一株来源于蚕沙的菌株BacillusaltitudinisSEM‑1及其应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株来源于蚕沙的菌株Bacillus altitudinis SEM-1及其应用。

背景技术：

土传病害是以土壤为媒介进行传播的植物病害的统称，是指生活在土壤当中的病原体在条件适宜时从根部或茎部侵害作物而引起的病害，常见的土产病害有：辣椒、茄子、黄瓜根腐病、立枯病、猝倒病、疫病、黄枯病，番茄、辣椒的青枯病，棉花的立枯病、线虫病等、红萎病、黄萎病，小麦全蚀病，大白菜软腐病，油菜和莴苣的菌核病等。

土传病害主要危害作物的根部和茎部。作物生长前期一旦发生病害，幼苗根腐烂或者茎腐烂，幼苗很快就会死亡；作物生长后期发生病害，造成的减产根据严重程度不同可达20％-60％，甚至绝收。土传病害发生后，比较难防治，病菌藏在土壤中越冬，很难被杀死，来年继续侵害作物，如此循环，病害越来越严重。

土传病害的防控途径主要有作物轮作、抗病品种、药物防治及生物防治等。作物轮作能够一定程度控制多种土传病害，但由于大部分病原菌在土壤中能生存很长一段时间，一旦病害发生，会导致轮作的有效性受到限制；抗病品种针对性强，整体防效不高；而且长期使用化学药剂会破坏生态平衡，造成次要病害猖獗、药剂残留、环境污染等问题。

生物防治主要是通过拮抗微生物土壤定殖，与病原菌竞争营养及生存空间、分泌抑菌物质及蛋白酶、激发植物体的抗性免疫机制、促进植物生长、强化抗逆性等综合作用形成对土传病害的预防与防治效果。近年来人们对于食物安全的重视和环保意识的增强,对农业的可持续发展提出了更高的要求，生物防治因其低成本、高效率、环境友好和无药物残留等特点已成为当前国内外植物病害防治的研究热点。

蚕沙是养蚕生产中的主要有机废弃物，不但含有丰富的营养物质，还含有丰富的微生物菌群，例如固氮、解磷和解钾及其病原拮抗的微生物菌群。因此如何分离筛选并有效利用其中的微生物资源，成为本研究的关注重点。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于提供一株来源于蚕沙的菌株Bacillus altitudinis SEM-1。

本发明的另一目的在于提供上述菌株Bacillus altitudinis SEM-1在制备土壤微生物菌剂或生物有机肥中的应用。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一株来源于蚕沙的菌株Bacillus altitudinis(高地芽孢杆菌)SEM-1，已于2016年5月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO.60038。

上述的高地芽孢杆菌是从蚕沙中分离纯化后得到，其性状如下：

菌落形态：本发明的高地芽孢杆菌悬液经涂板与NA培养基后，30℃生化培养箱中培养2天，观察其菌落形态特征，结果如图1所示。由图1可见，本发明的芽孢杆菌菌落乳白色，圆形，表面光滑，半透明，边缘整齐。

将本发明的高地芽孢杆菌按1％比例接种于NB培养基，30℃摇床中培养18h后，取悬液，点样到载玻片、烤片，经革兰氏染色，油镜观察菌株的形态特征，结果如图2所示。由图2可见，本发明的高地芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，芽孢中生，为椭圆形，菌体为杆状。

本发明芽孢杆菌的16srDNA鉴定：菌株悬液为模板，16srDNA通用引物27F/1492R，PCR反应体系为50μL，反应条件为：94℃预变性5min；94℃30s，56℃30s，72℃2min，循环30次；72℃延伸10min。PCR产物纯化后送样测序。

本发明高地芽孢杆菌SEM-1的16srDNA的部分可变区序列测序结果通过NCBI/blast比对后发现与高地芽孢杆菌株HN-8同源性最高，达99％以上，为高地芽孢杆菌。

上述菌株Bacillus altitudinis SEM-1在制备土壤微生物菌剂或生物有机肥中的应用。

上述菌株Bacillus altitudinis SEM-1用于制备高地芽孢杆菌原粉，包括如下制备步骤：

(1)活化菌种

活化高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)SEM-1菌株，从斜面中挑取菌落并在NA固体培养基划线培养，培养条件32℃，待SEM-1在NA固体培养基上生长18-24h后，挑取单菌落，用于一级种子液的制备；

(2)一级种子液的制备

选取NA固体培养基上的单菌落，接种于一级种子摇瓶中，摇瓶体积为250mL，一级种子NB液态培养基(121℃下，灭菌20min)的装液量100ml，将一级种子摇瓶在32℃、200r/min下培养12-14h，得到一级种子液；

(3)二级种子液的制备

种子罐中的培养基仍为NB液体培养基，121℃下，灭菌20min，将一级种子液接入种子罐中，接种量为0.5～1％(V/V)；培养条件为：通气比1:1，搅拌转速为250～400r/min，培养温度32℃，罐压0.05MPa，培养时间为10小时，培养结束时得到二级种子液，其活菌含量为1～3×10⁷cfu/mL，OD值在0.7～0.8左右，此时菌种活力强；

