一种单增李斯特菌显色培养基及测试片的制作方法

本发明属于微生物学检验领域，特别涉及一种用于检测单增李斯特菌的显色培养基及用显色培养基制作的测试片。

背景技术：

单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)广泛存在于自然界，是一种能够引起动物和人类李斯特菌病的主要致病菌。孕妇、婴幼儿、免疫耐受病人的感染死亡率高达20％～30％，远高于其他常见食源性病原菌。该菌是20世纪90年代四大食源性疾病致病菌之一，已经被WHO列为重点检测的食源性病菌之一。

单增李斯特菌检验的国标方法(GB/T 4789.30-2010)，从取样，增菌，然后用不同的培养基进行分离纯化，再进行生理生化鉴定需要7天，准备和收尾工作较繁重，操作流程繁琐，需较多人力物力，不利于单增李斯特菌的及时检验和监督，限制了该方法的实际应用。采用快速、准确、方便的方法进行微生物的检测是一种发现趋势。

通过观察或检测病原微生物产生的特异性酶与底物接触产生颜色变化，而发展起来的特异性酶显色技术，具有所需时间短、灵敏度高的，特异性强和准确率高的优点。CN104388522A公开了一种单增李斯特菌选择性显色培养基，其中每1000mL培养基含有如下重量的组分：心-脑提取物5-20g、琼脂2-6g、蛋白胨2-5g、特异性酶显色底物0.1-1g、二甲基甲酰胺0.05-20g、硫酸镁0.2-0.5g、氯化锂0.2-0.5g、除氧剂0.3-0.6g、3-吗啉代丙烷-1-磺酸0.2-1.0g、杂菌抑制剂6-17g、余量为水；所述特异性酶显色底物是5-溴-4-氯-3-吲哚-肌醇-1-磷酸盐。该方案中的显色培养基需要进行高压蒸汽120℃灭菌15min，且显色剂的用量较大，生产成本相对较高。

CN105349611A公开了一种食品和餐饮具中单增李斯特菌快速检测冷水凝胶试纸片及其制备方法与应用，属于微生物安全检验检测技术领域。本发明利用冷水凝胶以层析滤纸为载体，将培养基成分、显色剂和冷水凝胶混合，均匀地负载到层析滤纸上，样品可均匀分布于冷水凝胶，在其表面形成鲜明的菌落特征，使单增李斯特菌实现快速准确定性、定量检测。且本发明以新型化合物(2R,3S,4R,5R,6R)-1,2,3,4,5-五羟基环己基-(2-硝基-4-氟苯基)磷酸酯为显色剂，与传统单增李斯特菌显色培养基相比较，其反应的灵敏度和特异性大大优于传统培养基，且耐辐照，化学稳定性更强。另外，本发明制得的试纸片成本低廉，操作方法简便，简化到一步法即可完成，且检测时间只需24～36h。该方案严重依赖于新型显色剂，合成工序较为复杂，检测成本相对高昂。

由于显色剂一般占据着显色培养基的大部分成本，开发一种特异性酶显色底物用量低的显色培养基，降低显色培养基和测试片的成本，也具有非常实际的意义。

另外，现有的显色培养基普遍需要使用高压灭菌设备，而很多基层检测单位不具备这种灭菌条件，开发出一种能够在常规条件下加热煮沸灭菌即可使用的培养基，可以大大简化培养基的灭菌操作，利于推广使用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种单增李斯特菌显色培养基及使用该培养基制备得到的快检测试片。

本发明所采取的技术方案是：

一种单增李斯特菌显色培养基，每1000mL培养基中含有蛋白胨7-25g、酵母浸出粉4-10g、氯化钠4-15g、丙酮酸钠0.5-3g、氯化锂0.5-5g、甘油磷酸镁0.5-3g、特异性酶显色底物0.02-0.15g、杂菌抑制剂20-200mg。

