一种连接非依赖克隆接头序列和应用的制作方法

本发明涉及基因工程领域，具体的说，本发明涉及一种用于连接非依赖克隆(ligation independent cloing,LIC)的接头序列。

背景技术：

采用限制性内切酶进行酶切、DNA连接酶连接构建质粒载体的方法受到酶切位点的序列、排列方式、方向等的限制。连接非依赖的克隆技术(LIC)利用DNA聚合酶的外切活性，在目的载体和插入片段产生DNA 5’-端较长的单链粘性末端，通过碱基互补配对形成带有切刻的环状DNA，转化大肠杆菌后，在细菌细胞内修复成为无切刻的质粒DNA，从而完成目的片段的克隆。LIC技术可以克服酶切连接克隆的限制，目的片段不受载体酶切位点的影响，克隆效率高，适用于高通量的克隆。

连接非依赖克隆的关键之一在于接头序列的设计，目前已知的接头序列会在所表达的融合蛋白中添加稀有氨基酸残基或者化学性质差异较大，如酸性、碱性、容易被磷酸化的氨基酸残基等。由于质粒载体多用于目的蛋白的表达，因此接头序列应尽量避免引入稀有氨基酸残基、带电荷氨基酸残基等，以保证蛋白质性质不发生显著变化。

技术实现要素：

为了解决先前的技术问题，本发明提供一种新的LIC接头序列，该序列编码多肽仅含化学性质稳定，分子量较小的甘氨酸和丙氨酸残基，可以克服现有技术中的缺陷，避免引入稀有氨基酸残基、带电荷氨基酸残基等。

本发明的用于连接非依赖克隆(ligation independent cloing，LIC)序列，将该接头序列连接入质粒载体后形成的新的载体，可以实现目的片段的连接非依赖克隆，在后续表达的融合蛋白中仅掺入甘氨酸、丙氨酸残基，不会掺入稀有氨基酸残基、带电荷氨基酸残基等。

一方面，本发明提供一对接头序列，其中该接头序列包括包括：上游序列：GCA GCA GGA GGC GG(SEQ NO.8)所示的核苷酸序列；和下游序列：CCG CCA CCA GCA GC(SEQ NO.9)所示的核苷酸序列。

优选的，利用该接头序列作为连接非依赖克隆的接头序列。

优选的，该接头序列包括载体接头序列和与目的基因连接的接头序列，所述的载体的接头序列为如下序列：gcTGCAGCAGGAGGCGGgccc(SEQ NO.10)；和序列TCCGCCACCAGCAGCgggccc(SEQ NO.11)。

优选的，所述的与目的基因连接的序列为：GCAGCAGGAGGCGGT和序列CCGCCACCAGCAGCTCC。一种所述的接头序列在连接非依赖克隆方面的应用，其中,所述的接头序列为上游序列和下游序列，其中上游序列为GCA GCA GGA GGC GG所示的核苷酸序列；下游序列为CCG CCA CCA GCA GC所示的核苷酸序列。

一种所述的接头序列在连接非依赖克隆方面的应用，其中，与载体连接的序列对为：gcTGCAGCAGGAGGCGGgccc和TCCGCCACCAGCAGCgggccc；其中，与目的基因连接的序列对为GCAGCAGGAGGCGGT(SEQ NO.12)和序列CCGCCACCAGCAGCTCC(SEQ NO.13)。

有益效果

利用本发明序列，将该接头序列连接入质粒载体后形成的新的载体，可以实现目的片段的连接非依赖克隆，减少融合蛋白性质的变化。

附图说明

图1为本发明具体实施例子中所用的载体质粒的主要结构示意图。

图2为本发明一个具体实施方式中利用本发明的接头序列进行外源基因表达蛋白的载体接头序列和目的基因接头序列的具体序列图谱。

图3为LIC技术的主要技术路线示意图。

图4为pJP638的部分序列图，其中下划线的是本发明的接头序列。

图5是pJP638-Nbpin1的序列图，其中下划线的是本发明的接头序列。

详细说明

连接非依赖的克隆技术(LIC)利用DNA聚合酶的外切活性，在目的载体和插入片段产生DNA5’-端较长的单链粘性末端，通过碱基互补配对形成带有切刻的环状DNA，转化大肠杆菌后，在细菌细胞内修复成为无切刻的质粒DNA，从而完成目的片段的克隆(例如图3所示的LIC技术的基本技术路线图)。LIC技术可以克服酶切连接克隆的限制，目的片段不受载体酶切位点的影响，克隆效率高，适用于高通量的克隆。

