱，洗脱包括：正己烷和乙酸乙酯以4：2的体积比组成的组合物5倍柱体积，然后正己烷和乙酸乙酯以2：4的体积比组成的组合物12倍柱体积，收集12倍柱体积部分，得到含他克莫司的层析液；将所述层析液减压浓缩得到第三浓缩液，加入第三浓缩液3倍体积的乙酸乙酯萃取2次，加入乙酸乙酯体积5％的正己烷，冷却至4℃析晶，收集晶体，真空干燥，得到他克莫司，以按实施例一方法得到的浸提液中他克莫司含量计，他克莫司的的质量收率为85.1％。经色谱检测，他克莫司的含量达95.2％，子囊霉素的含量为0.23％，二氢他克莫司的含量为0.36％，无法满足原料药的要求。
对比例三与实施例四的区别在于洗脱组合物由正己烷和乙酸乙酯组成，不含醋酸。
对比例四 硅胶柱层析及后处理
将按实施例二方法得到的解吸液减压浓缩得到第二浓缩液，加入第二浓缩液3倍体积的乙酸乙酯萃取2次，减压浓缩得到油状物，加入油状物2倍体积的正己烷溶解，得到待层析液；将所述待层析液上硅胶柱层析，柱温20℃，使用正己烷、乙酸乙酯和磷酸组成的洗脱组合物进行洗脱，洗脱包括：正己烷、乙酸乙酯和磷酸以4：2：0.2的体积比组成的组合物5倍柱体积，然后正己烷、乙酸乙酯和磷酸以2：4：0.2的体积比组成的组合物12倍柱体积，收集12倍柱体积部分，得到含他克莫司的层析液；将所述层析液减压浓缩得到第三浓缩液，加入第三浓缩液3倍体积的乙酸乙酯萃取2次，加入乙酸乙酯体积5％的正己烷，冷却至4℃析晶，收集晶体，真空干燥，得到他克莫司。经色谱检测，他克莫司的含量达95.8％，子囊霉素的含量为0.18％，二氢他克莫司的含量为0.29％，无法满足原料药的要求。以按实施例一方法得到的浸提液中他克莫司含量计，他克莫司的的质量收率为84.2％。
对比例四与实施例四的区别在于洗脱组合物由正己烷、乙酸乙酯和磷酸组成，不含醋酸。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。