固—液—液三步生物合成紫杉醇的方法及其专用的培养基与流程

文档序号：12108975阅读：981来源：国知局

本发明涉及生物制药领域，尤其是一种培养红豆杉细胞、生产紫杉醇的新方法，该方法可强化红豆杉细胞在紫杉醇合成前的细胞生理生化状态和细胞代谢能力，继而提高紫杉醇的产量。

背景技术：

紫杉醇(Taxol/pacilitaxel)是红豆杉科红豆杉属(Taxus sp.)植物的树皮、针叶等组织中含有的二萜类化合物，具有独特、高效、低毒的抗癌作用，被称为过去几十年中出现的最好的抗癌药之一。因巨大的市场需求与其原料来源的匮乏，使得运用植物细胞培养技术生物合成药用成份紫杉醇的产业化生产研究，成为近些年来新药研究的重要热点。自1971年，国际上首次出现从红豆杉树皮中分离出紫杉醇至今，由于其天然含量极低，现今随着市场对紫杉醇年需求量的增长，紫杉醇的原料保障就成为该药能否成功走向市场的关键所在。从长远来看，运用植物组织细胞培养技术研究开发紫杉醇一直是现代高新技术医药领域研究的关键问题。

1991年，美国批准采用细胞培养法生产紫杉醇及其类似物的专利(United States Patent 5.019.504.)，但因红豆杉细胞增殖缓慢，紫杉醇含量低等问题，导致很难实现紫杉醇的产业化生产。以往的红豆杉细胞培养方法主要为前期采取在固体或液体培养基中培养愈伤组织，促进细胞增殖，后期在液体培养基中进行悬浮培养合成紫杉醇。但普遍存在合成能力不稳定的问题。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是，提供一种提高紫杉醇产量的固—液—液三步生物合成紫杉醇的方法及其专用的培养基。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于固—液—液三步生物合成紫杉醇的专用的培养基，包括用于液体培养的调节培养基和合成培养基；

调节培养基的配方为：KNO₃ 1000-1500mg/L、CaCl₂·2H₂O 75-150mg/L、(NH₄)₂SO₄30-70mg/L、NaH₂PO₄·H₂O 50-150mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.025-0.1mg/L、MgSO₄·7H₂O 250mg/L、KI 0.75mg/L、H₃BO₃ 3.0mg/L、MnSO₄·4H₂O 10mg/L、ZnSO₄·7H₂O 2.0mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L、CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L、Na₂-EDTA 37.3mg/L、FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L、肌醇100mg/L、烟酸1.0mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L、盐酸硫铵10mg/L、6BA 0.1-0.5mg、NAA 2.0-4.0mg、苹果汁50-200ml/L、乙酸钠5-10mg/L、苯丙氨酸10-20mg/L、烯效唑5-10mg/L、氯化氯代胆碱0.5-2.0mg/L、水杨酸0.1-1.0mg/L、蔗糖20-30g/L，用水定容至1升；

合成培养基的配方为：KNO₃ 800-1250mg/L、CaCl₂·2H₂O 50-100mg/L、(NH₄)₂SO₄35-150mg/L、NaH₂PO₄·H₂O 75-100mg/L、KI 0.75mg/L、H₃BO₃ 3.0mg/L、MnSO₄·4H₂O 10mg/L、ZnSO₄·7H₂O 2.0mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L、CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L、Na₂-EDTA 37.3mg/L、FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L、肌醇100mg/L、烟酸1.0mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L、盐酸硫铵10mg/L、6BA 0.5-1.0mg/L、NAA 1.0-2.0mg/L、过氧化氢10-50μl/L、柠檬酸铵5mg-30mg/L、甲基茉莉酮酸100-200μmol/L、蔗糖40-60g/L,用水定容至1升。

