一种铂基化氟硼二吡咯类化合物及制备方法和应用与流程

本发明涉及一种铂基化氟硼二吡咯类化合物及其制备方法和应用。

背景技术：

肿瘤正逐步威胁世界各国人民的生存质量，是本世纪最有待于攻克的医学难题，医学上以提高肿瘤的检测技术和治疗手段来对抗肿瘤带给人类的灾难。临床实践中对于肿瘤的检测常用的方法主要是影像学技术和病理学技术等，而治疗手段主要是通过手术治疗、化疗、放射治疗以及正在兴起的光动力治疗和光热治疗。然而单一的诊断和治疗方法难以达到理想的效果，将多种诊断和治疗方式进行有效的组合是解决当前肿瘤诊断与治疗局限性的重要手段和方式，目前临床主要是通过辐射影像辅助化疗结合放疗方式来诊断、治疗和控制肿瘤的生长，而这种方式往往会加剧患者的治疗痛苦，造成患者生活质量的急剧下降，因此，寻找一种安全有效的多模态方式在目前肿瘤诊断和治疗方面显得尤为重要。

氟硼二吡咯类荧光染料可用于光动力治疗方面的应用，光动力疗法是癌症治疗的新途径，它是借助光敏剂、光和氧气三者相互作用产生活性氧(主要是单重态氧)，利用该活性氧对肿瘤组织实施有效杀伤，这一种非入侵的治疗癌症的效率取决于光敏剂和与之相匹配的激发光，当光敏剂注入人体并代谢一段时间后，在肿瘤组织中的浓度要比在正常组织中高，此时若用相应波长的激光照射患处，可对肿瘤组织进行靶破坏。目前，卟啉衍生物是临床上应用最普遍的光动力治疗试剂，但是由于其感光性弱、体内选择性差等不足严重地限制了光动力治疗的发展。氟硼二吡咯荧光染料作为新兴的光敏分子，可通过引入溴或碘等重原子，大大增强系间窜越效率，在特定波长激发下与基态氧相互作用产生单态氧，并用于光动力学治疗，但光敏剂普遍存在水溶性较差、易光漂白、缺乏靶向性、氧依赖性等问题，导致其难以取得理想的治疗效果，临床应用受到极大的限制。

聚合物胶束是由具有两亲性质的嵌段聚合物在水溶液中自发形成的一种自组装结构，具有粒径小(10-100nm)、粒度分布窄、载药范围广、载药量高、结构稳定、体内滞留时间长和独特的体内分布等特点，两亲性嵌段聚合物胶束能对难溶性药物有效增溶，可作为抗肿瘤药、抗菌药、降压药、基因治疗药等药物载体，受到广泛关注。聚合物胶束体系作为一种新的肿瘤药物输送系统，显示出很多独特的优势：(1)受亲水性外核的保护，可以避免人体RES系统的非特异性摄取或肝、脾等组织的吸收，提高了药物的生物利用度；(2)聚合物胶束的粒径一般在100nm以下，可以通过肿瘤血管的渗透滞留(EPR)效应在肿瘤组织部位累积，从而达到更好的治疗效率；(3)由高分子材料自组装而成的聚合物胶束具有较低的临界胶束浓度，即使注射后经过大量的稀释也能够稳定存在，即该体系具有热力学和动力学稳定性；(4)聚合物胶束的疏水内核对疏水性药物的包封可以明显增加疏水性药物的溶解度，在体内运输的过程中可以避免药物的释放，降低药物的毒副作用；(5)对两亲性聚合物的表面做功能化修饰，可以使纳米胶束具有主动靶向功能。

近年来对聚合物胶束的研究取得了比较大的进展，目前已经有将聚合物胶束作为药物载体用于临床试验，如Yokoyama等用聚乙二醇和聚天冬氨酸的共聚物(PEG-b-P(Asp))制备成胶束用于包载抗癌药物多柔比星(DOX)，这种胶束被命名为NK911，一期临床研究表明其半衰期接近游离药物的3倍；Hamaguchi等人制备了包载紫杉醇的聚合物胶束，并且把由此制备的聚合物胶束命名为NK105。该研究组对NK105的体外细胞毒性、体内抗肿瘤活性、药动学、药效学及其神经毒性都进行了广泛的研究。

