用于治疗肿瘤的PD‑1封闭CIK的制备方法与流程

本发明涉及医疗领域，特别是用于治疗肿瘤的PD-1封闭CIK的制备方法。

背景技术：

程序性死亡受体1(PD-1)是一种表达于T细胞表面的蛋白质分子，当PD-1与其配体PD-L1或PD-L2结合时可抑制下游NF-κB基因的转录，抑制干扰素-δ的分泌，从而抑制T细胞杀伤活性。PD-L1或PD-L2表达于多种肿瘤细胞，如肺癌、乳腺癌、胃癌、食管癌、肝细胞癌、恶性黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、肾细胞癌以及尿路上皮癌等肿瘤组织高表达PD-L1。T细胞表面的PD-1与表达于肿瘤细胞上的PD-L1结合所引起的T细胞细胞毒活性抑制是肿瘤细胞逃避免疫监视和杀伤的重要机制之一。采用PD-1抗体或PD-L1抗体阻断PD-1与PD-L1、PD-L2的结合，可使T细胞的杀瘤活性不受抑制，从而提高T细胞杀瘤的效果。研究证实采用PD-1单克隆抗体静脉输注治疗恶性黑色素瘤、肺鳞癌、结肠癌及肾癌等肿瘤收到良好的治疗效果。然而，静脉输注进入体内的PD-1抗体将被人体4000ml-5000ml的血液稀释，因此为了维持有效药物浓度需要输注PD-1抗体的量较大。同时血液成分、淋巴组织微环境结构与成分复杂，不仅会造成PD-1抗体的损耗也会影响到PD-1抗体与T细胞表面的PD-1的结合。

CIK是多种细胞因子诱导的杀伤细胞，现行CIK激活培养方法易于获得大量的效应细胞。然而这些效应细胞有较高的PD-1表达率，这在一定程度上影响了CIK的肿瘤杀伤效果和临床疗效。正在申请阶段的专利技术CN201511018960.1、CN201610278810.2、CN201410573897.7及CN201410573311.7，在自体外周血淋巴细胞体外培养过程中加入PD-1抗体，收集细胞时洗弃未结合的PD-1抗体。治疗用淋巴细胞培养过程中培基量通常在1500ml左右，培基的总体积较大，PD-1抗体的用量依然较大，同时培养后未结合的PD-1抗体在洗细胞时随培基弃掉，造成一定的浪费。另外，在培养过程中细胞的分泌物与代谢产物，在一定程度上可影响的PD-1抗体与PD-1的结合，从而影响PD-1的封闭效果。

治疗用PD-1抗体的价格昂贵，静脉输注或CIK培养过程中加入PD-1抗体，PD-1抗体的用量大、成本高及PD-1封闭效果易受影响等弊端，极大地影响了PD-1抗体的临床应用。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，旨在提供一种细胞增殖倍数大、杀伤活性高且制备成本低的肿瘤杀伤效应细胞的制备方法。本发明的技术方案为：用于治疗肿瘤的PD-1封闭CIK的制备方法，包含如下步骤：抗人CD3单克隆抗体包被细胞培养瓶；激活步骤，利用所述CD3单克隆抗体、IFNγ以及IL-2激活培养淋巴细胞；清洗步骤，清洗三次激活培养后的所述淋巴细胞；封闭步骤，用20-50ml生理盐水悬浮所述清洗后的淋巴细胞，得到悬浮细胞溶液，向所述悬浮细胞溶液中加入PD-1单克隆抗体，18-25℃混悬孵育30分钟得到细胞悬液。

优选地，所述的用于治疗肿瘤的PD-1封闭CIK的制备方法进一步包含步骤：过滤步骤，向所述细胞悬液中加入细胞分散剂200目滤网过滤后补加生理盐水至300ml得到回输液。

优选地，所述抗人CD3单克隆抗体包被细胞瓶包含如下步骤：采用0.01M PH9.6的PBS溶液稀释甲级纯化抗人CD3单克隆抗体到浓度50-70ng/ml；将稀释后的所述甲级纯化抗人CD3单克隆抗体加入到培养瓶中，4℃放置24小时以上。