优选，所述调节培养基的配方为：KNO₃ 1200mg/L、CaCl₂·2H₂O 100mg/L、(NH₄)₂SO₄50mg/L、NaH₂PO₄·H₂O 150mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.05mg/L、MgSO₄·7H₂O 250mg/L、KI 0.75mg/L、H₃BO₃ 3.0mg/L、MnSO₄·4H₂O 10mg/L、ZnSO₄·7H₂O 2.0mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L、CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L、Na₂-EDTA 37.3mg/L、FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L、肌醇100mg/L、烟酸1.0mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L、盐酸硫铵10mg/L、苹果汁100ml/L、乙酸钠8mg/L、苯丙氨酸15mg/L、烯效唑5mg/L、氯化氯代胆碱1.0mg/L、水杨酸0.5mg/L、6BA 0.5mg/L、NAA 3.0mg/L、蔗糖30g/L,用水定容至1升；

优选，所述合成培养基的配方为：KNO₃ 1250mg/L,CaCl₂·2H₂O 75mg/L、(NH₄)₂SO₄75mg/L、NaH₂PO₄·H₂O 85mg/L、KI 0.75mg/L、H₃BO₃ 3.0mg/L、MnSO₄·4H₂O 10mg/L、ZnSO₄·7H₂O 2.0mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L、CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L、Na₂-EDTA 37.3mg/L、FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L、肌醇100mg/L、烟酸1.0mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L、盐酸硫铵10mg/L、6BA 0.5mg/L、NAA 2.0mg/L、过氧化氢10μl/L、柠檬酸铵20mg/L、甲基茉莉酮酸150μumol/L、蔗糖50g/L,用水定容至1升。

所述水为蒸馏水或去离子水。

一种固—液—液三步生物合成紫杉醇的方法，包括以下步骤：

(1)固体培养基培养：从红豆杉植物的枝条、叶片中诱导出愈伤组织，将愈伤组织置于含有琼脂或其他支撑物的固体生长培养基上扩增继代，即用固体培养方式使细胞增殖，每20-25天为一周期；

(2)调节培养：将在固体培养基上扩增的红豆杉细胞转入装有上述的调节培养基的反应器，培养2-4天；

(3)紫杉醇的生物合成：将步骤(2)经调节培养的红豆杉细胞连同培养液通过无菌管道输入含有上述的合成培养基的反应器中，培养3-5天，使细胞内的紫杉醇含量达到0.3％以上。

具体地说，包括以下步骤：

(1)固体培养基培养：以红豆杉属植物的枝、叶作为外植体，接种于附加6BA 0.5-1.0mg/L、NAA 1.0-2.0mg/L、蔗糖20-25g/L、琼脂6-8g/L的B5培养基上，诱导出愈伤组织后，将其转接到附加6BA 0.2-1.0mg/L、NAA 0.5-2.0mg/L、蔗糖20-25g/L、琼脂6-8g/L的B5培养基中继代培养，每20-25天为一周期，生物量扩增四倍，将固体培养细胞的1/4作为种子细胞继代培养，另3/4以无菌操作方式转入下述步骤(2)的生物反应器进行调节培养；

(2)调节培养：生物反应器中装有上述的调节培养基，反应器温度20-25℃，pH值4.5-6.5，搅拌转速30-80转/分，培养时间2-4天；

(3)紫杉醇的生物合成：将步骤(2)经调节培养的红豆杉细胞连同培养液通过无菌管道输入含有上述的合成培养基的反应器中，调节pH值使之在4.5-6.2，调节温度使之在20-30℃，搅拌转速30-80转/分，培养3-5天合成紫杉醇。

采用上述的固—液—液三步法培养红豆杉细胞生产紫杉醇。

本发明的有益效果是：提供一种提高红豆杉细胞代谢能力，从而进一步增加紫杉醇含量的方法，该方法能明显提高红豆杉细胞中紫杉醇的前体物质，同时提高红豆杉细胞代谢紫杉醇相关酶的活性，更利于有效合成紫杉醇。本发明根据培养红豆杉细胞生产紫杉醇的机理和代谢途径，首创了采用固液液三步法细胞培养方式，同时首创了三步法中所需的2种专用培养基。培养基中通过加入诱导子及前体物质，强化红豆杉细胞的生理生化状态和代谢能力，促进红豆杉细胞合成紫杉醇，提高目标次生代谢产物紫杉醇的产量。

