本发明属于DNA四面体技术领域，具体涉及一种核酸适配体AS1411修饰的DNA四面体及其制备方法。
背景技术：
DNA四面体由于其具有良好的生物相容性，较好的稳定性和可修饰性，合成方法较为简便，目前在载药，肿瘤治疗等领域有较大的发展前景。DNA四面体可作为具有良好生物相容性的纳米载药材料。与大部分传统的纳米材料相比，DNA四面体可以通过小窝蛋白介导的内吞途径的机制以及微管依赖的途径有序运输到细胞溶酶体内，并且它可以在细胞中保持结构相当长的时间。文献已经报道DNA四面体可以成功的输送免疫刺激剂CpG进入细胞发挥作用，但是同单独的DNA四面体一样，携载的这些药物同样是进入到了细胞的溶酶体中，被溶酶体迅速降解。
AS1411核酸适配体，是可以与核仁素特异性结合的DNA单链，核仁素高表达于细胞核上以及肿瘤细胞膜的表面，并且AS1411能依靠核仁素在细胞内的穿梭作用进入到细胞核中，同时AS1411可以抑制DNA复制使细胞停留在S期从而抑制细胞增殖，通过干扰核仁素和bcl-2的结合从而促进细胞凋亡，AS1411在癌症的治疗诊断等方面有较大的前景。
但用AS1411核酸适配体对DNA四面体进行修饰并未见报道。
技术实现要素：
针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种核酸适配体AS1411修饰的DNA四面体及其制备方法，可有效解决未经修饰的DNA四面体无法进入细胞核，AS1411无法直接载药的问题。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种核酸适配体AS1411修饰的DNA四面体的制备方法，包括以下步骤：
（1）将AS1411序列接于DNA四面体中任一条DNA单链的5’端，通过DNA合成，将所得DNA粉末高速离心确保粉末聚集于试管底部，然后用ddH2O将其溶解，于4℃条件下保存；
（2）通过紫外定量法，测定DNA在波长为260nm和330nm处的吸光值，然后根据以下公式计算出100μL，1μM体系中各单链的体积：
V=100/[（A260-A330）×105/（15.2×单链中腺嘌呤数目+7.4×单链中胞嘧啶的数目+11.4×单链中鸟嘌呤的数目+8.3×单链中胸腺嘧啶的数目）]
根据上述计算结果，然后计算四条单链总体积；
（3）根据步骤（2）中计算的总体积数，吸取步骤（1）所得DNA，然后与TM buffer混合，漩涡振动混匀，最后置于PCR仪内，将温度迅速升到95℃稳定10min，再冷却至4℃稳定20min，最后于-20℃保存，得核酸适配体AS1411修饰的DNA四面体。
进一步地，步骤（1）中1nmol的DNA用10μL的 ddH2O溶解。
进一步地，步骤（3）中TM buffer为5-10mM Tris-HCl，5-50mM MgCl2，pH8.0。
进一步地，步骤（3）中TM buffer为10mM Tris-HCl，50mM MgCl2，pH8.0。
S1：
5’-ATTTATCACCCGCCATAGTAGACGTATCACCAGGCAGTTGAGACGAACATTCCTAAGTCTGAA-3’（ SEQ ID NO:1）；
S2：
5’-ACATGCGAGGGTCCAATACCGACGATTACAGCTTGCTACACGATTCAGACTTAGGAATGTTCG-3’ （ SEQ ID NO:2）；
S3：
5’-ACTACTATGGCGGGTGATAAAACGTGTAGCAAGCTGTAATCGACGGGAAGAGCATGCCCATCC-3’ （ SEQ ID NO:3）；
S4：
5’-ACGGTATTGGACCCTCGCATGACTCAACTGCCTGGTGATACGAGGATGGGCATGCTCTTCCCG-3’ （ SEQ ID NO:4）。
AS1411序列为：5’-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGT-3’ （ SEQ ID NO:5）。
AS1411可以与DNA四面体中的任意一条单链结合，结合在DNA5’端上，其结合后的序列为：
S1-AS1411：
5’-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGT–ATTTATCACCCGCCATA
GTAGACGTATCACCAGGCAGTTGAGACGAACATTCCTAAGTCTGAA-3’ （ SEQ ID NO:6）；
S2-AS1411：
5’-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGT–ACATGCGAGGGTCCAATA
CCGACGATTACAGCTTGCTACACGATTCAGACTTAGGAATGTTCG-3’ （ SEQ ID NO:7）；
S3-AS1411：
5’-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGT-ACTACTATGGCGGGTGA
TAAAACGTGTAGCAAGCTGTAATCGACGGGAAGAGCATGCCCATCC-3’ （ SEQ ID NO:8）；
S4-AS1411：
5’-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGT-ACGGTATTGGACCCT
