一种温郁金来源的倍半萜合酶、基因、载体、工程菌及其应用的制作方法

本发明涉及一种β-榄香烯的制备，特别涉及一种温郁金来源的倍半萜合酶、基因、载体、工程菌及其制备β-榄香烯的应用。

(二)

背景技术：

榄香烯(Elemene)是从姜科植物温郁金中提取出来的具有抗癌作用的有效成分，是我国自主研发的一类新型倍半萜药物。该药在临床运用时，高效、副作用少；能够改善微循环，有助于化疗、放疗药物进入癌组织发挥作用；具有选择性抑制肿瘤细胞增殖和提高免疫功能的双重效应；还可直接作用于细胞膜，使肿瘤细胞破裂死亡。目前榄香烯正被广泛应用于肺癌、胃癌、大肠癌等恶性肿瘤的治疗。虽然榄香烯系列抗肿瘤植物药的开发和临床应用正如火如荼，市场份额也在不断扩大，但是从天然植物温郁金中提取分离榄香烯仍存在许多技术难点：第一，温郁金植株仅块根中含有榄香烯，且含量极低，约占千分之一到千分之二；同时榄香烯的含量易受品种，根茎质量，种植环境等诸多因素影响。第二，挥发油中成分复杂，榄香烯与许多结构相似的倍半萜类化合物混杂在一起，必须通过精密分馏、分子蒸馏或超临界二氧化碳法进行初分，再通过薄层色谱和柱层析，经过多次分离才能得到纯品，因此榄香烯的提取工艺要求高难度大。另外，化学合成榄香烯的工艺十分复杂，反应步骤近10步，其中两步反应需在-78℃低温条件进行，且需要用到二氯甲烷、氰化钠、甲苯等剧毒化合物，不利于环境保护；最终合成的产物为外消旋混合物，需要进行拆分才能获得目标产物，产率只有50％，因此化学合成路线经济性差，无法进行商业化生产。这使得榄香烯原料药的生产成本较高，对其市场推广和全球化营销起到一定的阻碍作用。

采用酶催化方法进行β-榄香烯的生物合成具有一定的优势，例如反应条件温和、选择性高、产物专一性高。而进行酶催化的首要前体是优质的生物催化剂的获得。倍半萜合酶能够催化法尼基焦磷酸(FPP)生成功能结构及活性多样的倍半萜化合物，同时在催化过程中，其机制的多样性将对所生成的倍半萜结构的丰富性具有重要的影响。目前，已有多种萜类合酶如黄花蒿来源的β-法呢烯合酶等都陆续地被科学家们发现，这也预示着越来越多的新型化合物被发掘。研究萜类合酶基因的克隆、表达，有助于发掘萜类化合物的合成机制，从而能够进一步的研究代谢调控以及蛋白工程的改造。因此，对温郁金来源的倍半萜合酶研究具有重要的意义。

(三)

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种温郁金来源的倍半萜合酶、基因及其在催化FPP生成榄香烯中的应用。该倍半萜合酶属于萜类合成酶，最适反应温度为35℃，最适反应pH为8.5，具有很好的催化底物FPP生成β-榄香烯的活性。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种温郁金来源的倍半萜合酶(即CwSQS)，所述酶氨基酸序列为SEQ.ID NO.2所示。经实验证明，上述结构的蛋白质属于萜类合成酶，能催化FPP生成一定量的榄香烯。不难想到的是，在不改变蛋白质特性的情况，适当改变氨基酸序列，仍具有本发明醇脱氢酶特性。比如，氨基酸序列SEQ ID NO.2的保守性变异多肽，或其活性片段、或其衍生物。

本发明提供一种温郁金来源的倍半萜合酶编码基因(即CwSQS基因)，所述编码基因核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

本发明提供一种含有所述温郁金倍半萜合酶编码基因的重组载体。

进一步，所述重组载体按如下方法制备：将倍半萜合酶编码基因与pET28a载体连接，获得连接产物CwSQS-pET28a，即为含有温郁金倍半萜合酶编码基因的重组载体。将重组载体转化E.coli DH5α感受态细胞中，在含有50mg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃、180rpm下摇床培养1h，离心取沉淀后涂布于含有50mg/mL卡那霉素的LB平板，过夜培养后挑取单克隆进行PCR和提取重组质粒，即获得含有温郁金倍半萜合酶编码基因的重组质粒。