附图说明

图1是本发明实施例1得到的紫杉醇液相色谱图。

图2是本发明实施例2得到的紫杉醇液相色谱图。

图3是本发明实施例3得到的紫杉醇液相色谱图。

图4是本发明实施例4得到的紫杉醇液相色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

本发明的用于固—液—液三步生物合成紫杉醇的专用的培养基，包括用于液体培养的调节培养基和合成培养基；

所述水为蒸馏水或去离子水。

一种固—液—液三步生物合成紫杉醇的方法，包括以下步骤：

(2)调节培养：将在固体培养基上扩增的红豆杉细胞转入装有上述的调节培养基的反应器，培养2-4天；

具体地说，包括以下步骤：

(2)调节培养：生物反应器中装有上述的调节培养基，反应器温度20-25℃，pH值4.5-6.5，搅拌转速30-80转/分，培养时间2-4天；

采用上述的固—液—液三步法培养红豆杉细胞生产紫杉醇。

目前利用细胞培养技术生产紫杉醇，存在着紫杉醇合成不稳定，在摇床培养中，每批次的紫杉醇含量差异很大，即使同批次各摇瓶之间的含量差异也很大，在反应器中每批次之间也有较大差异。

造成这种现象的因素之一，是细胞合成紫杉醇之前的生理生化状态不同，紫杉醇代谢前体及相应酶活性不高，因此有必要在细胞合成紫杉醇之前先行调节细胞的生理生化状态。

简单地说，本发明方法包括如下步骤:

步骤1)将诱导、驯化、筛选的红豆杉细胞接种于固体培养基增加生物量。

步骤2)将红豆杉细胞(留出种子细胞)转入反应器进行调节培养。

步骤3)将已调节培养的红豆杉细胞转入另一反应器合成紫杉醇。

本发明首次提出采用红豆杉细胞进行固-液-液三步法培养生产紫杉醇的方法。

本发明所利用的细胞株是从红豆杉的愈伤组织筛选建立起来的，诱导的愈伤组织经10-20代继代培养。

本发明采用的培养方法是三步法，即第一步细胞株是在固体培养基中培养一个周期(20-25天)以积累生物量，第二步转入生物反应器以液体培养方式，在专用调节培养基中调节红豆杉细胞生理生化状态，第三步再转入另一生物反应器，再以液体培养方式在专用合成培养基中合成紫杉醇。

本发明采用的固-液-液三步法细胞培养生产紫杉醇，其具体方法是：将红豆杉愈伤组织接种于固体培养基上，该培养基为通用的B5培养基(KNO₃ 2500mg/L、MgSO₄·7H₂O 250mg/L、CaCl₂·2H₂O 150mg/L、(NH₄)₂SO₄ 134mg/L、NaH₂PO₄.H₂O 150mg/L、KI 0.75mg/L、H₃BO₃ 3.0mg/L、MnSO₄·4H₂O 10mg/L、ZnSO₄·7H₂O 2.0mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L、CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L、Na₂-EDTA 37.3mg/L、FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L肌醇100mg/L、烟酸1.0mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L、盐酸硫铵10mg/L)，附加激素6BA 0.5-1.0mg/L，NAA 1.0-2.0mg/L，琼脂6-8g/L，蔗糖20-25g/L,生长周期为20-25天，生物量增加约4倍，转入装有调节培养基的生物反应器，该培养基为改良的B5基本培养基，其成分为：KNO₃ 1000-1500mg/L,CaCl₂·2H₂O 75-150mg/L,(NH₄)₂SO₄ 30-70mg/L,NaH₂PO₄·H₂O 50-150mg/L,CuSO₄·5H₂O 0.025-0.1mg/L，其他成分用量MgSO₄·7H₂O 250mg/L、KI 0.75mg/L、H₃BO₃ 3.0mg/L、MnSO₄·4H₂O 10mg/L、ZnSO₄·7H₂O 2.0mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L、CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L、Na₂-EDTA 37.3mg/L、FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L、肌醇100mg/L、烟酸1.0mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L、盐酸硫铵10mg/L，另附加苹果汁50-200ml/L,乙酸钠5-10mg/L,苯丙氨酸10-20mg/L,烯效唑5-10mg/L,氯化氯代胆碱0.5-2.0mg/L,水杨酸0.1-1.0mg/L,蔗糖20-30g/L。并附加6BA 0.1-0.5mg/L,NAA 2.0-4.0mg/L,培养2-4天后，将细胞连同培养液(作为条件培养基)通过无菌管道输入到装有含有合成因子培养液的另一反应器合成紫杉醇。合成培养基为KNO₃800-1250mg/L、CaCl₂·2H₂O 50-100mg/L、(NH₄)₂SO₄ 35-150mg/L、NaH₂PO₄·H₂O75-100mg/L，其他成分KI 0.75mg/L、H₃BO₃ 3.0mg/L、MnSO₄·4H₂O 10mg/L、ZnSO₄·7H₂O 2.0mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L、CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L、Na₂-EDTA 37.3mg/L、FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L、肌醇100mg/L、烟酸1.0mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L、盐酸硫铵10mg/L，另附加6BA 0.5-1.0mg/L,NAA 1.0-2.0mg/L,过氧化氢10-50ul/L,柠檬酸铵5-30mg/L,甲基茉莉酮酸100-200uMOL/L，蔗糖40-60g/L，经3-5天培养，即可合成紫杉醇。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1

