一种聚甲基丙烯酸甲酯对脊柱转移瘤细胞影响的测试方法与流程

本发明属于脊柱转移性肿瘤
技术领域：
，尤其涉及一种聚甲基丙烯酸甲酯对脊柱转移瘤细胞影响的测试方法。
背景技术：
：目前，脊柱转移性肿瘤的后果包括病理骨折、脊髓受压，贫血，血钙过多。肺癌、乳腺癌、肾细胞癌、淋巴瘤、甲状腺和前列腺癌易转移到脊柱。其中乳腺癌特别容易转移到脊柱，发现其大约占骨转移的2/3。这些脊柱病变约三分之一有症状，造成严重的疼痛，神经受损，机械性的不稳定，并最终导致残疾和生活质量严重恶化。然而，治疗有症状的脊柱转移仍多选择姑息疗法，治疗的目标包括恢复和保护神经功能，维持脊柱稳定，缓解疼痛，以实现更好的生活质量。现在脊柱转移性肿瘤患者作为手术适应症是有争议的，因为缺乏这方面的文献证据作为基础。目前，人们普遍认为积极的手术切除可能适合至少3个月预期生存患者表现为进行性神经压迫，脊柱不稳定，但其也会为患者进一步带来手术创伤，新的外科技术微创手术等显示效果实现神经改善和缓解疼痛，减少失血，手术时间、并发症发生率。椎体成形术是一经皮的微创手术，椎体成形术在荧光或CT引导下将PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯polymethylmethacrylate，PMMA)直接注入椎体内并在椎体内固化，固化后的骨水泥不仅可以从内部稳定病理性压缩骨折、恢复椎体高度、防止进一步压缩骨折和纠正脊柱后凸的畸形，还可以限制肿瘤的生长范围和扩散空间。镇痛属性被认为除了机械稳定外第二重要的功能，可能与骨水泥对神经末梢疼痛的热效应和抗肿瘤细胞毒性效应有关。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种聚甲基丙烯酸甲酯对脊柱转移瘤细胞影响的测试方法，旨在评估PMMA对原代培养肿瘤细胞增殖过程中的杀灭作用以及PMMA在体外对肿瘤细胞可能的细胞毒性影响作用机制。本发明是这样实现的，一种聚甲基丙烯酸甲酯对脊柱转移瘤细胞影响的测试方法，所述聚甲基丙烯酸甲酯对脊柱转移瘤细胞影响的测试方法将不同阶段的PMMA骨水泥处理原代培养脊柱转移瘤细胞24h；测量骨水泥内部以及表面温度，并分别观察拉丝期骨水泥所释放的热量对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响；采用流式细胞术测量细胞凋亡和细胞周期。PMMA对Bcl-2、Bax、Caspase3、Caspase8、Fas和PARP在与细胞凋亡的关系；cyclinD1，P21andP27与细胞周期的关系是由SYBRGreenⅠ荧光定量PCR法和westernblot检测的。。进一步，所述聚甲基丙烯酸甲酯对脊柱转移瘤细胞影响的测试方法包括以下步骤：步骤一，肿瘤组织收集；步骤二，将临床手术/活检所取肿瘤标本置于含10％胎牛血清的1640培养液的已消毒培养皿中，带回实验室处理；步骤三，骨水泥的调和与作用方式，使用盘形骨水泥样本进行细胞实验；将骨水泥聚合粉体和液体单体倒入已消毒的不锈钢碗中，并不断搅拌使之均匀，搅拌30s～60s逐渐粘稠后吸入骨水泥注射器内后转移到模具中，在19℃的室内，将拉丝期或者完成聚合阶段的骨水泥从模具中取出，转移到24孔的细胞培养皿内，将聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥加入脊柱转移瘤细胞后24小时进行下一步检测；步骤四，分别采用骨水泥以及拉丝期骨水泥与肿瘤细胞共培养的方式，分别观察三个不同聚合阶段，特别是拉丝期所释放的热量对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响；分别取1d,2d,3d三个不同聚合时间点测量细胞增殖；将0.2，0.3,0.4，0.5ml拉丝期骨水泥分别与1X106/孔肿瘤细胞共培养，采用AnnexinV/PI测量细胞凋亡，观察凋亡率是否与骨水泥量呈剂量相关性；步骤五，将骨水泥混合后于室温注入0.5ml于6孔板中后，待骨水泥进入拉丝期后置于37℃温水水浴箱中，以模拟椎体成型术中聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥被注入人体后的体温环境；而后取工业水银温度计，将水银头放入聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥中测骨水泥内部温度的变化，并以皮温计测骨水泥表面温度变化，每0.5min记录一次，至温度回落直40℃为止；重复4次；步骤六，将拉丝期骨水泥这注入模具中，制备成圆盘形的聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥样品，砂纸打磨抛光，用去离子水中超声清洗5min，吹干后常规消毒；再将骨水泥样品完全浸入10％胎牛血清中培养，放置在37℃、5％CO2培养箱中浸泡72小时，后将浸出液取出冻存于-85℃冰箱中备用，样品表面积与培养液体积比例为1:1.3；肿瘤细胞被一式三份按1×106的密度植入在96孔板里，每孔加入100μl浸出液，取1d，2d，3d三个时间点进行MTT测试；步骤七，取对数生长期的原代转移瘤细胞以1X106个/孔接种于六孔板中，24H后将处于拉丝期0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml骨水泥加入到每孔细胞中，并将骨水泥分别以拉