作为上述单增李斯特菌显色培养基的进一步改进，每1000mL培养基中含有蛋白胨8-18g、酵母粉5-8g、氯化钠5-9g、丙酮酸钠1-3g、氯化锂0.5-3g、甘油磷酸镁1-3g、特异性酶显色底物0.04-0.12g、杂菌抑制剂40-150mg。

作为上述单增李斯特菌显色培养基的进一步改进，特异性酶为肌醇磷酸磷脂酶。特异性酶显色底物为5-溴-4-氯-3-羟基吲哚肌醇磷酸盐。

作为上述单增李斯特菌显色培养基的进一步改进，杂菌抑制剂由头孢他啶、硫酸多黏菌素、萘啶酮酸、两性霉素组成。头孢他啶、硫酸多黏菌素、萘啶酮酸、两性霉素质量比为1：(1-4)：(2-6)：(1-3)。

作为上述单增李斯特菌显色培养基的进一步改进，每1000mL培养基中还添加有琼脂12-18g。

一种单增李斯特菌测试片，由下到上依次为底板，吸水凝胶层、滤纸层和上盖膜，滤纸层吸附有上述的单增李斯特菌显色培养基。

一种单增李斯特菌检测方法，包括将样品液滴加至上述含琼脂的单增李斯特菌显色培养基中，或单增李斯特菌测试片上，37℃恒温培养24～36小时，显色培养基或者测试片上出现蓝绿色的菌点即为单增李斯特菌阳性菌落。

本发明的有益效果是：

1)本发明的显色培养基，特异性酶显色底物的使用量少，大幅降低培养基的成本。

2)本发明的显色培养基，制备方法简单，灭菌步骤简单，简化了对灭菌条件的要求，非常有利于基层检测单位的使用。

3)本发明的显色培养基使用方便，加样后在37℃恒温培养24～36h即可完成单增李斯特菌的检测，可以节省大量的人力物力。

附图说明

图1单增李斯特菌显色培养基接种单增李斯特菌效果图；

图2单增李斯特菌测试片接种单增李斯特菌效果图；

图3单增李斯特菌显色培养基和测试片保质期测试图。

具体实施方式

本发明的培养基和测试片可以按常规方法制备得到，便于比较起见，本发明的培养基和测试片按如下方法制备得到。

培养基的制备方法如下：

1)显色剂用二甲基甲酰胺溶解，制成母液加入培养基中混匀；

2)将除抑菌剂以外的成分，加水搅拌煮至沸腾，所有原料溶解后保持沸腾3-5分钟进行灭菌；

3)待培养基温度降至40～50℃时，加入杂菌抑制剂成分并混匀，即可以进行倒平板，制备成相应的显色培养基平板。

测试片的制备方法如下：

1)按照吸水凝胶各组分比例配制吸水凝胶，将其均匀的涂在底板上，25℃抽湿去水，制成涂有吸水凝胶的底板；

2)显色剂用二甲基甲酰胺溶解，制成母液加入到不含琼脂成分的培养基中，混匀；

3)将滤纸加入到培养基中吸附培养基，然后贴在涂有吸水凝胶的底板上，25℃抽湿去水；

4)贴上盖膜，钴60辐射灭菌，即制成测试片。

实施例1

每1000mL培养基中含有蛋白胨7g、酵母浸出粉10g、氯化钠4g、丙酮酸钠3g、氯化锂0.5g、甘油磷酸镁3g、特异性酶显色底物0.02g、杂菌抑制剂200mg。其中特异性酶显色底物为5-溴-4-氯-3-羟基吲哚肌醇磷酸钠。将上述成分溶于1000mL的水中，加入琼脂12g，加热煮沸两次，待培养基冷却到40-50℃，加入杂菌抑制剂混合物质量比为1：4：6：3头孢他啶、硫酸多黏菌素、萘啶酮酸、两性霉素，混匀即可使用。