(4)高地芽孢杆菌SEM-1的菌液发酵

发酵培养基配方(重量百分比)：玉米淀粉2-3％g；豆粕粉1.5-2.5％；酵母膏0.5～1％，CaCO₃ 0.3-0.6％，K₂HPO₄ 0.02-0.03％，MgSO₄·7H₂O 0.015-0.025％，MnSO₄·H₂O 0.015-0.025％，(NH₄)₂SO₄ 0.05-0.15％；pH6.5-7.5，121℃灭菌30min；

将高地芽孢杆菌SEM-1的二级种子液，按照接种量为0.5～1％(V/V)接入发酵罐中，培养条件为：接种量为0.5-1％(V/V)，培养条件为：通气比1:(1-1.5)，搅拌转速为200-400r/min，培养温度32℃，罐压0.05MPa，保持5％以上的溶氧条件，培养时间为48h左右；下罐时间以取样镜检芽孢90％以上释放为准，成熟发酵液中高地芽孢杆菌SEM-1活芽孢含量为50～80×10⁸cfu/mL，得到发酵成熟菌剂；

(5)高地芽孢杆菌原粉的制备

步骤(4)所得的发酵成熟菌剂(活芽孢含量为50～80×10⁸cfu/mL)经碟片离心机或微滤设备浓缩后，加入轻质碳酸钙，浓缩成熟发酵菌剂与轻质碳酸钙的重量比为100:3，得到液固混合物，将该液固混合物搅拌30min后，利用输料泵将液固混合物送入离心式喷雾塔中干燥，得到高地芽孢杆菌SEM-1原粉。

本发明的高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)SEM-1具有如下优点及有益效果：

(1)本发明的高地芽孢杆菌SEM-1菌株来源于蚕沙，为蚕沙堆肥过程中的自生菌，与蚕沙有机肥的配合性好；

(2)本发明的高地芽孢杆菌SEM-1菌株耐高温性好，在60度高温下培养和运输均可以存活，在土壤微生物菌剂制备方面具有相当的优势；

(3)本发明的高地芽孢杆菌SEM-1菌株耐盐碱性好，可以在10％的NaCl浓度及PH5-10的范围内生长良好，在盐碱地改良方面具有相当的优势；

(4)本发明的高地芽孢杆菌SEM-1菌株可以高效抑制镰刀菌(Fusarium)、青枯菌(Ralstonia dolaanacearum)等土壤中作物有害病原微生物的生长，起到防治作物病害和提高作物抗病虫害能力的作用，从而提高作物的产量和品质；

(5)本发明的高地芽孢杆菌SEM-1菌株可以高效分解土壤中矿物质钾，制备成土壤微生物菌剂或添加到蚕沙有机肥后，具有显著的解钾效果，提高土壤肥力，该菌株可用于制备单一微生物菌剂、复合微生物菌剂、生物有机肥等。

附图说明

图1为本发明高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)SEM-1的菌落形态特征图；

图2为本发明高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)SEM-1的菌株形态特征图；

图3为本发明实施例所得高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)SEM-1对四种镰刀菌的拮抗实验效果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)SEM-1菌株的分离及鉴定

(1)样品稀释：从发酵腐熟的蚕沙堆肥中取样，称取5g溶解到装有45ml无菌水的三角瓶中，150rp振荡器振荡成均匀的10^-1稀释液，然后用1ml移液枪吸取该稀释液1ml至装有9ml无菌水的试管中，充分摇匀，即制成10^-2的样品稀释液，并依次稀释至10^-6；

(2)培养基准备：

解钾筛选培养基：葡萄糖10.0g，NH₄NO₃3.0g，NaH₂PO₄1.0g，FeSO₄·7H₂O1.0g，MgSO₄·7H₂O 1.0g，钾长石1.5g，蒸馏水1000ml，琼脂20.0g，pH 7.0～7.4，灭菌20min；

马铃薯土豆培养基：马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂18克、蒸馏水1000毫升、pH 6.8～7.2；

NA培养基：蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl5g，琼脂粉20g，蒸馏水1000ml，PH7.0；121℃灭菌20min，于45℃-55℃倾倒至无菌的培养皿；

(3)菌种分离、纯化与筛选：分别吸取不同稀释倍数的稀释液0.1ml，均匀涂布于冷却好的解钾培养基，放置30℃培养箱中倒置培养5天，观察并挑选长势良好、解钾圈显著的菌落于NA培养基培养；将所挑选出菌于NA培养基多次继代培养后，通过平板对峙法，检测与镰刀菌、青枯菌的拮抗效果，取拮抗效果显著的一个菌株，并命名菌株SEM-1；

(5)菌株的鉴定

A、形态鉴定：高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)SEM-1菌株的菌落形态为乳白色，圆形，表面光滑，半不透明，边缘整齐。革兰氏染色结果表明高地芽孢杆菌SEM-1为革兰氏阳性菌，芽饱椭圆形、中生，菌体为杆状。