采集东北红豆杉枝叶，流水冲洗，在超净台内切成0.5cm左右的段、片，70-75％酒精浸泡30s,再用5％次氯酸钠溶液消毒15分钟,无菌水冲洗3-5遍，接入含有6BA 0.5mg/L,NAA 1.0mg/L,蔗糖25g/L,琼脂7g/L的B5培养基(B5培养基KNO₃ 2500mg/L、MgSO₄·7H₂O 250mg/L、CaCl₂·2H₂O 150mg/L、(NH₄)₂SO₄ 134mg/L、NaH₂PO₄.H₂O 150mg/L、KI 0.75mg/L、H₃BO₃ 3.0mg/L、MnSO₄·4H₂O 10mg/L、ZnSO₄·7H₂O 2.0mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L、CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L、Na₂-EDTA 37.3mg/L、FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L、肌醇100mg/L、烟酸1.0mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L、盐酸硫铵10mg/L，下同)中，pH值5.8，在12-35天即可陆续诱导出愈伤组织，经驯化、筛选作为种子细胞。

将上述种子细胞接种于固体培养基中，该培养基为B5基本培养基(KNO₃ 2500mg/L、MgSO₄·7H₂O 250mg/L、CaCl₂·2H₂O 150mg/L、(NH₄)₂SO₄ 134mg/L、NaH₂PO₄.H₂O 150mg/L、KI 0.75mg/L、H₃BO₃ 3.0mg/L、MnSO₄·4H₂O 10mg/L、ZnSO₄·7H₂O 2.0mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L、CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L、Na₂-EDTA 37.3mg/L、FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L肌醇100mg/L、烟酸1.0mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L、盐酸硫铵10mg/L)附加琼脂8g/L，蔗糖25g/L,6BA 0.5mg/L,NAA 2.0mg/L,温度25℃，相对环境湿度：50％-75％，培养21天，生物量扩增至四倍左右。

