一种荧光增强型快速检测亚硫酸氢根离子或亚硫酸根离子荧光分子探针的合成和应用的制作方法

本发明属于生物化学技术领域,具体涉及一种荧光增强型快速检测亚硫酸氢根离子或亚硫酸根离子荧光分子探针的合成和应用。

背景技术：

由于荧光探针的高选择性和灵敏性以及实时成像，荧光探针的使用作为优异的检测技术已经引起越来越多的关注，而且操作简单，灵敏度高，无毒和可视化的优点，荧光分子探针已成为在生命系统中可视化阴离子的强大工具，近年来在分析检测中应用非常广泛。

亚硫酸盐已广泛应用于食品和饮料加工作为防腐剂，因为它们具有抑制微生物生长和防止变色的能力。然而，过量的亚硫酸盐可以诱导腹泻，低血压，过敏反应和哮喘等疾病。此外，在现代工业过程中大量释放二氧化硫气体，这导致严重的环境问题；而且二氧化硫可溶于水生成亚硫酸盐和亚硫酸氢盐，对人体有毒害作用。因此，应为检测痕量亚硫酸氢根离子开发更多的分析方法。到目前为止，已经开发了许多分析方法，包括电化学，色谱，吸收和荧光光谱来定量检测亚硫酸氢根离子或者亚硫酸根离子。其中，荧光探针由于其高选择性，低检测限和适合实时监测而被广泛应用于分析检测等领域。

技术实现要素：

鉴于上述情况，本发明的目的在于提供一种选择性好，灵敏度高，响应速度快，荧光增强型快速检测亚硫酸氢根离子或亚硫酸根离子荧光分子探针的合成和应用。

本发明的目的还在于提供一种制备方法简单、反应条件温、成本较低的上述荧光分子探针的合成方法。

本发明解决问题采取的技术方案为，一种荧光增强型快速检测亚硫酸氢根离子或亚硫酸根离子荧光分子探针，具有以下结构的化学分子结构通式：

其中：R为甲基或者乙基。

本发明使用的荧光增强型快速检测亚硫酸氢根离子或亚硫酸根离子荧光分子探针，采用2-(4-甲酰基苯基)菲并咪唑和3-乙基-1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓碘化物在催化剂的存在下缩合而成。缩合而成的碳碳双键作为反应部位。

本发明代表性的化合物的合成原理，当R为乙基时，其合成路线如上图所示，将3-乙基-1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓碘化物和2-(4-甲酰基苯基)菲并咪唑溶解在无水乙醇中，滴加催化量的哌啶，室温搅拌反应8小时。将反应液过滤，并用无水乙醇洗涤所得固体，真空干燥得所述的荧光分子探针。

在本说明书的实施例中更详细地说明了该探针的合成和检测方法。本发明的荧光分子探针使用方法没有特殊限制，通常可以在室温下将探针分子溶解在乙醇和水溶液(4:6，v/v)中进行测试。当加入亚硫酸氢根离子或者亚硫酸根离子时，由于亚硫酸氢根离子或者亚硫酸根离子对碳碳双键的亲核加成，改变了探针分子的电子共轭情况，使其在紫外、荧光光谱上产生明显的变化，且伴随颜色通过肉眼可以观察到由红色到无色的变化。

本发明的一种荧光增强型快速检测亚硫酸氢根离子或亚硫酸根离子荧光分子探针的具体特征如下：

该分子荧光探针用二甲基亚砜(DMSO)溶解，探针分子在乙醇和水溶液(4:6，v/v)中时其最大紫外吸收波长在493 nm。 加入亚硫酸氢根离子或亚硫酸根离子后，探针分子在493 nm的吸收峰逐渐下降，同时在319 nm处的吸收峰的逐渐增强。相应地，溶液的颜色由红色变为无色，裸眼能够清楚的观察到颜色的明显变化。探针分子在乙醇和水溶液(4:6，v/v)中时其显示弱荧光，荧光光谱波长在450 nm，当加入亚硫酸氢根离子或亚硫酸根离子后，探针分子荧光明显增强。在365 nm荧光灯照射下，探针溶液加入亚硫酸氢盐或亚硫酸盐以后，肉眼观察到颜色由红色变成绿色。

本发明所述的荧光探针分子灵敏度高，荧光性能稳定，合成步骤简单，产率高，选择性好，检测速度快，检测限低等优点；响应时间为15秒，检测限为48 nM，并且适合裸眼检测，同时，该分子荧光探针不受AcO^-, CO₃^2-, F^-,Cl^-,Br^-, HCO₃^-, NO₃^-, S₂O₃^2-, HS^-,SO₄^2-, HPO₄^2-,H₂PO₄^-,PO₄³-, SCN^-等阴离子的干扰，即使在有干扰离子存在的条件下，探针也对亚硫酸氢根离子或亚硫酸根离子有很好的响应，使得该荧光分子探针在生物化学，环境科学等分析检测领域具有实际的应用价值。