尽管线性聚合物胶束作为水难溶性药物的载体，在递药过程中已显示出巨大的优势和潜力，但存在胶束解聚、增溶效果不明显、单线态氧易淬灭、靶向性不足等的问题，明显限制了其在抗肿瘤药物如光敏剂靶向传输中的应用，为此，设计出一种能克服光敏剂高效靶向传输的新型分子结构。

有鉴于上述的缺陷，本设计人，积极加以研究创新，以期创设一种铂基化氟硼二吡咯类化合物及制备方法和应用，使其更具有产业上的利用价值。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种铂基化氟硼二吡咯类化合物，该化合物可以实现近红外吸收、且具有多模式治疗功能，利用该化合物制得的纳米胶束的系间窜越效率高、最大吸收波长和最大发射波长均大于600nm(最大吸收波长为658nm，最大发射波长为674nm)，水溶性好，在细胞水平及动物实验中表现出良好的抗肿瘤效果。

本发明的一种铂基化氟硼二吡咯类化合物，具有如下的结构式：

其中，R¹为聚乙二醇基团、聚乙二醇单甲醚基团、磷脂-聚乙二醇基团或聚乙烯醇基团。

进一步的，R¹的分子量为1000-10000。

本发明的一种铂基化纳米粒，由所述铂基化氟硼二吡咯类化合物制得，其中，纳米粒优选纳米胶束，所述纳米胶束的粒径为20-100nm。

本发明的一种铂基化氟硼二吡咯类化合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)式(Ⅱ)的氟硼二吡咯共轭体末端引入炔基，并以共价配位方式加载顺铂，得到式(Ⅲ)的末端含炔基的铂基化氟硼二吡咯衍生物；

(2)在式(Ⅲ)的末端含炔基的铂基化氟硼二吡咯衍生物的炔基端引入亲水聚合物链R¹，得到式(Ⅳ)的铂基化氟硼二吡咯类化合物，反应式如下：

其中，所述亲水聚合物链R¹为聚乙二醇基团、聚乙二醇单甲醚基团、磷脂-聚乙二醇基团或聚乙烯醇基团。

进一步的，在步骤(1)之前，还包括制备式(Ⅰ)的氟硼二吡咯衍生物、并由氟硼二吡咯衍生物制备式(Ⅱ)的氟硼二吡咯共轭体的步骤，制备铂基化氟硼二吡咯类化合物的总反应式如下：

具体为：将摩尔比为1：1-3：1-2：1-2：1-2：1-1.5的2,4-二甲基吡咯、对醛基吡啶、2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌、二异丙基乙胺、三氟化硼乙醚、三氟醋酸加入二氯甲烷、四氢呋喃和乙醚中的一种或几种的溶剂中，优选二氯甲烷，在室温(20-35℃)下反应6-36h，优选在惰性气体(如氮气)保护下进行，得到式(Ⅰ)的氟硼二吡咯衍生物，其中，溶剂与2,4-二甲基吡咯体积比为10-200：1；将摩尔比为1-3：1的对羟基苯甲醛和氟硼二吡咯衍生物溶于50mL甲苯中，并加入羧酸和有机胺，在100-120℃(回流)下反应6-24h，优选在惰性气体(如氮气)保护下进行，得到式(Ⅱ)的氟硼二吡咯共轭体，其中，所述羧酸为冰醋酸、对甲苯磺酸、三氟醋酸中的一种，所述有机胺为三乙胺、哌啶、二异丙基甲胺中的一种，羧酸和有机胺与氟硼二吡咯衍生物为1：1-3，第二溶剂与氟硼二吡咯衍生物体积比为10-200：1。