CGCATGACTCAACTGCCTGGTGATACGAGGATGGGCATGCTCTTCCCG-3’ （ SEQ ID NO:9）
核酸适配体AS1411修饰的DNA四面体的验证：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）法，即将未经修饰的四面体的各单链稀释100倍后，取5μL与1μL的6×loading buffer混合，将修饰后的DNA四面体取5μL与1μL的6×loading buffer混合，分别加入到配好的胶中(成分：超纯水4.2mL，40%丙烯酰胺1.2mL，10×TAE0.6mL，10%APS 60μL，TEMED 6μL)，胶的一边加入20bp marker作为对照，在恒定电压100V下于1×TAE溶液中进行80分钟电泳。于避光盒中加入50ml ddH2O和5μL的Gel-red，混匀，将凝胶放入，摇床摇15-20分钟，再与凝胶成像系统拍照成像。
本发明提供的核酸适配体AS1411修饰的DNA四面体，具有以下有益效果：
（1）传统的DNA四面体只能进入到细胞内而不能进入到细胞核中，而AS1411无法直接载药，本发明将DNA四面体经核酸适配体AS1411修饰后，可形成一个高效载药载体。
（2）合成方法简便，AS1411核酸适配体可以介导DNA四面体进入细胞核，有效提高其载药效率，传统DNA四面体不能进入细胞核，而肿瘤治疗药物中有很大一部分是通过与DNA结合从而抑制肿瘤细胞的增殖迁移等生物学行为，DNA又大部分存在于细胞核中，所以AS1411通过让DNA四面体入核极大的提高了载药效率并且AS1411本身具有抑制肿瘤细胞增殖的作用，载药后可形成双重抗肿瘤效果。
（3）AS1411可以靶向与肿瘤细胞膜表面核仁素结合，而正常细胞在细胞膜表面没有核仁素受体，所以AS1411修饰后的四面体可以靶向运输抗肿瘤药，让进入肿瘤细胞的药物明显多于正常细胞，从而对肿瘤细胞进行很好的治疗，同时还能降低药物对正常细胞的损伤。
附图说明
图1为核酸适配体AS1411修饰的DNA四面体的电泳图；其中，条带从右至左分别为marker，单链S1，单链S2，单链S3，单链S4，AS1411修饰后的单链S4，核酸适配体AS1411修饰的DNA四面体（实施例4）。
具体实施方式
实施例1
一种核酸适配体AS1411修饰的DNA四面体的制备方法，包括以下步骤：
（1）将AS1411序列接于DNA四面体中S1的5’端，通过自动DNA合成仪合成DNA，将所得DNA粉末高速离心确保粉末聚集于试管底部，然后用ddH2O将其溶解（1nmol的DNA用10μL的 ddH2O溶解），于4℃条件下保存；
（2）通过紫外定量法，测定DNA在波长为260nm和330nm处的吸光值，然后根据以下公式计算出100μL，1μM体系中各单链的体积：
V=100/[（A260-A330）×105/（15.2×单链中腺嘌呤数目+7.4×单链中胞嘧啶的数目+11.4×单链中鸟嘌呤的数目+8.3×单链中胸腺嘧啶的数目）]
根据上述计算结果，然后计算四条单链总体积；
（3）根据步骤（2）中计算的总体积数，吸取步骤（1）所得DNA，然后与TM buffer（10mM Tris-HCl，50mM MgCl2，pH8.0）混合，漩涡振动混匀，最后置于PCR仪内，将温度迅速升到95℃稳定10min，再冷却至4℃稳定20min，最后于-20℃保存，得核酸适配体AS1411修饰的DNA四面体。
实施例2
一种核酸适配体AS1411修饰的DNA四面体的制备方法，包括以下步骤：
（1）将AS1411序列接于DNA四面体中S2的5’端，通过自动DNA合成仪合成DNA，将所得DNA粉末高速离心确保粉末聚集于试管底部，然后用ddH2O将其溶解（1nmol的DNA用10μL的 ddH2O溶解），于4℃条件下保存；
（2）通过紫外定量法，测定DNA在波长为260nm和330nm处的吸光值，然后根据以下公式计算出100μL，1μM体系中各单链的体积：
V=100/[（A260-A330）×105/（15.2×单链中腺嘌呤数目+7.4×单链中胞嘧啶的数目+11.4×单链中鸟嘌呤的数目+8.3×单链中胸腺嘧啶的数目）]
根据上述计算结果，然后计算四条单链总体积；
（3）根据步骤（2）中计算的总体积数，吸取步骤（1）所得DNA，然后与TM buffer（10mM Tris-HCl，50mM MgCl2，pH8.0）混合，漩涡振动混匀，最后置于PCR仪内，将温度迅速升到95℃稳定10min，再冷却至4℃稳定20min，最后于-20℃保存，得核酸适配体AS1411修饰的DNA四面体。
实施例3
一种核酸适配体AS1411修饰的DNA四面体的制备方法，包括以下步骤：
（1）将AS1411序列接于DNA四面体中S3的5’端，通过自动DNA合成仪合成DNA，将所得DNA粉末高速离心确保粉末聚集于试管底部，然后用ddH2O将其溶解（1nmol的DNA用10μL的 ddH2O溶解），于4℃条件下保存；
（2）通过紫外定量法，测定DNA在波长为260nm和330nm处的吸光值，然后根据以下公式计算出100μL，1μM体系中各单链的体积：
V=100/[（A260-A330）×105/（15.2×单链中腺嘌呤数目+7.4×单链中胞嘧啶的数目+11.4×单链中鸟嘌呤的数目+8.3×单链中胸腺嘧啶的数目）]