LIC技术一般主要包括一下步骤(图3)：

1.1构建LIC载体(LIC vector)：采用含有接头(例如本发明的licl3,licl4)的引物扩增ccdb基因，并利用酶切连接克隆进入目标载体的多克隆位点，形成LIC载体。

1.2目的基因的扩增：采用含有接头(licl3,licl4)的引物PCR扩增目的基因(Gene)，形成插入片段(Insert)，该目的基因可以是任何想要的基因序列，包括植物、动物或者哺乳动物中的某些特异的基因片段或者基因序列。

1.3 5’-粘性末端的形成：采用Apa1酶切LIC载体，切除ccdb基因，采用T4 DNA聚合酶(T4 DNA Polymerase)处理，利用T4 DNA聚合酶3’-5’外切核酸酶活性产生5’粘性末端；同样采用T4 DNA聚合酶处理带有接头序列的目的基因PCR扩增产物，产生5-粘性末端。

1.4目的载体(Resulted vecotr)形成：将经过T4 DNA聚合酶处理的LIC载体和插入片段混合后，通过碱基互补配对，形成带有切刻的环状质粒。共同转化大肠杆菌(E.coli)感受态细胞，二者在大肠杆菌体内完成切刻修复，形成完整的目的载体。

通过以上技术路线，可以实现外源基因的转移和表达，在此技术路线中，接头序列显得比较重要，因为接头序列直接关系到目的基因所编码蛋白的性质，因为通常蛋白具有固有的性质，例如酸性或者碱性蛋白，由于在蛋白的表达过程中，接头序列也会编码蛋白，从而形成融合蛋白，为了让表达的目的蛋白和原始自然的蛋白的性质相同或者近似，常常尽可能的不影响目的蛋白的性质，采用这样的方法有多种，例如表达的过程的调控，例如通过表达参数的设置、或者表达后对目的蛋白的纯化条件的设置等来尽量让目的蛋白具有应有的活性。

本发明小组发现，通过对接头序列的设置，也可以使通过载体表达的蛋白活性保持不变，因为本发明的序列所编码的蛋白基本为中性的，无论目的蛋白是酸性还是碱性的， 都不影响目的蛋白本身的性质。一旦设计好该接头序列，至于该接头序列前面是否还要连接其它的序列，可以根据情况而定，一般包括两个功能，即该序列与所转化的质粒载体进行连接，另一是该接头序列与目的基因连接。因此，与质粒载体连接的接头序列之一的前端(5’端)还可以包括保护碱基(例如，序列gcc)或者酶切位点(例如：gagctc)的基因，在该接头序列后端(3’端)包括酶切位点和/或者致死基因，例如ccdb基因。同样，与质粒载体连接的接头序列的另一段序列的前端(5‘端)还可以包括保护碱基(例如序列ccc)或者酶切位点的基因(例如ggtacc)，在该接头序列后端(3’端)包括酶切位点和致死基因的反向互补基因序列。

优选的，与载体连接的接头序列如下所示：：(5’)

gcc-gagctc-ACCATGgc-TGCAGCAGGAGGCGG-gccc-TCACAAGTTTGTACAAAAAAGCT(3‘SEQ NO：1)

保护碱基-酶切位点-翻译起始序列-licl3接头序列-Apa1酶切位点+ccdb基因5’序列ccc-ggtacc-TCCGCCACCAGCAGC-gggccc-CAACCACTTTGTACAAGAAAGCTG(SEQ NO：2)

保护碱基-酶切位点-licl4接头-Apa1酶切位点-ccdb基因3’反向互补序列。

本领域的一般技术人员可以根据实际情况，在本发明的接头序列前或者后添加其它的功能基因序列，例如抗性筛选基因序列，这是本领域一般技术所公知的技术，在此不再赘述。

同样的道理，与接头序列连接的目的基因可以是任何基因序列，例如可以是NbPin1序

列，具体的，可以是如下的序列：：

GCAGCAGGAGGCGGT-ATGGAAGGGAAGACTATGTTCAAGT(下划线的是目的基因双链序列之一)(SEQ NO：3)

licl3接头-NbPin1 5’序列(下划线序列为其中一个实施例子的目的基因双链的另一条序列)

CCGCCACCAGCAGCT-CCACCCATGCTGGGAGTATCTCG(SEQ NO：4)

