一种漆酶的修饰方法与流程

本发明属于生物漆酶修饰改性技术领域，涉及一种同时提高漆酶(laccase)催化活性和稳定性的修饰方法，利用聚丙烯酸(PAA)能同时固定铜离子和漆酶，聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯)(PPEGA)能提高漆酶的稳定性的原理，通过可逆加成断裂链转移(RAFT)聚合合成聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯)嵌段共聚物(PAA/PPEGA),并结合铜离子来提高漆酶活性，实现修饰后的漆酶催化活性和稳定性的显著提高。

背景技术：
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目前，漆酶是一类多铜氧化还原酶，广泛存在于植物、真菌和细菌中，在生物降解、化学合成、红酒保存和生物传感器等方面有着非常广泛的应用，但是由于它的稳定性差，漆酶的应用受到很大的限制，因此提高漆酶稳定性是漆酶研究中面临的一个问题。现有技术中提高漆酶稳定性的方法有固定法、胶囊法、水凝胶络合法、聚合物修饰法，然而经过上述方法修饰以后，酶的活性都出现了明显的下降。因此提高漆酶稳定性的同时，若能提高漆酶的活性将对漆酶的应用有着非常重要的意义，目前用于提高漆酶活性的方法有多种，如向漆酶溶液中加入铜离子、光催化剂或者微生物等，其中将铜离子加入到漆酶溶液中是一个非常有效并且常用的方法，但是由于铜离子是一种重金属离子，铜离子的引入会给整个酶反应体系带来二次污染。因此寻求设计一种同时提高漆酶催化活性和稳定性的方法，该方法在利用铜离子提高酶活性的同时，设法将铜离子固定，并能够同时显著提高漆酶的催化活性，该方法制备工艺过程简单，效率高，制备的产品质量好，工作环境友好，极具市场前景。

技术实现要素：
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本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，设计提供一种能同时提高漆酶催化活性和稳定性的方法，该方法操作步骤简单，所需化学药品加入量少，所需反应条件温和，制备效率高，制备的漆酶固定到大面积的石墨烯纸上后，能够实现漆酶在降解邻苯二酚污染物中的重复利用。

为了实现上述目的，本发明涉及的高活性、高稳定性的漆酶的制备具体工艺包括以下步骤：

一、通过RAFT聚合合成嵌段共聚物PAA/PPEGA(聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯):

(1)、将20-60mg RAFT试剂(比如芘功能化的4-氰基-4-乙基三硫代戊酸)、2-10mg偶氮二异丁腈(AIBN)、0.2-0.5g丙烯酸(PAA)，在圆底烧瓶中用2-5mL超纯水和3-7mL二氧六环溶解，将圆底烧瓶用橡胶塞密封，通入氮气30-60分钟以除去圆底烧瓶中的氧气，再将圆底烧瓶油浴在20-90℃下加热，磁力搅拌反应5-36小时；

(2)、打开步骤(1)中圆底烧瓶并加入1-5g聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯(PEGA)，将圆底烧瓶用橡胶塞密封，通入氮气10-60分钟，然后在30-150℃下油浴，磁力搅拌反应10-24小时，将反应制得的混合物用乙醚沉淀1-6次，得到的沉淀物即为嵌段共聚物PAA/PPEGA,将制得的沉淀物置于烘箱中，在20-70℃下干燥24-48小时至恒重，储存备用；

二、用嵌段共聚物PAA/PPEGA对漆酶进行修饰：

(1)、将0.3-0.6g共聚物PAA/PPEGA、7-11mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)在50mL的圆底烧瓶中用15-25ml二氯甲烷溶解，室温下搅拌反应20-70分钟；

(2)、在步骤(1)制得的试剂中加入4-9g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),室温下反应24小时，用乙醚沉淀三次，制得活化的聚合物PAA/PPEGA-NHS,再将制得的PAA/PPEGA-NHS置于烘箱中，在25-80℃下干燥24-72小时至恒重备用；

(3)、配制浓度为0.1-0.9mol/L，pH＝5-9的醋酸盐缓冲液(ABS缓冲液),称取10-60mg漆酶溶于20mLABS缓冲液中配制0.5-3mg/mL的漆酶储备液备用，称取100-400mgPAA/PPEGA-NHS，溶于10mLABS缓冲液中配制10-40mg/mL的PAA/PPEGA-NHS储备液备用；