本发明还提供一种含有所述温郁金倍半萜合酶编码基因或重组载体的重组基因工程菌。

本发明提供一种所述温郁金倍半萜合酶编码基因在制备重组倍半萜合酶中的应用。具体所述的应用为：将含有所述温郁金倍半萜合酶编码基因的重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌在含50mg/mL卡那霉素的LB培养基上37℃培养12h至OD₆₀₀＝0.6，加入IPTG浓度为0.2mM，25℃诱导表达15h，将诱导培养液分离纯化，获得含有重组倍半萜合酶基因的菌体细胞，采用镍柱进行亲和层析分离获得倍半萜合酶。

本发明提供一种所述温郁金来源的倍半萜合酶在制备β-榄香烯中的应用，所述的应用为：以含温郁金来源的倍半萜合酶编码基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体超声破碎后的上清液经纯化的纯酶为催化剂，以法尼基焦磷酸(FPP)为底物，在二硫苏糖醇、MgCl₂和稀甘油(即1,2,3-丙三醇)的作用下，于pH为6.0-10.0的缓冲液中构成反应体系，在5-50℃(优选20-40℃，更优选35℃)进行生物转化反应，反应液分离纯化，获得β-榄香烯。所述反应体系中，催化剂的用量为0.1-1μg/mL，优选0.642μg/mL，所述底物终浓度为1-5μg/mL，优选2μg/mL，所述二硫苏糖醇和MgCl₂的终浓度分别为0.1-2mM，优选1mM和2-20mM，优选10mM，1,2,3-丙三醇体积终浓度为5-20％，优选10％。

进一步，所述催化剂按如下方法制备：将含温郁金来源的倍半萜合酶编码基因工程菌(优选E.Coil BL21codon plus/pET 28a/CwSQS)接种在含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇床过夜培养；再将培养液以体积浓度1％的接种量接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养，直到菌液OD₆₀₀达到0.6-0.8时加入终浓度0.5mM的IPTG，28℃诱导16h后，离心收集湿菌体；将湿菌体用pH7.4磷酸缓冲液重悬，超声破碎细胞，离心取上清，用0.22μm醋酸纤维素滤膜过滤，滤液用镍柱亲和层析，收集目标组分，获得纯酶。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：

本发明中的催化剂源自高产β-榄香烯的药用植物温郁金，体外活性证实，其可以催化底物FPP生成β-榄香烯，最终榄香烯的产量达到0.345μg，转化率为34.5％。

(四)附图说明

图1 SDS-PAGE分析重组CwSQS工程菌经IPTG诱导表达结果(M：marker；1，诱导前；2，诱导后；3，诱导后沉淀部分；4，诱导后上清部分；5，6：CwSQS纯化后)。

图2β-榄香烯标准品(a)与CwSQS催化反应产物(b)的GC-MS分析图。

图3反应温度对产物浓度影响虚线图。

图4 pH值对产物浓度影响虚线图。

图5反应时间对产物浓度影响虚线图。

图6 GC分析CwSQS重组蛋白催化产物，β-榄香烯出峰时间为15.902min。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1

1、CwSQS基因全长的克隆

采用高通量测序技术，提取温郁金块根、嫩叶、芽和茎混合组织的RNA，反转录后送上海捷瑞生物技术有限公司进行测序，采用生物信息学BLAST分析方法，与Genbank数据库进行比对，获得一条可能的倍半萜合酶基因，根据该基因的核苷酸序列，设计一对引物(上游引物：5`-ATGCCCGCTGCTCTCGTCTC-3`；下游引物：5`-TCATTGAATAGGGCGGAAGA G-3`)，以cDNA为模板进行高保真PCR反应，PCR反应参数为：首先95℃变性5min；其次，95℃变性30sec，63℃退火30sec，72℃衍生2min，30个循环；最后70℃延伸10min；待PCR反应结束后将产物进行回收并亚克隆，测序分析，成功获得SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的基因CwSQS，该基因编码的酶CwSQS氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

含目的基因的表达载体的构建，根据CwSQS基因编码序列(SEQ ID NO.1)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(上游为NdeI，下游为XhoI)，具体地说，上游引物为：5`-CATATGATGCCCGCTGCTCTCGTCTC-3`，下游引物为：5`-CTCGAGATTGAATAGGGCGGAAGAG-3`。PCR反应参数为：首先95℃变性5min；其次，95℃变性30sec，63℃退火30sec，72℃衍生2min，30个循环；最后70℃延伸10min。经PCR扩增后，将CwSQS克隆至中间载体(如pET28a)，在保证阅读框架正确的前提下鉴定好的表达载体，再将其转入E.Coil BL21codon plus中，获得工程菌E.Coil BL21codon plus/pET 28a/CwSQS。