丝期和冷却凝固期按上述方法放置于细胞中，同时设阴性对照组，第48小时，用0.25％胰酶分别消化骨水泥实验组以及对照组转移瘤细胞，制成单细胞悬液，取1ml转移瘤细胞，l000r/min4℃离心5min，吸取并弃上清液，重复2次该步骤，随后缓缓注入1ml预冷的PBS，加以震荡使细胞悬浮，然后l000r/min4℃离心5min，并弃上清液，将经上述处理过后细胞重悬于200μl结合缓冲液，并加入10μlAnnexinV—FITC和5μlPI，轻轻将以上物质混匀，避光条件下室温反应15min，加入300μl结合缓冲液，即刻使用流式细胞仪进行检测；光源488nm氩离子激光器，当FITC受激发后会发出绿色的荧光，PI会发出红色的荧光；步骤八，将培养的对数生长期转移瘤细胞消化接种到六孔板内，24h后按上述方法将PMMA作用于转移瘤细胞，同时设立阴性对照组，48小时后将漂浮以及贴壁转移瘤细胞一同用0.25％胰酶消化收集，用PBS轻缓的洗涤细胞2次，收集细胞并使用PBS调整细胞浓度至1×106/ml，加入70％乙醇至细胞中制备成单细胞悬液，4℃固定过夜；加入染色缓冲液37℃水浴30min；再加入PI染色混匀，4℃避光30min；用流式细胞仪检测，记录激发波长488nm处红色荧光，重复4次；步骤九，RNA提取以及real-time定量PCR实验；引物合成：PCR引物序列是以NCBI所提供的每种基因的NM编号，通过生物软件设计，再利用DNA生物合成仪制成；提取总RNA步骤；紫外分光光度计测提取RNA的纯度和浓度：步骤十，冰上提取细胞总蛋白，蛋白浓度测定，免疫印迹反应。进一步，到实验室后于无菌操作台内迅速移入含双抗内含青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml的PBS液中洗涤2～3次，用组织剪剔除脂肪组织、坏死组织和血块，用PBS液冲洗2～3次后放入10％胎牛血清的1640培养液浸泡，使用眼科剪剪碎为近似1mm3大小的块状，使用0.125％胰酶消化分解切碎的样本，通过无菌200目筛网过滤器过滤后将滤网表面的组织收集到一新50ml离心管内，用离心机1200rpm×5分钟分离细胞，清洗三次后1640培养液重悬而后加入10％的胎牛血清5×105细胞/毫升，最后肿瘤细胞在5％CO237℃的环境下孵育培养。进一步，MTT测试包括：添加50μl的MTT到每个孔，然后培养皿在37℃培养4h。吸取上清液后，加入150μl二甲亚砜并混合，用全自动多功能酶标仪在波长492nm测吸光度。进一步，提取总RNA步骤包括：将对数生长期的转移瘤细胞消化并接种到六孔板，次日，将骨水泥以不同时期形式加入转移瘤细胞中作用，并同时设阴性对照组；24h后，从处理后的肿瘤细胞中按RNAislPLUSKIT提取说明书提取总RNA：备好氯仿和异丙醇，向细胞中注入1ml的BiozolReagent裂解样品：因为脊柱肿瘤细胞是贴壁细胞，吸干净培养基，随后往培养瓶内注入BiozolReagent，枪头反复吸取混匀细胞，随后移入1.5ml离心管中；裂解液置于室温下2～3min，加入0.5ml氯仿，盖好盖后剧烈振动15s；在4℃下12000g高速离心3min，溶液分层为酚氯仿，中间相和水相，RNA位于水相转移不超过80％上清液于新的离心管中，加入0.5倍的异丙醇，在室温下以最大速度涡旋15s；将小于700μl的混合液转移至ezBindRNA柱中，将会形成沉淀，将沉淀一起转移到RNA柱内，室温下10000g离心30～60s，舍弃废液后重新用收集管重复上一步骤将剩余样品过柱，离心，弃废液最后丢弃收集管；将RNA柱放入一新的2ml收集管内，加入300μlBufferRB，按上述条件离心弃废液；将柱子放在收集管中，加入400μlBufferRB，离心弃废液；将柱子放在收集管中，加入600μlRNAwashbuffer，离心弃废液；再次重复上述步骤一次；随后13000g高速空离心2分钟；最后洗脱RNA，即将柱子转移到新的1.5ml收集管内，加入30～50μlDEPC-TRENTEDddH2O，放置2分钟，10000g高速离心1min。进一步，紫外分光光度计测提取RNA的纯度和浓度包括：1)开机预热10分钟；2)基线校正：用重蒸水加入比色杯中洗涤，用吸水纸吸干水分，加入TE缓冲液后放入仪器后进行基线校正；3)取2μl提取出的RNA，加入68μlDEPC水稀释，共70μl进行测量；4)采用合格的RNA标本，按TAKARA说明书逆转录合成cDNA。进一步，于冰上提取细胞总蛋白具体包括：弃转移瘤细胞培养基，PBS洗2次，吸干PBS后再加入2mlPBS，使用细胞刮轻缓刮取细胞，重复一次将刮取下的细胞转移至10ml玻璃离心管内，离心1000rpm5分钟弃上清后加1mlPBS，吹匀后转移至1.5mlEP管内，4000rpm2分钟再弃上清，加入含PMSF蛋白酶抑制剂、RIPA磷酸酶抑制剂的细胞裂解液120μl，冰上反复吹打2分钟冰上静置30分钟，振荡一次/5min，12000rpm，4℃低温离心15分钟，吸取上清置入另一1.5mlEP管，并放冰上，取部分做pro浓度测定、煮沸变性：上样缓冲液为4：1，-20℃冰箱冷冻保存备用。