进一步的，步骤(1)中，将摩尔比为1-3：1的3-溴丙炔与式(Ⅱ)的氟硼二吡咯共轭体加入第一溶剂中，并加入碱，在55-75℃下反应2-24h，得到铂基化氟硼二吡咯类化合物前体；优选在避光条件下，将与步骤(1)中氟硼二吡咯共轭体的摩尔比为1：1：1-1.5的硝酸银、顺铂加入第二溶剂中，在55-75℃下反应2-24h，并取其上清液，向上清液加入得到的铂基化氟硼二吡咯类化合物前体，并在55-75℃下反应2-24h，得到末端含炔基的铂基化氟硼二吡咯衍生物，其中，所述碱为碳酸钾、碳酸钠或碳酸钡等中一种，优选碳酸钾，其中碱的量的为催化剂量，所述第一溶剂和第二溶剂独立地选自丙酮、二甲基亚砜或二甲基甲酰胺中的一种或几种，第一溶剂优选丙酮，且与氟硼二吡咯共轭体的体积比为10-200：1；第二溶剂优选二甲基甲酰胺，且与氟硼二吡咯衍生物的体积比为10-200：1。

进一步的，步骤(2)中，将摩尔比为2-5：1的式(Ⅲ)的末端含炔基的铂基化氟硼二吡咯衍生物与含叠氮聚合物加入第三溶剂中，在催化剂的作用下，优选避光条件下，在55℃下反应24h，得到所述铂基化氟硼二吡咯类化合物，其中，所述叠氮化合物为叠氮化聚乙二醇、叠氮化聚乙二醇单甲醚等中的一种，此叠氮聚合物可扩展为其他叠氮化衍生物；催化剂为五水硫酸铜/抗坏血酸体系或含Cu^-(一价铜离子)的无机盐(如CuI)；所述第三溶剂为水、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺中的一种或几种，优选无水无氧溶剂，第五溶剂与末端含炔基的氟硼二吡咯衍生物的体积比为1：10-100。

本发明的铂基化氟硼二吡咯类化合物在抑制肿瘤药物中的应用，所述抑制肿瘤药物为光动力治疗药物或光热治疗药物。

进一步的，所述铂基化氟硼二吡咯类化合物以纳米粒形态给药，优选纳米胶束，其粒径为20-100nm。

本发明构建一种基于氟硼二吡咯荧光染料的多模式治疗肿瘤的药物，同时还需解决其水溶性、靶向传输等难题，将顺铂分子片段与具有近红外吸收和发射的氟硼二吡咯类染料分子片段相结合，利于铂原子的重原子效应及d-d跃迁的原理，发挥多模式治疗的能力，并且通过点击化学连接亲水链，使其无需其他载体的包裹，直接自组装成为多模态治疗的纳米粒(优选纳米胶束)；且本发明提出这种可以实现近红外吸收具有多模式治疗功能的纳米粒的制备方法，首先通过缩合反应延长了氟硼二吡咯类化合物的共轭体系，并在末端通过加成反应引入亲水的聚合物链，最终通过薄膜分散法等制备粒径为20-100nm，平均分散指数为0.221的纳米胶束。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明通过缩合反应延长了氟硼二吡咯类化合物的共轭体系，并在末端引入亲水的聚合物链，解决了当下氟硼二吡咯类化合物在应用方面存在的主要问题，改善了其水溶性；完成了水溶性氟硼二吡咯类化合物近红外荧光探针在体深层组织的成像研究，这一优良改善由光谱鉴定和小动物成像系统都得到了证明；解决了一般药物依靠大分子载体包裹制成胶束存在的载药量小及释药量低的问题；加载了顺铂分子在氟硼二吡咯类化合物上，引入了重原子铂，其对大幅度提高单线态氧产率做出主要贡献，并增强了其非辐射跃迁，提高了光动力治疗活性，同时拓展了其在热疗方面的应用；同时引入了光动力治疗和热疗相结合的多模式治疗概念，增强药物的肿瘤靶向性的有益效果在动物实验结果中也到了证明；动物实验证明了有明显的抑瘤效果和长效体循环作用；与其他光敏剂相比，本发明提供的具有近红外光动力学活性及光热治疗作用的胶束，其显著的优势在于生物相容性良好、水溶性好、单线态氧产率高、靶向性好、为高效的肿瘤光动力治疗及光热治疗奠定基础。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1是本发明中实施例一步骤(2)中产物的氢谱核磁图；