2、CwSQS蛋白的诱导表达与纯化。将第1步中获得的工程菌E.Coil BL21codon plus/pET 28a/CwSQS在含100mL50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇床过夜培养。将10ml过夜培养后的菌液倒入1L含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养，直到菌液OD600达到0.6-0.8时加入IPTG终浓度为0.5mM，28℃诱导16h后，离心收集菌体，5g湿菌体用25ml、pH7.4磷酸缓冲液重悬，超声破碎细胞。离心取上清，用0.22μm醋酸纤维素滤膜过滤，根据产品说明书，将滤液进行镍柱(Qiagen，德国)亲和层析纯化获得CwSQS重组酶液，电泳图见图1所示。重组CwSQS纯酶在SDS-PAGE上条带显示约为69kDa，与预期的蛋白分子量68.7kDa相吻合，且以上清形式存在。采用BCA法进行蛋白浓度分析，纯化后的CwSQS酶液浓度达到64.2mg/L(图1)。

实施例2重组酶CwSQS的催化性质分析

1、反应温度

以实施例1方法制备的CwSQS重组酶液(浓度为64.2mg/L，体积为10μL)为催化剂，加入pH7.0Tris-HCL缓冲液、2μg FPP、500mM MgCl₂溶液20μL、500mM DTT2μL、100μL稀甘油(1,2,3-丙三醇)构成反应体系1ml，分别在5℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃下搅拌充分反应60min，同时采用顶空-固相微萃取技术吸附反应产物，待反应结束后(60min反应时间)，将萃取头取出注入气相色谱仪，对产物进行定量和定性分析。以β-榄香烯标准品为对照，通过分析色谱峰面积的大小来判断该实验所研究的倍半萜酶的催化性质。色谱条件：选用GC-2010岛津气相色谱仪；色谱柱为HP-5；载气：N₂，吹扫流量为3mL/min，无分流；柱箱起始温度40℃，保留2分钟，然后以7℃/min的速度升温至220℃，保留5分钟；进样口温度为250℃；检测器温度为250℃。

标准曲线的制备方法为：吸取一定量的β-榄香烯标准品溶液，进行精密称重，加入乙酸乙酯，配置成母液浓度375.2μg/mL；取一定量的β-榄香烯标准品母液，加入一定量的乙酸乙酯，进行4，50,100,200,500倍逐级稀释，配置成186.25、14.9、7.45、3.725、1.863μg/mL的标准品浓度梯度；分别吸取1μL，按上述方法进行色谱分析，峰面积分别为6654519、884323、60439、28991、14002、11295。根据β-榄香烯标准品的浓度(C)和峰面积(S)作出标准曲线：S＝18032C+294.25，R²＝0.99939。

结果表明：根据β-榄香烯和反应产物的GC-MS分析图谱，确定反应产物是β-榄香烯，即获得的重组酶CwSQS是一种专一性生成β-榄香烯的倍半萜合酶(图2)。

当温度在25℃-35℃的范围内，生成产物的相对浓度随温度的升高而增加，而当温度高于35℃时，产物浓度又随温度的升高而下降，因而该反应的最佳温度为35℃。此时产物生成量最高(图3)。

2、pH值

以实施例1方法制备的CwSQS重组酶液(浓度为64.2mg/L，体积为10μL)为催化剂，分别加入pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的Tris-HCL缓冲液、2μg FPP、500mM MgCl₂溶液20μL、500mM DTT 2μL、100μL稀甘油构成反应体系1ml，分别在30℃下搅拌反应60min，其它操作同步骤1。

pH在6.0-7.5时相对浓度随pH的增加缓慢上升，而当pH上升至8时，产物的相对浓度急剧增加，总体在pH在6.0-8.5范围内呈上升趋势，当pH继续上升时，此时相对浓度开始缓慢下降，因此该反应的最佳pH为8.5(图4)。

3、反应时间

以实施例1方法制备的CwSQS重组酶液(浓度为64.2mg/L，体积为10μL)为催化剂，分别加入pH8.5的Tris-HCL缓冲液、2μg FPP、500mM MgCl₂溶液20μL、500mM DTT 2μL、100μL稀甘油构成反应体系1ml，分别在35℃下搅拌反应15min、20min、30min、40min、50min、60min、120min、180min，其它操作同步骤1。

CwCQS重组蛋白催化反应的最佳反应时间为120min，在15-120min内，随着时间的增加，反应产物的浓度也增加，而120min之后，反应产物的浓度开始下降，该反应的最佳反应时间为120min(图5)。

经过上述条件探索后，在最佳的条件下(pH＝8.5、反应时间＝120min、温度＝35℃)，使底物与酶进行反应，最后用GC检测其产物的峰面积，按照上述标准曲线方程，经计算，得到最佳产量为0.345μg，转化率为34.5％(图6)。