根据上述计算结果，然后计算四条单链总体积；
（3）根据步骤（2）中计算的总体积数，吸取步骤（1）所得DNA，然后与TM buffer（10mM Tris-HCl，50mM MgCl2，pH8.0）混合，漩涡振动混匀，最后置于PCR仪内，将温度迅速升到95℃稳定10min，再冷却至4℃稳定20min，最后于-20℃保存，得核酸适配体AS1411修饰的DNA四面体。
实施例4
一种核酸适配体AS1411修饰的DNA四面体的制备方法，包括以下步骤：
（1）将AS1411序列接于DNA四面体中S4的5’端，通过自动DNA合成仪合成DNA，将所得DNA粉末高速离心确保粉末聚集于试管底部，然后用ddH2O将其溶解（1nmol的DNA用10μL的 ddH2O溶解），于4℃条件下保存；
（2）通过紫外定量法，测定DNA在波长为260nm和330nm处的吸光值，然后根据以下公式计算出100μL，1μM体系中各单链的体积：
V=100/[（A260-A330）×105/（15.2×单链中腺嘌呤数目+7.4×单链中胞嘧啶的数目+11.4×单链中鸟嘌呤的数目+8.3×单链中胸腺嘧啶的数目）]
根据上述计算结果，然后计算四条单链总体积；
（3）根据步骤（2）中计算的总体积数，吸取步骤（1）所得DNA，然后与TM buffer（10mM Tris-HCl，50mM MgCl2，pH8.0）混合，漩涡振动混匀，最后置于PCR仪内，将温度迅速升到95℃稳定10min，再冷却至4℃稳定20min，最后于-20℃保存，得核酸适配体AS1411修饰的DNA四面体。
对上述方法制备的核酸适配体AS1411修饰的DNA四面体进行验证：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）法，即将未经修饰的四面体的各单链稀释100倍后，取5μL与1μL的6×loading buffer混合，将修饰后的DNA四面体取5μL与1μL的6×loading buffer混合，分别加入到配好的胶中(成分：超纯水4.2mL，40%丙烯酰胺1.2mL，10×TAE0.6mL，10%APS 60μL，TEMED 6μL)，胶的一边加入20bp marker作为对照，在恒定电压100V下于1×TAE溶液中进行80min电泳。于避光盒中加入50ml ddH2O和5μL的Gel-red，混匀，将凝胶放入，摇床摇15-20分钟，再与凝胶成像系统拍照成像，电泳图如图1所示。
实验例1
将20mM，pH7.0的磷酸钠缓冲液、150mM氯化钠和0.5mM的EDTA配成以下反应体系：实施例4制备的核酸适配体AS1411修饰的DNA四面体20μM，阿霉素400μM，甲醛0.37%，将上述反应体系置于10℃反应12h，用HPLC或分子筛或乙醇沉淀等方法纯化所得产物（将本发明制备的核酸适配体AS1411修饰的DNA四面体与药物结合后称为样品，未加药物的称为对照品）。
通过流式细胞术研究样品对肿瘤细胞的特异识别性和亲和力，即分别将样品和对照品（各200nM）与肿瘤细胞（A549）在冰上孵育半小时，然后用DPBS缓冲液洗去非特异性吸附在细胞上的物质，并将所得细胞重悬在DPBS（含5mM Mg2+）中并进行流式细胞术分析。结果表明样品与对照品比较，样品对癌细胞具有特异性识别能力和较高的亲和力。
实验例2
将培养好的癌细胞A549铺在96孔细胞培养板中（100μL，50000个细胞/孔），然后在孔中分别加入一定浓度（0，0.1μM，0.2μM，0.4μM，0.8μM，1.6μM，3.2μM）的纯阿霉素或样品，然后在细胞培养箱培养1.5h后，离心，除去上清中的细胞培养液后加入新鲜培养基，并接着培养48h，然后用MTS试剂测试细胞增殖速率。
测试结果可知，随着浓度的增加，癌细胞的增殖速率逐渐降低，说明样品与纯阿霉素对癌细胞的抑制作用逐渐升高，样品与纯阿霉素相比，对癌细胞有更强的抑制作用。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学
<120> 一种核酸适配体AS1411修饰的DNA四面体及其制备方法
<130> 2016
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 63
<212> DNA
<213> S1
<400> 1
atttatcacc cgccatagta gacgtatcac caggcagttg agacgaacat tcctaagtct 60
gaa 63
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acatgcgagg gtccaatacc gacgattaca gcttgctaca cgattcagac ttaggaatgt 60
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tcc 63
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<170> PatentIn version 3.3
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