图2是本发明中实施例一步骤(4)中产物的氢谱核磁图；

图3是本发明中实施例一步骤(5)中产物的氢谱核磁图；

图4是本发明中实施例一中制备所得的纳米胶束的TEM电镜图；

图5是本发明中实施例一中制备所得的纳米胶束的粒径分布图；

图6是本发明中实施例三中制备所得的纳米胶束的TEM电镜图；

图7是本发明中施例五制备的纳米胶束光照升温曲线图；

图8是本发明中施例五制备的纳米胶束光热转换效率处理结果图；

图9是本发明中施例五制备的纳米胶束单线态氧产生的淬灭折线图；

图10是本发明中施例五制备的纳米胶束光照下细胞毒性的细胞存活率柱状图；

图11是本发明中施例五制备的纳米胶束在荷瘤小鼠体内的组织分布结果；

图12是本发明中施例五制备的纳米胶束对荷瘤小鼠在30天内的抑瘤曲线图；

图13是本发明中施例五制备的纳米胶束在小鼠内的血药浓度曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例一

制备R¹为聚乙二醇基团(分子量为5000)的铂基化氟硼二吡咯化合物，具体步骤如下：

(1)氟硼二吡咯衍生物的制备：将物质的量分别为2mmol、4mmol、3mmol、3mmol、3mmol、2mmol的2,4-二甲基吡咯、对醛基吡啶、2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌、二异丙基乙胺、三氟化硼乙醚、三氟醋酸加入50mL二氯甲烷中，在25℃(室温)下反应16h，得到氟硼二吡咯衍生物；

(2)氟硼二吡咯共轭体的制备：将130mg步骤(1)中所得的氟硼二吡咯衍生物和147mg对羟基苯甲醛溶于50ml甲苯中，并加入1mL的冰醋酸和1mL哌啶，在氮气环境下加热112℃回流20小时后，冰浴30分钟，将产生的固体产物用甲苯洗涤数次，后经旋转蒸发仪旋干得初品，使用硅胶层析柱分离初品，洗脱剂采用丙酮-石油醚体系，得到纯化的氟硼二吡咯共轭体，产率25％；

(3)铂基化氟硼二吡咯类化合物前体的制备：将80mg步骤(2)中所得的氟硼二吡咯共轭体和207mg 3-溴丙炔(摩尔比1：10)加入40mL丙酮中，碳酸钾作为催化剂，加热回流反应24小时，后经萃取(二氯甲烷-水体系)干燥得到初品，经过层析柱(二氯甲烷体系)分离纯化，最终得到目标分子化合物前体，产率40％；

(4)末端含炔基的铂基化氟硼二吡咯衍生物的制备：在避光条件下，将25mg硝酸银和60mg顺铂加入15mL二甲基甲酰胺中，在55℃下反应24小时，再经高速离心，得上清液，加入步骤(3)中所得的铂基化氟硼二吡咯类化合物前体，55℃下反应24小时，得到末端含炔基的铂基化氟硼二吡咯衍生物，然后将该产物通过常规重结晶的方法进行纯化，产率10％；

(5)R¹为聚乙二醇基团(分子量为5000)的铂基化氟硼二吡咯化合物的制备：在避光条件下，将10mg步骤(4)中所得的末端含炔基的铂基化氟硼二吡咯衍生物，以摩尔比为1:2的比例加入100毫克分子量为叠氮聚乙二醇(分子量为5000)聚合物以及0.5mg五水合硫酸铜，抗坏血酸钠作为催化剂，加入10mL二甲基亚砜溶剂，55℃反应24小时，产物溶液经透析去除钠，铜等金属离子，最终以四氢呋喃为洗脱液过凝胶柱，经分离，取分子量最大的一段，为最终产物，产率20％。

上述步骤(2)、(4)和(5)中分别所得的产物氟硼二吡咯共轭体、末端含炔基的铂基化氟硼二吡咯衍生物和R¹为聚乙二醇基团(分子量为5000)的铂基化氟硼二吡咯化合物的¹H NMR核磁谱图，氘代试剂分别为DMSO、CDCl₃和CDCl₃，结果分别如图1、2、3所示。