将上述扩增至四倍的愈伤组织，将其中1/4用于种子细胞，接种于固体培养基上，继代扩增，3/4细胞转接入30L细胞反应器，接种量25％(m/v)。反应器内装有15L调节培养基，其成分为：KNO₃ 1500mg/L,CaCl₂·2H₂O 150mg/L,(NH₄)₂SO₄ 70mg/L,NaH₂PO₄·H₂O 150mg/L,CuSO₄·5H₂O 0.1mg/L，其他成分MgSO₄·7H₂O 250mg/L、KI 0.75mg/L、H₃BO₃3.0mg/L、MnSO₄·4H₂O 10mg/L、ZnSO₄·7H₂O 2.0mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L、CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L、Na₂-EDTA37.3mg/L、FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L、肌醇100mg/L、烟酸1.0mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L、盐酸硫铵10mg/L，另附加苹果汁50mg/L,乙酸钠10mg/L,苯丙氨酸20mg/L,烯效唑10mg/L,氯化氯代胆碱0.5mg/L,水杨酸1.0mg/L,蔗糖30g/L。并附加6BA 0.2mg/L,NAA 1.0mg/L,搅拌速度80转/分，通气量0.4v/vm,温度25℃，pH值5.5-6.0，在此反应器中培养3天。将上述在反应器液体培养基中培养3天的细胞连同培养液(作为条件培养基)通过无菌管道输入到100L反应器中，液体培养基体积为50L，培养基成分为KNO₃1250mg/L,CaCl₂·2H₂O 100mg/L,(NH₄)₂SO₄ 150mg/L,NaH₂PO₄·H₂O 100mg/L，其他成分KI 0.75mg/L、H₃BO₃ 3.0mg/L、MnSO₄·4H₂O 10mg/L、ZnSO₄·7H₂O 2.0mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L、CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L、Na₂-EDTA 37.3mg/L、FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L、肌醇100mg/L、烟酸1.0mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L、盐酸硫铵10mg/L，另附加6BA 0.5mg/L,NAA 2.0mg/L,过氧化氢10μL/L,柠檬酸铵20mg/L,甲基茉莉酮酸100μmol/L，蔗糖50g/L。温度调节在20-25℃之间上下波动，pH值调节在4.5-6.2之间上下波动，搅拌转速60转/分，通气量0.2v/vm,此条件下培养4天，可收获紫杉醇含量＞0.3％(干品)的细胞(色谱图见图1)。实施例1液相色谱检测结果，保留时间37.114min,与紫杉醇对照品一致。经计算，含量为0.34％。

实施例2

采集曼地亚红豆杉枝叶，流水冲洗，在超净台内切成0.5cm左右的段、片，70-75％酒精浸泡30s,再用5％次氯酸钠溶液消毒15分钟，无菌水冲洗3-5遍，接入B5培养基(同上)中，该培养基中含有6BA 0.5mg/L,NAA 1.0mg/L，琼脂7g/L，蔗糖25g/L,PH值5.8，在12-35天即可陆续诱导出愈伤组织，经驯化，筛选为种子细胞。将上述种子细胞接种于固体培养基中，该培养基为B5基本培养基附加琼脂8g/L，蔗糖25g/L,6BA 0.5mg/L,NAA 2.0mg/L,温度25℃，相对环境湿度50％-75％，培养21天，生物量扩增至四倍左右。

将上述扩增至4倍的愈伤组织，其中1/4作为种子细胞接种于固体培养基上继续继代培养，其余3/4愈伤组织转接入50L细胞反应器中，接种量40％，反应器内各装有25L调节培养基，其成分为：KNO₃ 1200mg/L、CaCl₂·2H₂O 100mg/L、(NH₄)₂SO₄ 50mg/L,NaH₂PO₄·H₂O 150mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.05mg/L、MgSO₄·7H₂O 250mg/L、KI 0.75mg/L、H₃BO₃ 3.0mg/L、MnSO₄·4H₂O 10mg/L、ZnSO₄·7H₂O 2.0mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L、CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L、Na₂-EDTA 37.3mg/L、FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L肌醇100mg/L、烟酸1.0mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L、盐酸硫铵10mg/L、6BA 0.5mg/L,NAA 3.0mg/L,苹果汁100ml/L,乙酸钠8mg/L,苯丙氨酸15mg/L,烯效唑5mg/L,氯化氯代胆碱1.0mg/L,水杨酸0.5mg/L,蔗糖30g/L。搅拌转速60转/分，温度25℃，PH值5.5-6.0，通气量0.3v/vm，在50升反应器中培养4天后，通过无菌管道输入到100L反应器中(培养液作为条件培养基一同输入)，100L反应器中的合成培养基成分为：KNO₃ 1250mg/L、CaCl₂·2H₂O 75mg/L、(NH₄)₂SO₄75mg/L,NaH₂PO₄·H₂O 85mg/L、KI 0.75mg/L、H₃BO₃ 3.0mg/L、MnSO₄·4H₂O 10mg/L、ZnSO₄·7H₂O 2.0mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L、CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L、Na₂-EDTA 37.3mg/L、FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L、肌醇100mg/L、烟酸1.0mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L、盐酸硫铵10mg/L、6BA 0.5mg/L,NAA 2.0mg/L,过氧化氢10μL/L,柠檬酸铵20mg/L,甲基茉莉酮酸150μmol/L，蔗糖50g/L。装液量为400L，搅拌转速30转/分，通气量0.2v/vm，温度调节在20-29℃之间上下波动，PH值调节在4.5-6.2之间上下波动，在此条件下培养4天后收获细胞，其干品的紫杉醇含量＞0.3％(色谱图见图2)。实施例2液相色谱检测结果，保留时间37.069min,与紫杉醇对照品一致。经计算，含量为0.39％。