Licl4接头-NbPin1 3’反向互补序列(下划线序列为其中一个实施例子的目的基因)。该载体与现存的LIC载体的区别在于，本发明所使用的LIC接头序列在形成的融合蛋白 中仅掺入了甘氨酸、丙氨酸两种空间位阻小、电荷少、非极性的氨基酸残基。而目前已知的LIC接头序列往往在形成的融合蛋白中掺入空间位阻较大的亮氨酸、酸碱性较强的赖氨酸、天冬氨酸、精氨酸、以及极性较强的天冬酰胺、酪氨酸等残基。Licl3的翻译序列：AAAGG(即Ala-Ala-Ala-Gly-Gly)；Licl4翻译序列：AAGGG(即Ala-Ala-Gly-Gly-Gly)。通过这个技术可以表达多数常规蛋白，使这些表达的蛋白和天然或者已知的功能相近或者一样。同样该接头可以应用于不同融合蛋白与标签蛋白如、绿色荧光蛋白、HA标签、c-Myc标签、GST标签等，使融合蛋白功能不因掺入稀有氨基酸残基、带电荷氨基酸残基等而受较大影响。

具体实施方式

现结合实施例对本发明作进一步的详细说明，本具体实施方式只是通过举例的方式阐述该发明如何实施，但并不构成对本发明的限制。

实施例：连接非依赖克隆载体的构建和应用

本发明所提供的实施例均按照常规实验条件，其中所采用的引物序列如表1。

表1 连接非依赖克隆载体构建引物

Licl3-FP(+)，Licl4-RP(-)引物为与质粒载体连接的引物，这1对引物中包括设计的接头序列，分别为TGCAGCAGGAGGCGG和TCCGCCACCAGCAGC。

Licl3-NbPin1 FP(+)和Licl4-NbPin1RP(-)引物是与目的基因连接的并包括接头序列的引物，其中，接头序列分别为：GCAGCAGGAGGCGGT和GCAGCAGGAGGCGGT，下划线的为本实施例子中的目的基因扩增引物片段。

实施例1：连接非依赖克隆接头序列的设计、合成、扩增和测定

1.连接非依赖克隆接头序列的设计、合成

Licl3-FP(+)，Licl4-RP(-)由核酸合成公司合成并纯化。

2.Ccdb基因扩增【质粒载体内部含有ccdb致死基因(图3)，该基因可以导致普通感受态细菌死亡，但是可以在大肠杆菌DB3.1感受态内生长。可以作为负向筛选标记，载体在切除ccdb基因后，克隆目的片段后，转化普通感受态，只有含有目的片段的载体可以存活】

以引物对Licl3-FP(+)，Licl4-RP(-)扩增ccdb基因序列，PCR扩增体系为：38μLddH₂O、5μL 10×PCR Buffer for Pfu、4μL 2.5mMdNTPs、上下游引物(10μM)各0.5μL、1μL Gateway盒质粒模板、1μL Pfu聚合酶。总反应体系为50μL。各片段的反应条件为:94℃5min；94℃45s,52℃45s,72℃4min,35个循环；72℃10min。扩增的PCR产物纯化后经测序(seq ID 5)拼接获得含有接头序列边界的ccdb基因。

3.连接非依赖克隆载体的构建

上述步骤2中PCR产物经Qiagen凝胶纯化试剂盒(德国Qiagen公司)纯化后，利用DNA连接酶进行PCR片段的克隆，采用10μL体系反应，条件如下：10×ligase buffer 1ul，Sac I和Kpn I双酶切线性化克隆载体pJP603(图1最上)50ng，ccdb基因回收片段50ng，T4-ligase 0.4ul(大连宝生物)，最后用ddH₂O调整体系至10μL，混匀后4℃反应16h。反应完毕后，取5ul反应液加入到含有100ul大肠杆菌Db3.1感受态细胞的离心管中，轻轻混匀冰上放置30m后，42℃热激90s，立即放置冰上2-3m，向离心管中加入LB液体培养基900ul。将离心管放于37℃摇床上震动培养1.5hr后，离心收集培养液涂布于含有50mg/L卡那青霉素、10mg/L氯霉素的固体LB培养基上，37℃过夜培养。选择菌斑送至杭州擎科公司测序。含有正确插入序列的克隆命名为pJP638(Seq No.5)(图1中间)。

实施例2：外源基因的连接非依赖克隆

1.外源基因的扩增(步骤1)