B、分子生物学鉴定：SEM-1的16S rDNA系列分析，具体序列见序列表。

(6)菌株SEM-1鉴定结论

根据菌株SEM-1的形态学及16rDNA基因系列分析，鉴定SEM-1为高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)，已于2016年5月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO.60038。保藏地址：中国广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮政编码为510075。

本实施例所得高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)SEM-1解钾效果测定：

采用原子吸收分光光度法在766nm测定发酵液上清中有效钾含量。与对照菌(解钾菌，购自广州微元生物技术有限公司)相比，本发明的高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)SEM-1解钾效果显著高于解钾对照菌。

本实施例所得高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)SEM-1拮抗镰刀菌效果测定：

采用平板对峙法，在平板中央分别接种6种镰刀菌(禾谷镰刀菌，Fusarium sambucinum；双孢镰刀菌，Fusarium catenulatum；尖孢镰刀菌，Fusarium oxysporum；层出镰刀菌，Fusarium proliferatum；腐皮镰刀菌，Fusarium equiseti；腐皮镰刀菌，Fusarium equiseti)，在距其约1-1.5cm处放置滤纸片(去除表面活性剂，肥皂水浸泡，冲洗干净，烘干，灭菌)，点5-6ul高地芽孢杆菌SEM-1的发酵液，待完全吸收后，倒置培养2-3天，观察，结果表明：高地芽孢杆菌SEM-1对所测六种镰刀菌(Fusarium)有非常显著的拮抗效果。图3列出了SEM-1对其中四种镰刀菌的拮抗实验效果图。

实施例2

高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)SEM-1菌剂原粉的制备

(1)活化菌种

活化高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)SEM-1菌株,从斜面中挑取菌落并在NA固体培养基划线培养，培养条件32℃，待SEM-1在NA固体培养基上生长18-24h后，挑取单菌落，用于一级种子液的制备；

(2)一级种子液的制备

选取NA固体培养基上的单菌落，接种于一级种子摇瓶中，摇瓶体积为250mL，一级种子NB液态培养基(121℃下，灭菌20min)的装液量100ml，将一级种子摇瓶在32℃、200r/min下培养12h，得到一级种子液；

(3)二级种子液的制备

种子罐中的培养基仍为NB液体培养基，121℃下，灭菌20min，将一级种子液接入种子罐中，接种量为0.5～1％(V/V)；培养条件为：通气比1:1，搅拌转速为250～400r/min，培养温度32℃，罐压0.05MPa，培养时间为10小时，培养结束时得到二级种子液，其活菌含量为1～3×10⁷cfu/mL，OD值在0.7～0.8左右，此时菌种活力强；

(4)高地芽孢杆菌SEM-1的菌液发酵

发酵培养基配方(重量百分比)：玉米淀粉2-3％g；豆粕粉1.5-2.5％；酵母膏0.5～1％，CaCO₃ 0.3-0.6％，K₂HPO₄ 0.02-0.03％，MgSO₄·7H₂O 0.015-0.025％，MnSO₄·H₂O 0.015-0.025％，(NH₄)₂SO₄ 0.05-0.15％；pH6.5-7.5，121℃灭菌30min；

将高地芽孢杆菌SEM-1的二级种子液，按照接种量为0.5～1％(V/V)接入发酵罐中，培养条件为：接种量为0.5-1％(V/V)，培养条件为：通气比1:(1-1.5)，搅拌转速为200-400r/min，培养温度32℃，罐压0.05MPa，保持5％以上的溶氧条件，培养时间为48h左右；下罐时间以取样镜检芽孢90％以上释放为准，成熟发酵液中高地芽孢杆菌SEM-1活芽孢含量为50～80×10⁸cfu/mL，得到发酵成熟菌剂；

(5)高地芽孢杆菌原粉的制备

步骤(4)所得的发酵成熟菌剂(活芽孢含量为50～80×10⁸cfu/mL)经碟片离心机或微滤设备浓缩后，加入轻质碳酸钙，浓缩成熟发酵菌剂与轻质碳酸钙的重量比为100:3，得到液固混合物，将该液固混合物搅拌30min后，利用输料泵将液固混合物送入离心式喷雾塔中干燥，得到高地芽孢杆菌SEM-1原粉。

所得高地芽孢杆菌SEM-1原粉中活菌浓度为5～8亿/克干粉。

实施例3

一种添加高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)SEM-1蚕沙微生物菌肥的制备。

该生物有机肥由蚕沙或堆肥腐熟化处理后的蚕沙、高地芽孢杆菌SEM-1菌剂和贝壳粉混合制备而成。

参照实施例2的方法得到高地芽孢杆菌SEM-1的干粉，其中活菌浓度在5-8亿/克干粉，制备成微生物菌剂。将菌剂按比例与堆肥腐熟后的蚕沙和贝壳粉混匀，获得蚕沙微生物菌肥。所述蚕沙或堆肥腐熟化处理后的蚕沙、微生物菌剂和贝壳粉的质量百分含量分别为70％～90％、1％～10％和10％～30％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。