附图说明

图1为本发明的荧光探针在乙醇和水溶液(4:6，v/v)体系中，紫外吸收光谱随亚硫酸氢根离子或亚硫酸根离子浓度增加的变化情况，横坐标为波长，纵坐标为吸光度。

图2为本发明的荧光探针在乙醇和水溶液(4:6，v/v)体系中，荧光发射光谱随亚硫酸氢根离子或亚硫酸根离子浓度增加的变化情况，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。

图3为本发明的荧光探针在乙醇和水溶液(4:6，v/v)体系中，荧光发射光谱随加入等浓度不同离子的变化情况，横坐标为探针分子及探针分子与不同的分析离子，纵坐标是在波长为450 nm处的荧光强度。

图4为本发明的荧光探针在乙醇和水溶液(4:6，v/v)体系中，荧光发射光谱随加入亚硫酸氢根离子或亚硫酸根离子与不同共存离子的变化情况，横坐标为探针分子探针和亚硫酸氢根离子及不同的共存离子，纵坐标是在波长为450 nm处的荧光强度。

图5为本发明的荧光探针的核磁共振氢谱。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的说明。

本发明所述的荧光分子探针的合成路线如下图所示：

实施例1：分子荧光探针1的制备

3-乙基-1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓碘化物357 mg(0.97 mmol)和2-(4-甲酰基苯基)菲并咪唑300 mg(0.93 mmol)溶解在10 ml无水乙醇中，滴加2-3滴的哌啶，室温搅拌反应8小时。然后将反应液过滤，并用无水乙醇洗涤所得固体，真空干燥得所述的荧光分子探针260 mg(42%)。

上述所得探针的核磁氢谱数据：¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 8.89 (s, 2H), 8.62-8.65 (d, J = 16.4 Hz, 3H), 8.54 – 8.46 (m, 5H), 8.32-8.34 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 8.24-8.25 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.16-8.18 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.87 – 7.60(m, 8H), 4.90-4.95 (q, J = 7.3 Hz, 2H), 2.09 (s, 6H), 1.58 (t, J = 7.3 Hz, 3H)。

实施例2：分子荧光探针1的制备

3-乙基-1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓碘化物357 mg(0.97 mmol)和2-(4-甲酰基苯基)菲并咪唑300 mg(0.93 mmol)溶解在10 ml无水乙醇中，滴加2-3滴的吡咯烷，室温搅拌反应8小时。然后将反应液过滤，并用无水乙醇洗涤所得固体，真空干燥得所述的荧光分子探针250 mg(40%)。

上述所得探针的核磁氢谱数据：¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 8.89 (s, 2H), 8.62-8.65 (d, J = 16.4 Hz, 3H), 8.54 – 8.46 (m, 5H), 8.32-8.34 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 8.24-8.25 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.16-8.18 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.87 – 7.60(m, 8H), 4.90-4.95 (q, J = 7.3 Hz, 2H), 2.09 (s, 6H), 1.58 (t, J = 7.3 Hz, 3H)。

实施例3：荧光增强型快速检测亚硫酸氢根离子或亚硫酸根离子荧光分子探针的应用。

将该分子荧光探针溶于二甲基亚砜(DMSO)中，配置成1 mmol/L的探针溶液；取探针溶液加入相应的乙醇和PBS(pH=7.4)缓冲液，配置成10 µM(有机相：PBS水相=4:6，v/v)的溶液，测试其紫外吸收光谱和荧光发射光谱变化情况。在紫外吸收光谱和荧光发射光谱中探针对亚硫酸氢根离子或亚硫酸根离子具有很高的的选择性，随着加入亚硫酸氢根离子或亚硫酸根离子浓度的增加，其紫外吸收光谱明显发生变化，波长493 nm处的吸收峰逐渐降低，波长319 nm处吸收峰逐渐升高，明显的颜色变化从红色变为无色也适用于裸眼检测，同时荧光发射逐渐增强数倍；而且该探针具有极快的响应速度，能在15秒内完成检测同时可视化；并且该探针不受AcO^-, CO₃^2-, F^-, Cl^-, Br^-, HCO₃^-, NO₃^-, S₂O₃^2-, HS^-,SO₄^2-, HPO₄^2-,H₂PO₄^-,PO₄^3-, SCN^-等阴离子的干扰，即使在有干扰离子存在的条件下，探针也对亚硫酸氢根离子或亚硫酸根离子有很好的响应，能够用于活体细胞内亚硫酸氢根离子或亚硫酸根离子的检测，使得该荧光分子探针在生物化学，环境科学等分析领域具有实际的应用价值。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细的介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围因由所附的权利要求来限定。