(4)、取10-15mL步骤(3)制备的漆酶储备液逐滴加入到搅拌的0.5-11mL PAA/PPEGA-NHS的储备液中，将上述制得的溶液在冰浴下搅拌反应4-12小时，然后用截留分子量为20000-50000的透析膜冰浴透析1-3天，用以除去过量的PAA/PPEGA-NHS，制得用嵌段共聚物PAA/PPEGA修饰后的漆酶(PAA/PPEGA-laccase)；

三、用铜离子对PAA/PPEGA-laccase进行修饰：

(1)、用ABS缓冲液配制8-20mmol/l的硫酸铜溶液，然后将步骤二中制得的PAA/PPEGA-laccase在硫酸铜溶液中于0-37℃下培养10-20小时，制得嵌段共聚物PAA/PPEGA和铜离子修饰后的漆酶(Cu²⁺/PAA/PPEGA-laccase)的混合溶液；

(2)、将步骤(1)中制得的混合试剂利用截留分子量为500-1000的透析膜冰浴中透析，除去吸附不牢的铜离子，制得嵌段共聚物PAA/PPEGA和铜离子修饰后的漆酶(Cu²⁺/PAA/PPEGA-laccase)，将制得的Cu²⁺/PAA/PPEGA-laccase冷冻干燥条件下存储。

本发明对Cu²⁺/PAA/PPEGA-laccase的催化活性和稳定性进行测定，分别对原漆酶和Cu²⁺/PAA/PPEGA-laccase的催化活性以及半衰期进行了表征测试，结果表明Cu²⁺/PAA/PPEGA-laccase的活性和稳定性有提高，其中催化活性提高了347％，稳定性提高了137％，表明对原漆酶的修饰，成功的提高了原漆酶的催化活性和稳定性。

本发明涉及对经过嵌段共聚物PAA/PPEGA和铜离子修饰后的漆酶(Cu²⁺/PAA/PPEGA-laccase)的应用及催化活性和稳定性测定，具体工艺步骤如下：

一、将Cu²⁺/PAA/PPEGA-laccase固定到石墨烯纸表面：

(1)、用ABS缓冲液配制1-10mg/mL的Cu²⁺/PAA/PPEGA-laccase溶液。

(2)、将1.0cm²-1.0m²的石墨烯纸浸泡于步骤(1)制备的溶液中，0-50℃条件下浸泡6-20个小时

(3)、用流动的超纯水冲洗石墨烯纸表面，以除去表面固定不牢的Cu²⁺/PAA/PPEGA-laccase。

(4)、用氮气吹干石墨烯纸，于0-60℃下保存备用。二、将原漆酶固定在石墨烯纸的表面，用以比较Cu²⁺/PAA/PPEGA-laccase固定后的催化活性、稳定性，以及重复利用情况：

二、将原漆酶固定在石墨烯纸的表面，用以比较Cu²⁺/PAA/PPEGA-laccase固定后的催化活性、稳定性，以及重复利用情况：

(1)、将20mg EDC、5mg NHS、20mg原漆酶溶解在在9mLABS缓冲液中；

(2)、将1mg芘丁酸溶解到1mL二甲基甲酰胺中；

(3)、将步骤(2)中制备的溶液逐滴加入到步骤(1)中的溶液中，于4℃下搅拌反应8小时；

(4)、用截留分子量为1000的透析袋，在4℃下透析24小时，以除去过量的EDS和NHS；

(5)采用与步骤一相同的工艺将，将芘修饰的漆酶固定在石墨烯纸表面；

对固定在石墨烯纸上的Cu²⁺/PAA/PPEGA-laccase的活性进行测试，结果表明25℃和30℃下Cu²⁺/PAA/PPEGA-laccase的活性均有提高；对Cu²⁺/PAA/PPEGA-laccase经8次循环利用后的活性进行测试，结果显示经过8次循环利用后Cu²⁺/PAA/PPEGA-laccase的活性从317％降低到189％，而原漆酶的活性从100％到完全失活，表明Cu²⁺/PAA/PPEGA-laccase的活性有明显提高，并且经过8次循环利用后，Cu²⁺/PAA/PPEGA-laccase的活性仍比原漆酶活性高，证明Cu²⁺/PAA/PPEGA-laccase有应用潜力能够应用于降解邻苯二酚污染物中，并能够重复利用。