将上述制备所得的铂基化氟硼二吡咯化合物进行纳米胶束(纳米粒)的制备，具体步骤为：称取1mg铂基化氟硼二吡咯化合物，以5mL二氯甲烷溶解，通过旋转蒸发仪旋蒸除去二氯甲烷，使得物质在烧瓶底部形成薄膜，在超声条件下加入一定量水溶解制得纳米胶束，此纳米胶束溶液稀释一定量后用DLS分析及电镜拍摄，测试结果如图4和5所示，制备后的纳米胶束测得动态光散射平均粒径为76nm，电镜下粒径为45nm，胶束溶液的临界胶束浓度为0.9g mL^-1；胶束溶液在浓度为0.19μM到0.75μM范围内在0.5W/cm²激光照射(660nm)下，5分钟内可达到单线态氧产率35％；胶束溶液在浓度为10μM到100μM范围内在0.5W/cm²激光照射(660nm)下，5分钟内具有良好的升温效果，光热转换效率为0.37；具有良好的化疗细胞毒性作用，其IC₅₀为50μM；具有优良的光照细胞毒性效果，其IC₅₀为2μM。

实施例二

本实施例步骤与实施例一基本相同，其区别在于：步骤(3)中，将80mg氟硼二吡咯共轭体和207mg 3-溴丙炔加入50mL乙腈中，碳酸钾作为催化剂，加热冷凝回流反应24小时，产物产率30％。

实施例三

本实施例步骤与实施例一基本相同，其区别在于：步骤(5)中，在避光条件下，将10mg末端含炔基的铂基化氟硼二吡咯衍生物、20mg分子量为1000的叠氮聚乙二醇聚合物(摩尔比1:2)加入10的无水无氧的二甲基亚砜溶剂，并加入适量五水合硫酸铜和抗坏血酸钠作为催化剂，在手套箱中操作，50℃反应24小时，最终产物产率30％。

本实施例制备所得的铂基化氟硼二吡咯化合物进行纳米胶束的制备，具体步骤为：称取1mg的样品，以5mL二氯甲烷溶解，通过旋转蒸发仪旋蒸除去二氯甲烷，使得物质在烧瓶底部形成薄膜，在超声条件下加入10mL水溶解制得纳米胶束，此纳米胶束溶液稀释至1μM后用DLS分析及电镜拍摄，测试结果如图6所示。

实施例四

本实施例步骤与实施例一基本相同，其区别在于：本实施例制备所得的铂基化氟硼二吡咯化合物进行纳米胶束的制备方法采用溶剂挥发法。具体步骤为：称取1mg的样品，以1mL丙酮溶解，磁力搅拌下，逐滴滴入10mL水中，并以40℃条件下搅拌直至丙酮挥发尽，此法制备所得的胶束其粒径约为120nm。

实施例五

本实施例步骤与实施例一基本相同，其区别在于：本实施例制备所得的铂基化氟硼二吡咯化合物进行纳米胶束的制备方法采用溶剂透析法。具体步骤为：称取1mg的样品，以1mL四氢呋喃溶解，在超声条件下，逐滴滴入10mL水中，并再次超声10分钟，用截留分子量为3500的透析袋将制备的溶液透析24小时以除去四氢呋喃，最终得到的纳米粒，其粒径约为100nm。

对本发明中制备的纳米胶束的性能测试如下：

1、对本发明中制备的纳米胶束光热转换效率的测试：具体步骤为：将上述目标分子化合物分别配置成10、20、30、50μM的溶液，然后利用660nm激光器(0.5W/cm²)照射8min，每隔30s记录溶液的温度变化情况，结果如图7所示，结果显示，纳米胶束溶解在不同浓度的光照下都有明显的升温，并且计算出溶剂的光热转换效率。本发明所述化合物展现出较为良好的的升温效果，为后期的光热治疗奠定基础，选取含铂离子浓度50μM的水溶液(0.5mL)对其进行激光照射(660nm，0.5W/cm²)480s后水溶液温度趋于平稳，撤去激光器使其自然冷却至室温，期间每30s对温度进行记录，根据文献(Nanoscale,2014,6,3274)提供的公式对光热转换效率进行计算。结果如图8所示。