实施例3

采集云南红豆杉枝叶，流水冲洗，在超净台内切成0.5cm左右的段、片，70-75％酒精浸泡30s,再用5％次氯酸钠溶液消毒15分钟,无菌水冲洗3-5遍，接入含有6BA 0.5mg/L,NAA 1.0mg/L,琼脂7g/L，蔗糖25g/L的B5培养基中，pH值5.8，在12-35天即可陆续诱导出愈伤组织，经驯化，筛选作为种子细胞，

将上述种子细胞接种于固体培养基中，该培养基为B5基本培养基附加琼脂8g/L，蔗糖25g/L,6BA0.5mg/L,NAA 2.0mg/L,pH值5.8，温度25℃，相对环境湿度：50％-75％，培养21天，生物量扩增至四倍左右。

将上述扩增至四倍的愈伤组织，将其中1/4用于种子细胞，接种于固体培养基上，继代扩增，3/4细胞转接入30L细胞反应器，接种量25％(m/v)。反应器内装有15L调节培养基，其成分为：KNO₃ 1000mg/L,CaCl₂·2H₂O 75mg/L,(NH₄)₂SO₄ 70mg/L,NaH₂PO₄·H₂O 150mg/L,CuSO₄·5H₂O 0.05mg/L，其他成分MgSO₄·7H₂O 250mg/L、KI 0.75mg/L、H₃BO₃3.0mg/L、MnSO₄·4H₂O 10mg/L、ZnSO₄·7H₂O 2.0mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L、CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L、Na₂-EDTA 37.3mg/L、FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L、肌醇100mg/L、烟酸1.0mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L、盐酸硫铵10mg/L，另附加苹果汁80mg/L,乙酸钠mg/L,苯丙氨酸20mg/L,烯效唑10mg/L,氯化氯代胆碱0.5mg/L,水杨酸1.0mg/L,蔗糖30g/L。并附加6BA0.2mg/L,NAA1.0mg/L,搅拌速度80转/分，通气量0.4v/vm,温度25℃，pH值5.5-6.0，在此反应器中培养3天。

将上述在反应器液体培养基中培养3天的细胞连同培养液(作为条件培养基)通过无菌管道输入到100L反应器中，液体培养基体积为50L，培养基成分为KNO₃ 1250mg/L,CaCl₂·2H₂O 100mg/L,(NH₄)₂SO₄ 100mg/L,NaH₂PO₄·H₂O 100mg/L，其他成分KI 0.75mg/L、H₃BO₃ 3.0mg/L、MnSO₄·4H₂O 10mg/L、ZnSO₄·7H₂O 2.0mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L、CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L、Na₂-EDTA 37.3mg/L、FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L、肌醇100mg/L、烟酸1.0mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L、盐酸硫铵10mg/L，另附加6BA 0.5mg/L,NAA 2.0mg/L,过氧化氢12μL,柠檬酸铵15mg/L,甲基茉莉酮酸150μmol/L,蔗糖50g/L。温度调节在20-25℃之间上下波动，pH值调节在4.5-6.2之间上下波动，搅拌转速50转/分，通气量0.2v/vm,此条件下培养4天，可收获紫杉醇含量＞0.3％(干品)的细胞(色谱图见图3)实施例3液相色谱检测结果，保留时间37.113min,与紫杉醇对照品一致。经计算，含量为0.30％。