进一步，蛋白浓度测定方法包括：应用BCA蛋白浓度测定试剂盒，并按照浓度测定试剂说明书中所注明步骤操作：按A:B＝50:1配制BCA工作液配制25mg/ml的蛋白标准溶液，取25mg/ml的蛋白标准溶液，稀释至终浓度为0.5mg/ml稀释标准品，每一种蛋白梯度和样品做2个复孔；将标准品按0μl，1μl，2μl，4μl，8μl，12μl，16μl，20μl加到96孔板视为标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μl，加适当体积样品到96孔板的视为样品孔中，加标准品稀释液到20μl，各孔加入200μlBCA工作液，37℃孵箱内放置30分钟；取出于室温中冷却到室温，使用之前预热好的酶标仪测定57Onm时的吸光度。进一步，免疫印迹反应具体包括：1)首先安装好电泳仪的玻璃板，根据不同目的蛋白分子量大小来配制8％～12％不同浓度的SDS-PAGE分离胶，灌注并加水液封，放置在室温中30min-60min以上；2)浓缩胶灌制：等待分离胶凝固后，倒去胶面上层水，用滤纸吸干分离胶表面的水份；沿胶槽边缘迅速注入浓缩胶，然后沿水平方向轻轻插入梳子后放15分钟；3)当浓缩胶完全聚合后就可以将梳子取出，再用蒸馏水对准样品孔进行冲洗，再把玻璃板固定在电泳仪的电泳槽中，注入电泳缓冲液；4)以BCA法制备的变性的蛋白样品取出，按预定顺序加样，从两边分别向加样孔注入30μl缓冲液；5)电泳：以恒压模式电泳，以80V的电压预电泳30分钟，当上样缓冲液至两种胶的交界线处时，将电压调到100V继续电泳；电泳直至胶条中蛋白Marker的各条带都被彻底的分离时即终止电泳，约120分钟；6)切胶；7)转膜：在电泳结束前将转膜缓冲液准备好，标记PVDF膜后将纤维垫片、滤纸、硝酸纤维素滤膜等一起浸入电转缓冲液中做平衡准备，待电泳结束取出凝胶，浸入转膜缓冲液中10分钟；8)按照顺序安装转移装置：底上垫一张海绵垫-三层滤纸-凝胶条-PVDF膜-三层滤纸-海绵垫片，将各层不留气泡的完全对齐，由下而上顺序固定在夹层盒。再将夹子放进电转槽中，并将夹的黑面与槽子黑面相对，白面与槽红面相对。槽放入加入冰块的盒中，根据目标蛋白分子量定转膜时间，转膜完毕后胶条用考马斯亮蓝染色，用于判断目标蛋白的转膜效率；9)TBST配制及封闭：250μlTween20加入→500mlPBS，将膜用5％的脱脂奶粉在摇床上封闭1h，再用TBST漂洗1次；10)一抗孵育：加入稀释的一抗，室温下振荡lh，4℃冰箱过夜孵育。TBST洗2次以上，每次10min，加入以5％脱脂奶粉的TBST溶液按1:1000稀释HRP标记的羊抗兔二抗，室温条件下摇床振荡孵育2h，取出二抗，37℃孵化1小时。再在脱色摇床上摇动，用TBST漂洗3次以上，每次5min；11)化学发光、图像采集：配制ECLPlus试剂发光反应液，振荡使之混合均匀，将膜缓冲液中取出，贴角用滤纸貼角吸干残余缓冲液，固定在片盒中，滴加发光反应液，chemiDocXRS+成像系统进行图像采集。本发明提供的聚甲基丙烯酸甲酯对脊柱转移瘤细胞影响的测试方法，拟通过体外PMMA处理原代培养椎体转移瘤细胞，以Bcl-2、Bax、Caspase3、Caspase8、Fas等凋亡基因为切入点，采用realtime-PCR、Westernblot及流式细胞仪等检测肿瘤细胞凋亡率变化及可能的凋亡途径，阐明其对肿瘤细胞的影响的分子机制。同时对临床行PVP的患者进行随访，记录患者术后及长期的疼痛缓解与生活质量，为PMMA治疗脊柱转移瘤的研究找到新的突破口和切入点；第一次运用经皮椎体成型术(Percutaneousvertebroplasty，PVP)是用于治疗颈椎血管瘤。随着经皮注射方式和骨水泥的改进，迅速推广运用于治疗原发性和转移性脊柱疾病。有限的侵袭性和快速改善疼痛使它吸引不同的临床医生和患者。PMMA由粉剂的聚合物和液态的单体两部分组成。PMMA单体与聚合物搅拌时会因聚合反应而产热。聚合后按按不同的物理状态分为稀薄期、拉丝期和固化期3个阶段，初期搅拌骨水泥时呈不产热液体状，可自由流动；随后逐渐变得粘稠糊状，仍然有一定的液态性质；最后骨水泥行程牙膏状直至硬化为坚固的固态物体。在逐渐硬化的过程中骨水泥会释放热量，温度急剧增高。由此注入骨水泥不仅能够巩固和稳定被肿瘤细胞破坏的椎体，由于化学毒性和热效应它还提供了一些局部的抗肿瘤效果。本发明的目的是评估PMMA对原代培养肿瘤细胞的增值和死亡的作用以及调查PMMA在体外对肿瘤细胞可能的细胞毒性机制；首次了解体外PMMA对原代培养脊柱转移瘤细胞作用的分子机制，提供了一个队凋亡分子元素表达的综合研究，Fas，Bcl-2/Bax，Caspase-3，9和细胞周期分子因素cyclineD1，P21和P27，从而为经皮椎体成型术注入骨水泥PMMA可用于脊柱转移性肿瘤的治疗提供了一个理论基础。与对照组相比，使用PMMA刺激后的细胞生长更加显著的缓慢。此外虽然冷却期的PMMA治疗组与对照组的凋亡率区别不大，但PMMA组细胞凋亡率明显高于对照组。冷却后PMMA组、拉丝期PMMA组、对照组的凋亡率分别为(28.57±8.31)％、(41.87±7.35)％、(4.08±1.09)％，各组凋亡率均显著高于对照组(P<0.05)；相应的G0/G1期细胞比率为(50.91±6.23)％、(77.04±8.61)％和(38.89±9.27)％，PMMA两组G0/G1期细胞也显著衰减；此外，PMMA刺激的原代培养细胞中，分子标记的细胞凋亡，包括Fascaspase-3caspase-9激活，Bcl-2/Bax失调。此外，我们评估细胞周期有关基因周期蛋白cyclinD1，P21andP27。结果表明在PMMA治疗组中cyclinD1更低水平的表达，而P21升高(P<0.05)。