实施例2

每1000mL培养基中含有蛋白胨25g、酵母浸出粉4g、氯化钠15g、丙酮酸钠0.5g、氯化锂5g、甘油磷酸镁0.5g、特异性酶显色底物0.07g、杂菌抑制剂20mg。其中特异性酶显色底物为5-溴-4-氯-3-羟基吲哚肌醇磷酸钾。将上述成分溶于1000mL的水中，加入琼脂15g，加热煮沸两次，待培养基冷却到40-50℃，加入杂菌抑制剂混合物质量比为1：1：2：1头孢他啶、硫酸多黏菌素、萘啶酮酸、两性霉素，混匀即可使用。

实施例3

每1000mL培养基中含有蛋白胨16g、酵母浸出粉6g、氯化钠5g、丙酮酸钠2.5g、氯化锂1.5g、甘油磷酸镁1.5g、特异性酶显色底物0.15g、杂菌抑制剂120mg。其中特异性酶显色底物为5-溴-4-氯-3-羟基吲哚肌醇磷酸铵。将上述成分溶于1000mL的水中,加入琼脂18g，加热煮沸两次，待培养基冷却到40-50℃，加入杂菌抑制剂混合物质量比为1：3：4：2头孢他啶、硫酸多黏菌素、萘啶酮酸、两性霉素，混匀即可使用。

实施例4

单增李斯特菌测试片，包括底板，吸水凝胶层、滤纸层和上盖膜，底板为不透水、不抑菌合成材料组成，吸水凝胶层由质量比为1：1：1：20的海藻糖：聚丙烯酸钠：瓜尔胶：羧甲基纤维素钠组成，滤纸材质为无纺布，吸附有实施例1单增李斯特菌显色培养基不加琼脂成分组成。上盖膜透明，透气不透水，印有正方形1cm×1cm的格子。

实施例5

单增李斯特菌测试片，包括底板，吸水凝胶层、滤纸层和上盖膜，底板为不透水、不抑菌合成材料组成，吸水凝胶层由质量比为1：4：5：60的海藻糖：聚丙烯酸钠：瓜尔胶：羧甲基纤维素钠组成，滤纸材质为无纺布，吸附有实施例2单增李斯特菌显色培养基不加琼脂成分组成。上盖膜透明，透气不透水，印有正方形1cm×1cm的格子。

实施例6

单增李斯特菌测试片，包括底板，吸水凝胶层、滤纸层和上盖膜，底板为不透水、不抑菌合成材料组成，吸水凝胶层由质量比为1：2：2：40的海藻糖：聚丙烯酸钠：瓜尔胶：羧甲基纤维素钠组成，滤纸材质为无纺布，吸附有实施例3单增李斯特菌显色培养基不加琼脂成分组成。上盖膜透明，透气不透水，印有正方形1cm×1cm的格子。

实施例1～3单增李斯特菌显色培养基制成平板，加样后37℃恒温培养24～36小时观察结果；实施例4～6单增李斯特菌测试片，加样后37℃恒温培养24～36小时观察结果。显色培养基或者测试片上出现蓝绿色的菌点即为单增李斯特菌阳性菌落(如图1和图2所示)。

特异性实验

将单增李斯特菌ATCC19115、英诺克李斯特菌ATCC33090、大肠埃希菌ATCC25922、弗柠檬酸杆菌ATCC43864、铜绿假单胞菌CMCC(B)10104、金黄色葡萄球菌ATCC6538、痢疾志贺菌CMCC(B)51252、白色假丝酵母ATCC10231、阪崎肠杆菌ATCC29544、副弧溶血性菌ATCC17802、肠炎门沙菌CMCC(B)50335、蜡样芽胞杆菌CMCC(B)63303、粪链球菌ATCC29212。将所有的标准菌株复壮纯化后，用无菌生理盐水制成10²～10³cfu/mL浓度的菌悬液，分别接种到本发明中的单增李斯特菌显色培养基(实施例1～3)和单增李斯特菌测试片(实施例4～6)，并用平板计数琼脂PCA检测菌悬液浓度(单增李斯特菌和英诺克李斯特菌用0.6％酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂TSA-YE平板计数)，每个设置两个重复。36℃±1℃倒置培养24～36h后观察并记录试验结果(见表1)。