实施例4

采集南方红豆杉枝叶，流水冲洗，在超净台内切成0.5cm左右的段、片，70-75％酒精浸泡30s,再用5％次氯酸钠溶液消毒15分钟,无菌水冲洗3-5遍，接入含有6BA 0.2mg/L,NAA 1.0mg/L,琼脂7g/L，蔗糖25g/L的B5培养基中，pH值5.8，在12-35天即可陆续诱导出愈伤组织，经驯化、筛选作为种子细胞，

将上述扩增至四倍的愈伤组织，将其中1/4用于种子细胞，接种于固体培养基上，继代扩增，3/4细胞转接入30L细胞反应器，接种量25％(m/v)。反应器内装有15L调节培养基，其成分为：KNO₃ 1200mg/L,CaCl₂·2H₂O 100mg/L,(NH₄)₂SO₄ 50mg/L,NaH₂PO₄·H₂O 120mg/L,CuSO₄·5H₂O 0.075mg/L，其他成分MgSO₄·7H₂O 250mg/L、KI 0.75mg/L、H₃BO₃3.0mg/L、MnSO₄·4H₂O 10mg/L、ZnSO₄·7H₂O 2.0mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L、CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L、Na₂-EDTA 37.3mg/L、FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L肌醇100mg/L、烟酸1.0mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L、盐酸硫铵10mg/L，另附加苹果汁80mg/L,乙酸钠6mg/L,苯丙氨酸20mg/L,烯效唑10mg/L,氯化氯代胆碱0.5mg/L,水杨酸0.5mg/L,蔗糖20g/L。并附加6BA0.5mg/L,NAA1.0mg/L,搅拌速度70转/分，通气量0.4v/vm,温度25℃，pH值5.5-6.0，在此反应器中培养3天。

将上述在反应器液体培养基中培养4天的细胞连同培养液(作为条件培养基)通过无菌管道输入到50L反应器中，液体培养基体积为20L，培养基成分为KNO₃ 1100mg/L,CaCl₂·2H₂O 50mg/L,(NH₄)₂SO₄ 120mg/L,NaH₂PO₄·H₂O 75mg/L，其他成分KI 0.75mg/L、H₃BO₃ 3.0mg/L、MnSO₄·4H₂O 10mg/L、ZnSO₄·7H₂O 2.0mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L、CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L、Na₂-EDTA 37.3mg/L、FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L、肌醇100mg/L、烟酸1.0mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L、盐酸硫铵10mg/L，另附加6BA 0.5mg/L,NAA 2.0mg/L,过氧化氢10μL,柠檬酸铵20mg/L,甲基茉莉酮酸200μmol/L,蔗糖60g/L。温度调节在20-25℃之间上下波动，pH值调节在4.5-6.2之间上下波动，搅拌转速60转/分，通气量0.2v/vm,在此条件下培养5天，即可收获其干品紫杉醇含量＞0.3％的细胞(色谱图见图4)。实施例4液相色谱检测结果，保留时间37.310min,与紫杉醇对照品一致。经计算，含量为0.38％。

将收获的细胞在45℃烘干，研磨至80目以下，加入50倍量的甲醇，超声40分钟，投入提取罐，浸提4小时，反复3次，收集浸提液在45℃下减压浓缩，再用二氯甲烷等萃取3次，减压浓缩后甲醇溶解定容，上HPLC测定含量，样品成分与紫杉醇对照品保留时间一致。可再用层析、结晶或制备色谱纯化后，经质谱和核磁共振鉴定所得紫杉醇的分子结构正确。

以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。

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