；PMMA骨水泥能够明显诱导转移瘤细胞凋亡和阻止细胞在G0/G1期，它为注入骨水泥治疗脊椎转移瘤提供了实验证据。附图说明图1是本发明实施例提供的聚甲基丙烯酸甲酯对脊柱转移瘤细胞影响的测试方法流程图。图2是本发明实施例提供的分析PMMA治疗对细胞生长和生存能力的影响作用示意图。图3是本发明实施例提供的流式细胞仪检测不同剂量骨水泥诱导的脊柱转移瘤细胞凋亡示意图；图4是本发明实施例提供的流式细胞仪检测骨水泥诱导的脊柱转移瘤细胞凋亡示意图；图5是本发明实施例提供的流式细胞仪检测骨水泥诱导的脊柱转移瘤细胞周期作用示意图；图6是本发明实施例提供的通过real-timePCR测PMMA对caspase-3，9，Bcl-2，Bax和Fas蛋白的表达影响示意图。图7是本发明实施例提供的PMMA改变脊柱转移性细胞的细胞周期相关基因，通过real-timePCR测PMMA对cyclinD1，P21和P2的表达影响示意图。图中：A.westernblot测PMMA对caspase-3，9，Bcl-2，Bax和Fas蛋白的表达影响；B.westernblot测PMMA对cyclinD1，P21和P27表达的影响。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。如图1所示，本发明实施例的聚甲基丙烯酸甲酯对脊柱转移瘤细胞影响的测试方法包括以下步骤：S101：通过体外PMMA处理原代培养椎体转移瘤细胞，以Bcl-2、Bax、Caspase3、Caspase8、Fas等凋亡基因为切入点；S102：采用realtime-PCR、Westernblot及流式细胞仪等检测肿瘤细胞凋亡率变化及可能的凋亡途径，阐明其对肿瘤细胞的影响的分子机制；S103：同时对临床行PVP的患者进行随访，记录患者术后及长期的疼痛缓解与生活质量，为PMMA治疗脊柱转移瘤的研究找到新的突破口和切入点。下面结合实验对本发明的应用原理作进一步的描述。1材料和方法1.1设计：实验性研究时间及地点：开展实验的具体时间(2012年8月/2015年1月)、地点(重庆医科大学，骨外科)。1.2材料1.2.1主要试剂及仪器PMMA(天津市合成材料产业研究所)、1640培养液(Hyclone公司)、胎牛血清(Hyclone公司)AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(杭州碧云天生物技术研究所)、EzgenebiozolRNAKit(大连宝生物工程有限公司)、PCR引物合成TaKaRa(大连宝生物)、CDNA逆转录试剂盒(大连宝生物工程有限公司)、SYBRGreenReal-timePCR(Biomiga公司)、兔抗人cyclinD1抗体(1:500,Abcam,UK)、兔抗人P21抗体(1:500,Abcam,UK)、兔抗人P27抗体(1:500,Abcam,UK)兔抗人Fas抗体(1:1000,CellSignaling,USA)、兔抗人caspase-3抗体(1:1000,CellSignaling,USA)、兔抗人caspase-9抗体(1:1000,CellSignaling,USA)、兔抗人Bcl-2抗体(1:1000,CellSignaling,USA)、兔抗人Bax抗体(1:1000,CellSignaling,USA)、β-actinantibody(1:8000,Beyotime,China)1.2.2主要仪器旋涡混合器、一次性水银温度计、BDFACSvantageSE流式细胞仪、倒置相差显微、CFX96实时定量PCR仪、电泳转膜系统、电泳仪、低温离心机机、台式高速离心机、721分光光度计、恒温水浴箱、凝胶扫描系统、普通光学显微镜、超净工作台、超低温(-80℃)冰箱、电子天平、微量移液器、电泳槽。1.3方法1.3.1肿瘤组织收集肿瘤组织在行椎体成型术时分别从7位患者(3男性和4为女性，平均年龄在55.86±12.83岁收集，其中3为女性为原发性乳腺癌，1位女性为原发性肾癌，2位男性为原发性肺癌和1位男性患者人原发性膀胱癌。所有组织捐助者均签署了书面知情同意书并在手术之前得到重庆医科大学当地伦理委员会的批准。此外，脊椎活检是在为疑似为肿瘤做确诊的过程中活检取出的，所剩的转移瘤组织也是用于实验室研究。1.3.2取材及培养：在手术室将临床手术/活检所取肿瘤标本(经病理学检查确认为肿瘤组织)置于含10％胎牛血清的1640培养液的已消毒培养皿中(培养皿四周事先铺好冰块)，带回实验室，到实验室后于无菌操作台内迅速移入含双抗(内含青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml)的PBS液中洗涤2～3次，用组织剪剔除脂肪组织、坏死组织和血块，用PBS液冲洗2～3次后放入10％胎牛血清的1640培养液浸泡，使用眼科剪剪碎为近似1mm3大小的块状，使用0.125％胰酶((Sigma，USA)消化分解切碎的样本，通过无菌200目筛网过滤器过滤后将滤网表面的组织收集到一新50ml离心管内，用离心机1200rpm×5分钟分离细胞，清洗三次后1640培养液((Hyclone，美国)重悬而后加入10％的胎牛血清(Gibco，美国)5×105细胞/毫升，最后肿瘤细胞在5％CO237℃的环境下孵育培养。1.3.3骨水泥的调和与作用方式PMMA主要特征如下:聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)骨水泥由聚合粉剂和单体液体两部分组成。