本发明与现有技术相比，利用RAFT聚合能够按照实际需要，合成具有不同功能的嵌段共聚物，并且通过对铜离子的固定，避免了金属铜离子对反应体系的二次污染，同时提高了漆酶的催化活性和稳定性，该发明制备的漆酶固定到大面积的石墨烯纸上，能够实现漆酶在降解邻苯二酚污染物中的重复利用，其制备工艺过程简单，制备效率高，产品质量好，稳定性能强，应用环境友好。

附图说明：

图1为本发明涉及的嵌段共聚物PAA/PPEGA的合成过程示意图。

图2为本发明涉及的嵌段共聚物PAA/PPEGA的核磁表征图。

图3本发明涉及的经过嵌段共聚物PAA/PPEGA和铜离子修饰后的漆酶(Cu²⁺/PAA/PPEGA-laccase)活性测试图。

图4本发明涉及的经过嵌段共聚物PAA/PPEGA和铜离子修饰后的漆酶(Cu²⁺/PAA/PPEGA-laccase)稳定性测试图。

图5本发明涉及的25℃和30℃下固定后的原漆酶和Cu2+/PAA/PPEGA-laccase的活性测定图。

图6本发明涉及的固定后的原漆酶和Cu²⁺/PAA/PPEGA-laccase经过循环利用后活性变化图。

具体实施方式：

下面通过实例并结合附图对本发明作进一步说明。

实施例1：

本实施例涉及的漆酶的修饰方法包括以下三个步骤：

步骤一、通过RAFT(可逆加成断裂链转移)聚合合成嵌段共聚物PAA/PPEGA：

(1)、如图1所示，先将23.9mg芘功能化的4-氰基-4-乙基三硫代戊酸、2.8mg偶氮二异丁腈(AIBN)、0.44g丙烯酸(PAA)，在圆底烧瓶中用3.5mL超纯水和3.5mL二氧六环的混合溶剂溶解，将圆底烧瓶用橡胶塞密封，通入高纯氮气30分钟以除去反应体系中的氧气，再将圆底烧瓶在70℃下油浴，磁力搅拌反应10小时；

(2)、打开步骤(1)中圆底烧瓶并加入1.75g聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯(PEGA)，将圆底烧瓶用橡胶塞密封后通入氮气30分钟，然后在70℃下油浴，磁力搅拌反应10小时，反应得到的混合物用乙醚沉淀3-6次，得到白色沉淀物，如图2所示，所得白色沉淀物经过核磁表征，证明得到的聚合物是PAA/PPEGA共聚物，将制得的沉淀物置于烘箱中，在30℃下干燥48小时至恒重，储存备用；

步骤二、用嵌段共聚物PAA/PPEGA对漆酶进行修饰：

(1)、将0.468g PAA/PPEGA嵌段共聚物、9.6mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)在50mL的圆底烧瓶中用20ml二氯甲烷溶解，搅拌反应60分钟；

(2)、在步骤(1)制得的试剂中加入5.8g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),室温下反应24小时，然后用乙醚沉淀三次，制得活化的聚合物PAA/PPEGA-NHS,再将制得的PAA/PPEGA-NHS置于烘箱中，在80℃下干燥24小时至恒重备用；

(3)、配制浓度为0.1mol/L，pH＝5的醋酸盐缓冲液(ABS缓冲液)，称取20mg漆酶溶于20mLABS缓冲液中配制1mg/mL的漆酶储备液备用，称取200mgPAA/PPEGA-NHS，溶于10mLABS缓冲液中配制20mg/mL的PAA/PPEGA储备液备用；

(4)、取10mL步骤(3)制备的漆酶储备液逐滴加入到1mL搅拌的PAA/PPEGA储备液中，冰浴下搅拌反应8小时，将上述溶液用截留分子量为50000的透析膜于冰浴中透析1天，用以除去过量的PAA/PPEGA，制得用嵌段共聚物PAA/PPEGA修饰后的漆酶(PAA/PPEGA-laccase)。

步骤三、用铜离子对PAA/PPEGA-laccase进行修饰：

先用ABS缓冲液配制8mmol/l的硫酸铜溶液，然后将步骤二中得到的漆酶(PAA/PPEGA-laccase)在硫酸铜溶液中，在4℃下培养10小时，制得嵌段共聚物PAA/PPEGA和铜离子修饰后的漆酶(Cu²⁺/PAA/PPEGA-laccase)的混合溶液，再利用截留分子量为500的透析膜透析，除去吸附不牢的铜离子，得到嵌段共聚物PAA/PPEGA和铜离子修饰后的漆酶(Cu²⁺/PAA/PPEGA-laccase)，并冷冻干燥储存备用。