优选地，所述激活步骤包含如下步骤：将肝素抗凝血注入离心管A中,4℃温度下以3000rpm离心5min；取上层血浆移入离心管B，56℃水浴30min,在4℃温度下以3000rpm离心15min，收集上清，4℃保存备用；下层血细胞留于离心管A中备用；生理盐水悬浮所述离心管A中的所述血细胞，将制得的血细胞悬液缓慢加入到装有4ml的密度为1.077±0.001的Ficoll-Hypaque的离心管中，在4℃温度下以3000rpm离心20min；收集单个核细胞层细胞并采用离心法清洗所述细胞三次；加入无血清培基重悬，制得无血清培基悬浮细胞；将所述的无血清培基悬浮细胞中加入到含有所述抗人CD3单克隆抗体包被的培养瓶中，加入灭活血浆并补加入无血清培基，37℃、5％CO₂条件下培养24小时；向培养瓶中加入IFNγ，37℃、5％CO₂条件下培养4-6天；取培养后的细胞移入细胞培养袋中，加入无血清培基、灭活血浆和IL-2，37℃、5％CO₂条件下培养4-5天；补加无血清培基和IL-2，37℃、5％CO₂条件下培养4-5天。

优选地，在所述清洗步骤前还包含：检验步骤，进行细胞培养后检测细胞数量，并利用PCR技术检测培养上清液中的支原体。

本发明的有益效果为：PD-1单克隆抗体的用量少，PD-1分子封闭效果好，PD-1封闭的CIK的肿瘤杀伤活性高。同时具有操作简单、制备成本低和便于临床应用的特点。

附图说明

图1为CIK细胞的PD-1分子的表达率；

图2为PD-1单克隆抗体封闭CIK细胞PD-1分子的检出率；

图3为CIK与PD-1封闭CIK的肿瘤细胞杀伤率比较。

具体实施方式

下面结合附图、通过具体实施例对本发明作进一步详述。以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

实验器材

低温常速离心机(美国，Beckman)、CO₂细胞培养箱(日本，Sanyo)、移液器(美国,Thermo)、刻度吸管(美国，Kimble)、75cm²培养瓶(美国，Corning)、15ml离心管(美国，Corning)、50ml离心管(美国，Corning)、细胞刮刀(美国，Corning)、细胞滤器(美国，Corning)、倒置显微镜(日本，Nikon)、冻存管(美国，Corning)，96孔细胞培养板(美国，Corning)、酶标仪(美国，BioTek)、流式细胞仪(美国，BD)。

实验试剂

Ficoll-Hypaque细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限责任公司))、氯化钠注射液(石家庄四药公司)、肝素钠(上海第一生化药业有限公司)、IFN-γ(北京四环生物制药有限公司)、IL-2(北京双鹭药业股份有限公司)、甲级纯化抗人CD3单克隆抗体(美国，eBioscience)、无血清培基(美国，Thermo)、人血清白蛋白(山西康宝生物制品股份有限公司)、Pembrolizumab(美国，MSD)、FITC标记鼠抗人CD3单克隆抗体(美国，BD)、PE标记兔抗人PD-1单克隆抗体(美国，eBioscience)、Hank’s液(配制方法：1.甲液：NaCl 160g、KCl8g、MgSO₄·7H₂O 2g、MgCl₂·6H₂O 2g加入到800ml三蒸水，溶解。CaCl₂2.8g溶于100ml三蒸水，溶解后加入到上述800ml溶液中，补足三蒸水至1000ml。2.乙液：Na₂HPO₄·12H₂O 3.04g、KH₂PO₄1.2g、葡萄糖20g加入800ml双蒸水，溶解。加入0.4％酚红溶液100ml，上述二液混合，加三蒸水至1000ml。使用时按甲液1份、乙液1份、三蒸水18份滤过，8磅20min分钟灭菌，4℃保存)、NaCl(国药泸试)、KCl(国药泸试)、MgSO₄·7H₂O(天津致远化学有限公司)、MgCl₂·6H₂O(天津致远化学有限公司)、CaCl₂(天津博迪化学有限公司)、Na₂HPO₄·12H₂O(天津市光复科技发展有限公司)、KH₂PO₄(天津致远化学有限公司)、葡萄糖(国药泸试)、酚红(上海宝曼生物科技有限公司)、SCG7901胃癌细胞(上海细胞保藏中心)。

CD3单克隆抗体包被：采用0.01M PH9.6的PBS溶液稀释甲级纯化抗人CD3单克隆抗体到浓度50-70ng/ml，将此抗人CD3单克隆抗体加入到75cm²培养瓶中，每瓶30-50ml,4℃放置1至7天，使用前吸尽PBS溶液。或通过冷冻干燥法去除PBS后CD3单克隆抗体包被的细胞培养瓶可较长期4℃保存。细胞培养前加入20ml培基清洗瓶壁，平放培养瓶使培基覆盖包被侧瓶壁，静置10分钟，吸弃培基，备用。