聚合粉剂是无挥发气味的白色粉状物。液体是一种易挥发的亲脂性且具有细胞毒性的甲基丙烯酸甲酯单体。其单体和其他化学成分有细胞毒性，能诱导溶骨性感染、低血压反应、接触性发炎、迟发性感染等并发症。使用盘形骨水泥样本(直径5mm，高25mm，约0.5ml)来进行细胞实验。将骨水泥聚合粉体和液体单体倒入已消毒的不锈钢碗中，并不断搅拌使之均匀，搅拌30s～60s逐渐粘稠后吸入骨水泥注射器内后转移到模具中，在19℃的室内，将拉丝期(～10min)或者完成聚合阶段(冷却期，～30min)的骨水泥从模具中取出，转移到24孔的细胞培养皿内。除了MTT测试外，将PMMA骨水泥按上述方式加入脊柱转移瘤细胞后24小时进行下一步检测。1.3.4细胞分组本发明分别采用骨水泥浸出液以及拉丝期骨水泥与肿瘤细胞共培养的方式，分别观察三个不同聚合阶段，特别是拉丝期所释放的热量对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响。聚合液参照ISO标准制作，分别取1d,2d,3d三个时间点测量细胞增殖；将0.2，0.3,0.4，0.5ml拉丝期骨水泥分别与1X106/孔肿瘤细胞共培养，采用AnnexinV/PI测量细胞凋亡，观察凋亡率是否与骨水泥量呈剂量相关性。最后一部分中为了探讨骨水泥对肿瘤细胞作用的相关机制，分别用拉丝期、冷却期以及同体积形状的玻璃柱共培养细胞，检测了相关细胞凋亡、周期的靶点。1.3.5PMMA聚合反应温度测定将骨水泥混合后于室温注入0.5ml于6孔板中后，待骨水泥进入拉丝期后置于37℃温水水浴箱中，以模拟椎体成型术中PMMA被注入人体后的体温环境。而后取工业水银温度计，将水银头放入PMMA中测骨水泥内部温度的变化，并以皮温计测骨水泥表面温度变化，每0.5min记录一次，至温度回落直40℃为止；重复4次。1.3.6利用MTT测定细胞生存能力为了观察冷却后骨水泥所释放出的单体对转移瘤细胞的影响，采取MTT(methylthiazolyltetrazolium)(Beyotime，中国)测定骨水泥样品浸出液对细胞的细胞增殖作用。浸出液制备参照ISO10993-12:2007，将拉丝期骨水泥这注入模具中，制备成圆盘形的PMMA水泥样品(10毫米直径,2毫米高度)，而后同一人使用200～800(#)砂纸打磨抛光，而后用去离子水中超声清洗5min，吹干后常规消毒。再将骨水泥样品完全浸入10％胎牛血清中培养，放置在37℃、5％CO2培养箱中浸泡72小时，后将浸出液取出冻存于-85℃冰箱中备用，样品表面积与培养液体积比例为1:1.3。肿瘤细胞被一式三份按1×106的密度植入在96孔板里，每孔加入100μl浸出液，取1d，2d，3d三个时间点进行MTT测试，简述如下：添加50μl的MTT到每个孔，然后培养皿在37℃培养4h。吸取上清液后，加入150μl二甲亚砜并混合，用全自动多功能酶标仪(美国BD)在波长492nm测吸光度。1.3.7AnnexinV/PI染色分析细胞凋亡步骤:取对数生长期的原代转移瘤细胞以1X106个/孔接种于六孔板中，24H后将处于拉丝期0.2、0.3、0.4、0.5、0.6(ml)骨水泥加入到每孔细胞中，并将适量骨水泥分别以拉丝期和冷却凝固期按上述方法放置于细胞中，同时设阴性对照组，第48小时，用0.25％胰酶分别消化骨水泥实验组以及对照组转移瘤细胞，制成单细胞悬液(细胞数为1～5×106个/m1)，取1ml转移瘤细胞，l000r/min4℃离心5min，吸取并弃上清液，重复2次该步骤，随后缓缓注入1ml预冷的PBS，轻轻加以震荡使细胞悬浮，然后l000r/min4℃离心5min，并弃上清液，将经上述处理过后细胞重悬于200μl结合缓冲液，并加入10μlAnnexinV—FITC和5μlPI，轻轻将以上物质混匀，避光条件下室温反应15min，加入300μl结合缓冲液，即刻使用流式细胞仪进行检测。光源488nm氩离子激光器，当FITC受激发后会发出绿色的荧光，PI会发出红色的荧光。实验结果经电脑分析处理后绘制为四方格图，其右上、下方格各分部代表晚期及早期凋亡细胞百分率。1.3.8通过流式细胞术观察细胞周期实验将培养的对数生长期转移瘤细胞消化接种到六孔板内，24h后按上述方法将PMMA作用于转移瘤细胞，同时设立阴性对照组，48小时后将漂浮以及贴壁转移瘤细胞一同用0.25％胰酶消化收集，用PBS轻缓的洗涤细胞2次(离心：800rpm5min)，收集细胞并使用PBS调整细胞浓度至1×106/ml，加入70％乙醇至细胞中制备成单细胞悬液，4℃固定过夜；加入染色缓冲液(PBS包含1mg/mLPI和10mg/mLRNaseA)37℃水浴30min；再加入PI染色混匀，4℃避光30min；用流式细胞仪检测(BD,USA)，记录激发波长488nm处红色荧光，重复4次。1.3.9RNA提取以及real-time定量PCR实验(1)引物合成：PCR引物序列是以NCBI所提供的每种基因的NM编号，通过生物软件设计，再请Takara公司利用DNA生物合成仪制成。