表1、特异性试验结果

注：“+”表示阳性结果，有蓝绿色菌点出现；“－”表示阴性结果，无菌点生长或者无蓝绿色点出现。

由表1可以看出，只有单增李斯特菌能在显色培养基和测试片上面长出，其他12种质控菌株在显色培养基和测试片上不生长制或者显色为其他颜色，为阴性结果，说明单增李斯特菌显色培养基和测试片的特异性良好。

最低检出限试验

将单增李斯特菌标准菌株经纯化复壮后，用无菌生理盐水制备成10倍系列稀释标准菌悬液，对10^-8稀释度以后的标准菌进行倍半稀释，然后将各个稀释度菌悬液分别用本发明中单增李斯特菌显色培养基和测试片进行检测，同时与国标方法进行对比，每个设置两个重复，36℃±1℃倒置培养24～36h后观察并记录实验结果(见表2)。

表2、最低检出限试验结果

由表2可以看出，单增李斯特菌显色培养基和测试片都具有很高的灵敏度，单增李斯特菌显色培养基最低检测限可以达到1CFU/mL，单增李斯特菌测试片最低检出限可以达到2CFU/mL，对照的国标法培养基检测最低限度为3CFU/mL(见表2)。

人工染菌试验

将经过GB/T 4789.30—2010《食品安全国家标准，食品微生物学检验，单增李斯特菌检验》检测为单增李斯特菌阴性的样品，无菌操作称取25g(mL)样品加入到装有225mL无菌生理盐水的无菌均质袋中，用均质机打碎2min。将单增李斯特菌、英诺克李斯特菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌质控菌株在营养肉汤(单增李斯特菌用0.6％酵母浸膏的胰酪胨大豆液体培养基TSB-YE)中分别过夜培养活化后，按照随机比例制成混合菌悬液，吸取1mL混合菌悬液加入到样品液中，制成人工污染样品，放置4～5h后，选择合适的三个梯度分别用单增李斯特菌显色培养基、单增李斯特菌测试片、商品化OXOID李斯特菌显色培养基进行测试，每个设置两个重复。

表3、人工染菌样品试验

由表3可以看出，本发明的单增李斯特菌显色培养基与OXOID李斯特菌显色培养基的符合率为95.60％；通过本发明的单增李斯特菌显色培养基制作的测试片与OXOID显色培养基的符合率为102.39％。与国标法中的李斯特菌显色培养基的符合率在80％以上，说明效果好。

保质期试验

取生产包装好的单增李斯特菌显色培养基和单增李斯特菌测试片，分别放置于4-10℃冰箱，25℃，45℃分别进行储存。按照3天、7天、15天、30天、90天、180天、270天、360天、540天、720天分别接种质控菌株单增李斯特菌ATCC19115标准菌悬液进行测试，同时以OXOID李斯特菌显色培养基进行对比，不同温度下，符合率的变化曲线结果见图3。单增李斯特菌显色培养基和测试片保质期测试如表4所示。

表4、单增李斯特菌显色培养基和测试片保质期测试

由表4可以看出，单增李斯特菌显色培养基在4-10℃保存720天；25℃保存180d；45℃保存15天与OXOID显色培养基符合率都在80％以上。说明该培养基的贮存条件为4-10℃冰箱保存两年。李斯特菌显色培养基在不具备冷链配送的条件下，可以短时间(15天以下)常温运输。单增李斯特菌测试片在4-10℃保存540天；25℃保存90d；45℃保存7天与OXOID显色培养基符合率都在80％以上。说明该培养基的贮存条件为4-10℃冰箱保存一年半。该产品在不具备冷链配送的条件下，可以短时间(7天以下)常温运输。