PD-1封闭CIK的制备：将50ml肝素抗凝血注入50ml离心管A中,4℃温度下以3000rpm离心5min。将上层血浆移入50ml离心管B，56℃水浴30min,在4℃温度下以3000rpm离心15min，收集上清，4℃保存备用。

向所述离心管A中加入Hank’s液或生理盐水至48ml，混匀。将血细胞悬液缓慢加入到装有4ml的Ficoll-Hypaque(密度：1.077±0.001)的15ml离心管中，8ml/管，在4℃温度下以3000rpm离心20min。收集单个核细胞(PBMC)并将其移入1个50ml离心管中，加Hank’s液或生理盐水至50ml，在4℃温度下以3000rpm离心5min，弃上清,重复3次。

加入10ml无血清培基悬浮上述沉淀细胞，将细胞悬液加入到抗人CD3单克隆抗体包被的75cm²培养瓶中，加上述B管血浆8ml,优选的血浆为病人自体血浆，能防止过敏反应，并加入无血清培基至80ml，37℃、5％CO₂条件下培养24小时。向培养瓶中加入IFNγ，IFNγ的终浓度为1000U/ml，37℃、5％CO₂条件下培养4-6天左右。显微镜下观察细胞长满培养瓶时，采用刻度吸管和瓶中培基将细胞从瓶壁上冲下来并将细胞悬液移入1500-2000ml细胞培养袋中，加入500ml无血清培基、10ml上述B管血浆和IL-2(终浓度为300-500U/ml)，37℃、5％CO₂条件下培养4-5天。补加无血清培基1000ml和IL-2(3×10⁵-5×10⁵U)，37℃、5％CO₂条件下培养2天。

取培养液20ml进行细菌培养并利用PCR技术检测支原体。其他细胞(培养袋中的细胞)继续培养2天,收集细胞，在4℃下以3000rpm离心5min，弃上清。生理盐水加至50ml,在4℃下以3000rpm离心5min，弃上清,重复3次。

加20-40ml生理盐水,混匀，加入200μg抗人PD-1单克隆抗体(终浓度为50-250μg/ml)，混匀。室温(18℃-25℃)孵育30min。加浓度为200mg/ml的人血清白蛋白4-10ml，加生理盐水至50ml,200目滤网过滤，将细胞悬液移入输液袋中，加生理盐水至300ml，热合封口，粘贴标签，用于静脉回输(细胞总数：1×10⁸-1×10⁹)。

效果测试

取CIK与PD-1封闭的CIK，分别进行CD3、PD-1免疫荧光双染色及细胞毒实验。CD3、PD-1免疫荧光双染色实验：取CIK与PD-1封闭的CIK细胞悬液各0.5ml分别加到2个试管中，800rpm离心5min，吸弃上清，轻轻震荡，混匀细胞，每个试管同时加入FITC标记鼠抗人CD3单克隆抗体和PE标记兔抗人PD-1单克隆抗体100μl,混匀，室温孵育30分钟。加入5ml 0.01MPH7.4PBS,在4℃下以1000rpm离心5min，弃上清,重复3次。加入1ml 0.01MPH7.4PBS悬浮细胞，流式细胞仪检测，结果显示封闭前CIK的PD-1阳性细胞率为38.02％±16.43％，封闭后降至3.12％±0.52％，封闭后PD-1检出率明显降低(P<0.05)，表明本发明方法具有良好的封闭PD-1分子的效果，结果如图1、图2所示。

细胞毒实验:用RPMI1640全培养基(含10％的小牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素)将CIK、PD-1封闭的CIK调成1×10⁵c/ml，将SCG7901肿瘤细胞调成1×10⁴c/ml。分别将上述细胞加入到96孔细胞培养板中。A孔加CIK细胞或PD-1封闭的CIK，100μl/孔；B孔加SCG7901肿瘤细胞，100μl/孔；C孔每孔加100μl CIK或PD-1封闭的CIK后，再加入SCG7901肿瘤细胞每孔100μl。37℃、5％CO₂条件下培养72小时，各孔中加入5mg/ml MTT，20μl/孔，继续培养4小时。1000rpm离心10min，吸弃上清180μl，加入DMSO，100μl/孔，混匀，酶标仪450nm测定OD值。杀伤率计算方法为杀伤率＝[1-(C-A)/B]×100％。细胞毒实验结果显示CIK、PD-1封闭的CIK的肿瘤细胞杀伤率分别为：47.82％±12.24％与73.3％±15.62％，PD-1封闭的CIK的肿瘤细胞杀伤率明显高于CIK的肿瘤细胞杀伤率(P<0.05)，证实PD-1封闭CIK的肿瘤杀伤活性明显提高，结果如图3所示。