见表1表1目标基因和相应的序列(2)提取总RNA步骤：将对数生长期的转移瘤细胞消化并接种到六孔板，次日，按上述方式将骨水泥以不同时期形式加入转移瘤细胞中作用，并同时设阴性对照组；24h后，从处理后的肿瘤细胞中按RNAislPLUSKIT(Takara，日本)提取说明书提取总RNA：事先备好氯仿和异丙醇，向细胞中注入1ml的BiozolReagent裂解样品：因为脊柱肿瘤细胞是贴壁细胞，所以尽可能吸干净培养基，随后往培养瓶内注入BiozolReagent，枪头反复吸取混匀细胞，随后移入1.5ml离心管中；裂解液置于室温下2～3min，加入0.5ml氯仿，盖好盖后剧烈振动15s；在4℃下12000g高速离心3min，溶液分层为酚氯仿，中间相和水相，RNA位于水相转移不超过80％上清液于新的离心管中，加入0.5倍的异丙醇，在室温下以最大速度涡旋15s；将小于700μl的混合液转移至ezBindRNA柱中，在第五步将会形成沉淀，将沉淀一起转移到RNA柱内，室温下10000g离心30～60s，舍弃废液后重新用收集管重复上一步骤将剩余样品过柱，离心，弃废液最后丢弃收集管；将RNA柱放入一新的2ml收集管内，加入300μlBufferRB，按上述条件离心弃废液；将柱子放在收集管中，加入400μlBufferRB，按上述方法离心弃废液；将柱子放在收集管中，加入600μlRNAwashbuffer，按上述方法离心弃废液；再次重复上述步骤一次；随后13000g高速空离心2分钟；最后洗脱RNA，即将柱子转移到新的1.5ml收集管内，加入30～50μlDEPC-TRENTEDddH2O，放置2分钟，10000g高速离心1min。(3)紫外分光光度计测提取RNA的纯度和浓度：1)开机预热10分钟；2)基线校正：用重蒸水加入比色杯中洗涤，用吸水纸吸干水分，加入TE缓冲液后放入仪器后进行基线校正；3)取2μl提取出的RNA，加入68μlDEPC水稀释，共70μl进行测量。(4)采用合格的RNA标本，按TAKARA说明书逆转录合成cDNA：1)去除基因组中DNA：为了准确地量分析基因，首先应去除基因组DNA。按说明书中反应液的配制：反应条件：42℃×2分钟2)反转录反应：需在冰上配制反应液：按说明书中配制反应体系20μl反应条件：37℃15分钟，再85℃5秒，如果需长时间保存，则于—20℃保存。所有cDNA工作液按如下realtime-PCR(ABIPrism7500)反应体系分别配制：cyclinD1，P21，P27，Fas，caspase-3，caspase-9，Bcl-2，BaxandGAPDH由Takara合成，72℃45s，进行40个循环。电脑系统会在反应结束时自动绘制标准曲线，由软件按△△C(T)法自动计算待测样品中目的基因的准确含量。1.3.10细胞溶解产物和免疫印迹(Westernblotting)实验原理：蛋白质等生物大分子具有不同的电荷和分子量。用阴离子去污剂SDS作用于蛋白质中和它们分子上的电荷，然后不同的蛋白质在聚丙烯酞胺电泳时将会按其分子量大小来分布，所以电泳迁移率仅仅依赖于蛋白质不同的分子量。westemBlot的实验方法是使用获得的蛋白质样品，通过SDS一PAGE(聚丙烯酞胺凝胶)电泳，以此分离不同分子量的蛋白质。然后利用转移电泳将凝胶上分离到的Pro转印至固相支持物上，用一抗与转印后膜((PVDF膜))上的靶蛋白特异性结合，再结合经酶/同位素标耦联的二抗，最后让底物显色/放射自显影来检测经电泳分离出的特异性目的基因所表达出的蛋白成分。(1)于冰上提取细胞总蛋白弃转移瘤细胞培养基，PBS洗2次，吸干PBS后再加入2mlPBS，使用细胞刮轻缓刮取细胞，重复一次将刮取下的细胞转移至10ml玻璃离心管内，离心1000rpm5分钟弃上清后加1mlPBS，吹匀后转移至1.5mlEP管内，4000rpm2分钟再弃上清，加入含PMSF(蛋白酶抑制剂)、RIPA(磷酸酶抑制剂)的细胞裂解液120μl，冰上反复吹打2分钟冰上静置30分钟，振荡一次/5min，12000rpm，4℃低温离心15分钟，吸取上清置入另一1.5mlEP管，并放冰上，取部分做pro浓度测定、煮沸变性：上样缓冲液为4：1，-20℃冰箱冷冻保存备用。(2)蛋白浓度测定：应用BCA蛋白浓度测定试剂盒，并按照浓度测定试剂说明书中所注明步骤操作：按A:B＝50:1配制BCA工作液配制25mg/ml的蛋白标准溶液，取适量25mg/ml的蛋白标准溶液，稀释至终浓度为0.5mg/ml稀释标准品，每一种蛋白梯度和样品做2个复孔。将标准品按0μl，1μl，2μl，4μl，8μl，12μl，16μl，20μl加到96孔板视为标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μl，加适当体积样品到96孔板的视为样品孔中，加标准品稀释液到20μl，各孔加入200μlBCA工作液，37℃孵箱内放置30分钟。取出于室温中冷却到室温，使用之前预热好的酶标仪测定57Onm时的吸光度(OD值)。计算机软件将会自动生成pro浓度标准曲线和待测蛋白样品的浓度。(3)免疫印迹反应1)首先安装好电泳仪的玻璃板。根据不同目的蛋白分子量大小来配制8％～12％不同浓度的SDS-PAGE分离胶。灌注并加水液封。为了保证分离胶可以完全聚合，需将其放置在室温中30min-60min以上。2)浓缩胶灌制：等待分离胶凝固后，倒去胶面上层水，用滤纸吸干分离胶表面的水份。沿胶槽边缘迅速注入浓缩胶。然后沿水平方向轻轻插入梳子后放15分钟，以预防气泡进入胶层影响后续进程。3)当浓缩胶完全聚合后就可以将梳子取出，再用蒸馏水对准样品孔进行冲洗，再把玻璃板固定在电泳仪的电泳槽中，注入电泳缓冲液。4)将事先以BCA法制备的变性的蛋白样品取出，按预定顺序加样，从两边分别向加样孔注入30μl缓冲液，防止边缘效应。