以引物对Licl3-NbPin1FP(+)，Licl4-NbPin1RP(-)扩增外源基因NbPin1序列(ATGGAAGGGAAGACTATGTTCAAGTTATCTCATGTAGTTGCTTTCTTGCTCCTTGCATCGCTTTTTCAACCTCTTACGGCAAGAGATCTAGTATTCGAAGTAAGTGACGGAATAGAAGTCTTGCAATTCCCAATGGCAAAAGAAAACCAAGTGGAAACACTTGATGATCCCTCTCTCTCAATAATTTGCCCAGGAAAGCAATCATGGCCTGAACTTGTGGGAAAGCCAGCGGCGACTGCTAAGAGAATAATTGAGAAAGAAAATCCCATAGCCAAAGTTCAGTTTTTGTTCCCTGGTATGGTTAGGCCACTTAATTATGTTTGTGGTCGAGTTTTTGTTGTTGTTAACTGGAAACTCATTGTTCGAGATACTCCCAGCATGGGTTAA)(SEQ NO：7)，PCR扩增体系为：38μL水、5μL 10×PCR Buffer for Pfu、4μL 2.5mMdNTPs、上下游引物(10μM)各0.5μL、1μL Nbpin1模板、1μL Pfu聚合酶。总反应体系为50μL。各片段的反应条件为:94℃5min；94℃45s,52℃45s,72℃2min,35个循环；72℃10min。扩增的PCR产物纯化后经测序拼接获得含有接头序列边界的NbPin1(图1最下面，)。

2.外源片段NbPin1克隆入pJP638

步骤1中PCR产物采用PEG沉淀纯化后，进行连接非依赖的克隆。

1)PCR产物PEG沉淀纯化

等体积加入ddH₂O，30％PEG-8000/30mM MgCl₂，涡旋混匀。离心(14,000rpm，20min)，此时PCR产物应沉淀于离心管底部；去除液体，加入1mL 75％乙醇漂洗DNA沉淀，离心(14,000rpm，20min)；去除液体，烘干(37℃，5min)；加入1/10PCR反应体积ddH₂O，溶解PCR产物，电泳检测纯化效果。

2)PCR产物末端处理

反应体系于冰浴中配制，步骤1)中片段浓度100ng/μL，dATP浓度为5mM；加入4μL DNA聚合酶，温浴(37℃，20min)处理PCR产物，产生5’-末端单链；温浴(75℃，20min)，灭活T4 DNA聚合酶。

3)LIC载体处理：

碱法提取质粒pjp638(图1)；采用快速限制性内切酶Apa1酶切，质粒浓度5μg/100μL， 并去除RNA；补水至400μL，氯仿:异戊醇(24:1)抽提2次；乙醇沉淀，漂洗；烘干(37℃，5min)，溶解并电泳检测酶切效果；反应体系于冰浴中配制，线性化质粒浓度5μg/100μL，dTTP浓度为5mM；加入4DNA聚合酶，温浴(37℃，20min)，处理线性化质粒，产生5’-末端单链；温浴(75℃，20min)，灭活T4 DNA聚合酶。

4)连接非依赖的克隆：

等体积混合T4 DNA聚合酶处理的步骤2)中间片段和步骤3)载体；温浴(70℃，5min)，温浴(22℃，30min)形成末端退火；反应完毕后，转化大肠杆菌DH5α。涂布于含有50mg/L氨苄青霉素的固体LB培养基上，37℃过夜培养。选择菌斑送至杭州擎科公司测序。含有正确插入序列的克隆命名为pJP638-Nbpin1(Seq No.6)。

实施例3：NbPin1外源基因的表达以及与原始NbPin1基因所编码的蛋白的性质的比较

通过本发明发明的方法获得的载体pJP638-Nbpin1，通过常规方法进行表达蛋白，并经过常规的纯化后与原始NbPin1基因所编码的蛋白(自然产生)进行比较，发现利用本发明接头产生的融合蛋白仅仅掺入了GGAAG的氨基酸残基，而利用先前已知接头按照本发明的方法同样进行上述对比试验(例如CgACgACAAgACCgT，gAggAgAagAgCCgT)，结果发现产生的融合蛋白则掺入了RRLFSS残基，包括两个强碱性残基RR和两个具有潜在磷酸化活性的残基SS，以及两个大分子量残基LF，这些特殊氨基酸残基的存在会导致融合蛋白的性质发生改变，而本发明掺入的残基为小型非极性残基，对融合蛋白性质影响极小。这就说明本发明的接头序列作用下所编码的蛋白与自然产生的蛋白的蛋白性质和功能接近，具有更高的利用价值。