2、对本发明中制备的纳米胶束单线态氧产率的测试：具体步骤为：将上述物质分别配置成0.79，0.38和0.19μM的溶液，其中包含等量的1,3-二苯基异苯并呋喃，利用660nm激光器(0.5W/cm²)照射5min，每隔1min测量溶液的紫外吸收，观察415nm处溶液紫外吸收的变化，由该变化情况绘图得到单线态氧产率折线图，结果如图9所示。

3、对本发明中制备的纳米胶束细胞毒性的测试：取对数生长期的4T1细胞铺96孔板，接种密度为6×10³/mL，每孔100μL，放入细胞培养箱恒温培养12小时，确定细胞贴壁后，倒掉培养液，用磷酸盐缓冲液洗1-2次，加入用培养基配好的铜基白蛋白溶液，每孔100微升，光照组配置上述具体实施例中所得纳米粒(Bodiplatin-NPs)浓度梯度为0.2、0.5、1.0、2.0、5.0μM，每个浓度4个复孔；放入培养箱培养24小时后，更换培养液，光照组每孔分别在0.5W/cm²条件下，光照10分钟，放回培养箱中继续培养24小时，加10μL浓度为5mg/mL的MTT的PBS溶液，4小时后弃去培养液，加入200μL的DMSO，振荡10分钟，酶标仪490nm处测定吸光度值，光照组结果参见图10，由图10中可见该纳米粒在光照下具有很低的IC₅₀值。

4、对本发明中制备所得的纳米胶束进行小鼠体内组织分布实验：具体实验步骤如下所述：

(1)肿瘤模型的建立：培养4T1肿瘤细胞，将其消化制备成1×10⁷个/mL细胞混悬液，保证细胞分散均匀，在小鼠腹部第二对乳头上侧种瘤，每只小鼠皮下注射100μL，每天观察肿瘤体积大小。肿瘤体积公式：肿瘤体积＝(长×宽²)/2；

(2)尾静脉注射上述具体实施例中所得目标分子化合物(30.0Mm/kg)至三组荷瘤小鼠体内，在注射后12h、24h、48h后分别取出三组小鼠的心、肝、脾、肺、肾和肿瘤，匀浆，并用2mL的硝酸对组织进行硝解，待组织硝解完全之后取出100μL稀释至10.0mL过膜之后用ICP-AES对各组织中的铂元素进行定量。通过上述IPC的测量方法得到小鼠各组织中铂含量的分布结果，参见图11，由图11可知本发明所述目标分子化合物在小鼠体内具有较好的肿瘤靶向性。

5、对本发明所述纳米胶束进行小鼠体内抑瘤效果的考察：参照实施例一制备出来的目标化合物，对体内抑瘤效果考察，采用性能测试第4项中建立的肿瘤模型的方法构建小白鼠荷瘤模型，待肿瘤体积至60mm³时，按照以下设计给药：铂化合物单剂量注射浓度10.0μmol/kg组，生理盐水组，给药同时加Vc组，分别光照和非光照组，共5组，每组6只，第0天给药，第2天进行激光治疗(660nm，0.56W/cm²，5分钟)。由图12小鼠肿瘤的变化效果可知，注射生理盐水组，光照以及未光照条件下均对肿瘤的生长无影响，说明单独光照不能对肿瘤产生抑制效果。而注射高剂量胶束光照后肿瘤部位能迅速产生损伤效果，肿瘤减小且在观察时间内未出现复发现象。同时加Vc组因为引起热损伤，也有明显的抑瘤效果。

6、对所述纳米胶束进行小鼠血药浓度的考察：取适当数量小白鼠，分成七组，每组作为0，2，4，6，8，12，24，48小时时间点血药样本，每组平行三只。每只给药浓度为，在给药时间到达上述时间点时，对小鼠进行摘眼球取血，血液样本分别溶解在王水及高氯酸溶液中高温灼烧，残存物溶解于5mL水中经过0.22μM微孔滤膜处理，用ICP-AES对各组织中的铂元素进行定量，绘制出如图13曲线，可以看出胶束具有长效体循环的效果，充分提高了药物靶向进入肿瘤的几率。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。