5)电泳：以恒压模式电泳，首先以80V的电压预电泳30分钟，当上样缓冲液至两种胶的交界线处时，将电压调到100V继续电泳；电泳直至胶条中蛋白Marker的各条带都被彻底的分离时即终止电泳，约120分钟。6)切胶。7)转膜：在电泳结束前将转膜缓冲液准备好，标记PVDF膜(按凝胶大小准备硝酸纤维素滤膜)后将纤维垫片、滤纸、硝酸纤维素滤膜等一起浸入电转缓冲液中做平衡准备。待电泳结束取出凝胶，浸入转膜缓冲液中10分钟。8)按照顺序安装转移装置：底上垫一张海绵垫-三层滤纸-凝胶条-PVDF膜-三层滤纸-海绵垫片，将各层不留气泡的完全对齐，由下而上顺序固定在夹层盒。再将夹子放进电转槽中，并将夹的黑面与槽子黑面相对，白面与槽红面相对。槽放入加入冰块的盒中，根据目标蛋白分子量定转膜时间。转膜完毕后胶条用考马斯亮蓝染色，用于判断目标蛋白的转膜效率。9)TBST配制及封闭：250μlTween20加入→500mlPBS。将膜用5％的脱脂奶粉在摇床上封闭1h，再用TBST漂洗1次。10)一抗孵育：加入适当稀释的一抗(cyclinD1，P21andP27(1:500，Abcam，UK)，Fas，caspase-3andcaspase-9，Bcl-2andBax(1:1000，CellSignaling，USA)，andβ-actinantibody(1:8000，Beyotime，China))，室温下振荡lh，4℃冰箱过夜孵育。TBST洗2次以上，每次10min。加入以5％脱脂奶粉的TBST溶液按1:1000稀释HRP标记的羊抗兔二抗，室温条件下摇床振荡孵育2h。取出二抗，37℃孵化1小时。再在脱色摇床上摇动，用TBST漂洗3次以上，每次5min。11)化学发光、图像采集：配制ECLPlus试剂(Beyotime，中国)发光反应液，振荡使之混合均匀。将膜缓冲液中取出，贴角用滤纸貼角吸干残余缓冲液，固定在片盒中，滴加发光反应液，chemiDocXRS+成像系统(美国，BD)进行图像采集。1.4统计学分析所有测量均重复进行了三次。结果表示为平均值±标准偏差(SD)。组间差异分析了单向方差分析(方差分析)与不同组Tukey’s的效果测试。P<0.05被认为是统计学意义。统计学处理均由第一作者完成，采用SPSS13.0进行统计学分析，组间均数比较采用t检验，样本间率比较采用x2检验，结果中定量数据用x±s表示，P＜0.05为有显著性差异。2结果2.1PMMA骨水泥内部及表面温度变化趋势骨水泥聚合后温度约在15～17min达峰值，PMMA内部温度最高在92.3±1.5℃；表面最高温度可达63.2±1.1℃。内部温度在50℃以上有540.2±59.1s，外部温度在50℃以上210.2±30.9s。2.2PMMA骨水泥对细胞细胞增殖能力的影响为了研究不同剂量PMMA骨水泥对1.5×106肿瘤细胞的关系，按上述方法将0.2～0.6ml骨水泥处理肿瘤细胞24小时后，分别置于倒置显微镜下观察肿瘤细胞生长状态正常存活的转移瘤细胞生长增殖旺盛分布密集，平行极性排列连接成片，细胞清晰，细胞呈多边形，胞体饱满，贴壁生长。随着注入PMMA剂量增大，活细胞数量逐渐减少，细胞间隔增宽，细胞变圆，胞体缩小，漂浮于培养液中。利用MTT测定PMMA对原代培养转移瘤的细胞生长的影响。结果表明，3天内伴随时间的延长，同一剂量的PMMA刺激浓度情况下抑制率明显增高，并且细胞生长明显比对照组缓慢(P<0.05)。图2。通过形态观察以及MTT测试，由此可见骨水泥浸出液对肿瘤细胞具有明显抑制增殖的作用。2.3PMMA对原代培养椎体转移瘤细胞凋亡的影响并采用AnnexinV-FITC/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡率。注入拉丝期PMMA0.2、0.3、0.4、0.5、0.6ml，其凋亡率分析的结果分别为拉丝期(5.12±1.01)％、(9.84±2.13)％、(23.04±4.72)％、(41.87±7.35)％、(94.18±11.27)％，各组间差别具有统计学意义(P<0.05)，结果表明肿瘤细胞的凋亡与骨水泥的注射量呈剂量依赖关系，可能的机理是随着剂量的增加，骨水泥聚合产生的热量时间更长，释放的单体量增高，诱导更多细胞凋亡，详见图3。为了研究PMMA骨水泥对椎体转移瘤细胞的凋亡作用，按上述方法将不同时期的PMMA骨水泥分别处理细胞24小时。采用AnnexinV-FITC/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡率，其冷却后PMMA组、拉丝期PMMA组、对照组的凋亡率分析的结果分别为(28.57±8.31)％、(41.87±7.35)％、(4.08±1.09)％，经PMMA处理的两组椎体转移瘤细胞的凋亡率比对照组均有显著增强(P＜0.05)，拉丝期PMMA组的凋亡率比冷却期PMMA组亦有明显升高(P＜0.05)。此两组骨水泥的虽都呈现凋亡率升高的表现，但凋亡类型却有所不同；拉丝期PMMA组更多的呈现为一种早期凋亡的形式(P<0.05)，而用冷却后PMMA刺激细胞后，细胞在24h后呈现的是晚期凋亡，(P<0.05)，见表2和图4。同时，冷却后PMMA组、拉丝期PMMA组、对照组的死亡率分别为(10.96±1.29)％、(12.53±1.98)％、(1.48±0.31)％，无论是在拉丝期的PMMA还是冷却后的PMMA均可使细胞的死亡率较对照组升高，(P<0.01)，而两组骨水泥之间并无明显差异(P>0.05)。