实施例2：

本实施例对原漆酶及经过嵌段共聚物PAA/PPEGA和铜离子修饰后的漆酶(Cu²⁺/PAA/PPEGA-laccase)的催化活性和稳定性进行测定，具体测试过程如下：

(1)、采用2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)法测定漆酶的催化活性，用ABS缓冲液配制0.5mmol/l ABTS的溶液，加入1mg/mL的漆酶储备液，在25℃下用紫外分光光度计测量420nm波长处的紫外吸收峰的变化，然后由此计算出漆酶的活性，计算结果如图3所示，发现Cu²⁺/PAA/PPEGA-laccase的活性提高到原来的447％；

(2)、在70℃下对原漆酶和Cu²⁺/PAA/PPEGA-laccase的催化活性进行测定，通过活性变化来表征漆酶的稳定性，结果如图4所示，当从10℃加热到70℃后，Cu²⁺/PAA/PPEGA-laccase的活性从410％下降到99％，而原漆酶的活性从100％到完全失活，证明Cu²⁺/PAA/PPEGA-laccase的活性提高；

(3)、如表1所示，对原漆酶和Cu²⁺/PAA/PPEGA-laccase在不同的培育条件下的半衰期进行测定，可以看出25℃下Cu²⁺/PAA/PPEGA-laccase的半衰期为23.7，相比于原漆酶的10，半衰期提高137％。

表1

实施例3：

本实施例涉及对经过嵌段共聚物PAA/PPEGA和铜离子修饰后的漆酶(Cu²⁺/PAA/PPEGA-laccase)的应用及催化活性和稳定性测定，具体工艺步骤如下：

步骤一、将Cu²⁺/PAA/PPEGA-laccase固定到石墨烯纸表面：

(1)、用ABS缓冲液配制1mg/mL的Cu²⁺/PAA/PPEGA-laccase溶液；

(2)、将1cm×1cm大小的石墨烯纸置于步骤(1)溶液中，在4℃条件下浸泡8小时；

(3)、取出步骤(2)中浸泡的石墨烯纸，用流动的超纯水冲洗石墨烯纸表面，以除去表面固定不牢的Cu²⁺/PAA/PPEGA-laccase；

(4)、用氮气吹干石墨烯纸，4℃下保存备用；

步骤二、将原漆酶固定在石墨烯纸的表面，用以比较Cu²⁺/PAA/PPEGA-laccase固定后的催化活性、稳定性，以及重复利用情况：

(1)、将20mg EDC、5mg NHS、20mg原漆酶溶解在在9mLABS缓冲液中；

(2)、将1mg芘丁酸溶解到1mL二甲基甲酰胺中；

(3)、将步骤(2)中制备的溶液逐滴加入到步骤(1)中的溶液中，于4℃下搅拌反应8小时；

(4)、用截留分子量为1000的透析袋，在4℃下透析24小时，以除去过量的EDS和NHS；

(5)采用与步骤一相同的工艺将，将芘修饰的漆酶固定在石墨烯纸表面；

步骤三、对固定的原漆酶以及Cu²⁺/PAA/PPEGA-laccase的催化活性和循环利用性能进行测试表征：

图5为固定在石墨烯纸上的Cu²⁺/PAA/PPEGA-laccase和原漆酶的活性测试，结果表明25℃和30℃下Cu²⁺/PAA/PPEGA-laccase的活性相比于原漆酶均有提高；图6为8次Cu²⁺/PAA/PPEGA-laccase循环利用后的活性测试结果，结果表明Cu²⁺/PAA/PPEGA-laccase固定后，经过8次循环利用，活性从317％降低到189％，而原漆酶的活性从100％到完全失活，表明经过嵌段共聚物PAA/PPEGA和铜离子修饰后的漆酶(Cu²⁺/PAA/PPEGA-laccase)的活性有明显提高，并且经过8次循环利用后，漆酶的活性仍比未改性的原漆酶活性高，表明Cu²⁺/PAA/PPEGA-laccase有应用潜力能够应用于降解邻苯二酚污染物中，并能够重复利用。