表2.3各组细胞凋亡率的变化(％，x±s)与对照组比较，*：P<0.001；与对照组比较，#：P<0.01；与拉丝期比较，△：P>0.052.4PMMA应用对转移瘤细胞的细胞周期影响为了研究PMMA骨水泥对椎体转移瘤细胞的细胞周期作用，按上述方式将混合后不同时期的PMMA骨水泥作用于肿瘤细胞24h。通过流式细胞术发现转移性肿瘤细胞经PMMA的作用培养24小时后被阻滞在G0/G1细胞周期，G0/G1细胞百分比从未经处理的对照组(39.11±10.27)％上升到拉丝期骨水泥组的(78.15±9.72)％以及冷却期骨水泥组的(51.07±7.34)％，每组之间两两相比均有显著差异(P<0.05)，见图4。2.5总RNA提取的结果提取经PMMA处理后椎体转移瘤细胞总RNA，当吸光度A260/A280在1.8～2.0之间时说明总RNA纯度较高，基本已经去除了蛋白质和糖类等其他物质的污染。再经1％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳测试，28S与18S的吸光度的比值≈2，说明总RNA基本无降解，其完整性较好。2.6PMMA处理后脊柱转移瘤细胞的细胞凋亡相关mRNA表达因为caspase被称为细胞凋亡的关键执行者，通过real-timePCR检测了各组的caspase-3和caspase-9的表达。结果显示，在经过PMMA骨水泥处理后的脊柱转移瘤细胞中的caspase-3和caspase-9的mRNA表达都有所增加。而且caspase-3和caspase-9在拉丝期骨水泥组中都比冷却期骨水泥组的表达量更高(P<0.05)，见表3，图6。Bcl-2/bax聚合体是线粒体的功能的关键调节者，如果它们的比例不均衡则会通过依赖线粒体通路导致细胞凋亡的结果。在本研究中，通过PMMA骨水泥的刺激后，转移瘤细胞的Bcl-2/bax表达失衡。与对照组相比，Bcl-2表达量显著降低而Bax表达量明显增高(P<0.05)，见表4，图5。然而在拉丝期骨水泥组和冷却期骨水泥组之前却并无显著差异。此外，细胞凋亡的另一个关键调节者是Fas死亡受体系统，结果显示经过PMMA骨水泥刺激后的Fas的mRNA的表达量都显著升高(P<0.05)，并且Fas在拉丝期骨水泥组中的表达量与冷却骨水泥组相比增加更多。表3Real-timePCR检测脊柱转移瘤细胞中Caspase-3、Caspase-9和FasmRNA的表达量的变化GROUPCaspase-3Caspase-9Fas对照组1.00001.00001.0000拉丝期PMMA4.2790±0.0046*5.3739±0.0176*3.8968±0.2342冷却后PMMA2.1331±0.0336#:2.3695±0.1833#2.5976±0.1084与对照组比较，*:P<0.05；与对照组比较，#:P>0.05与拉丝期比较，△：P>0.05表4Real-timePCR检测脊柱转移瘤细胞中BAX和BCL-2mRNA的表达量的变化GROUPnBaxBcl-2对照组51.00001.0000拉丝期PMMA53.1939±0.0123*0.1156±0.1485*冷却后PMMA52.2587±0.0899#:0.4141±0.2564#:2.7PMMA处理后脊柱转移瘤细胞的细胞周期相关mRNA表达细胞周期进程是由周期素依赖性蛋白激酶(CDKs)所调控的，其可以被细胞周期素激活并被细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CDKIs)。在本研究中，评估了在不同阶段骨水泥处理后的脊柱转移瘤细胞的细胞周期蛋白的表达的cyclinD1，P21andP27。real-timePCR的结果显示经过PMMA刺激后阻滞了cyclinD1的表达并增加P21的表达，但是对P27的表达没有明显的改变。此外拉丝期骨水泥组与冷却骨水泥组相比，cyclinD1的表达降的更低而P21的表达增加的更高，见表5，图6。表5Real-timePCR检测脊柱转移瘤细胞中cyclinD1，P21和P27mRNA的表达量的变化GROUPcyclinD1P21P27对照组1.00001.00001.0000拉丝期PMMA0.3856±0.0850*2.1064±0.1773#0.9768±0.0664#冷却后PMMA0.7273±0.0358#:1.5926±0.0978#1.1131±0.0439#2.8PMMA处理后脊柱转移瘤细胞后凋亡与周期相关蛋白表达用westernblot方法进一步测PMMA处理肿瘤细胞后在蛋白水平上细胞周期相关基因cyclinD1，P21andP27；以及凋亡基因caspase-3、caspase-9和Fas表达情况。免疫印迹结果显示蛋白表达水平与mRNA表达水平一致，在经过PMMA骨水泥处理后的脊柱转移瘤细胞中的caspase-3、caspase-9和Fas的蛋白水平都有所增加。而且caspase-3、caspase-9和Fas在拉丝期骨水泥组中都比冷却期骨水泥组的表达量更高(P<0.05)；通过PMMA骨水泥的刺激后，转移瘤细胞的Bcl-2/bax表达失衡。与对照组相比，Bcl-2表达量显著降低而Bax表达量明显增高，图7A。经过PMMA刺激后，cyclinD1的蛋白水平降低而P21的蛋白水平增高，但是对P27的表达没有明显的改变，图7B。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3