本发明涉及一种病毒检测方法，具体是一种禽白血病检测方法。
背景技术：
禽白血病病毒（Avain leukosis virus, 以下简称 ALV）是以引起禽各种造血细胞肿瘤性增生为特征的一类反转录病毒群，能感染鸡的可分为Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ和Ｊ等６个亚型，其中Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ和Ｊ亚型属于外源性 ALV，临床上常见Ａ 和Ｊ亚型，Ｂ、Ｃ、Ｄ亚型相对少见，Ｅ亚型属于内源性 ALV，本身不具有致病特征。近几年，外源性 ALV 尤其是 ALV-J已在我国的蛋鸡和地方品种鸡中广泛传播，造成了巨大的经济损失。并且宿主范围的扩大、ALV 本身的变异以及与其他病毒的混合感染等都给禽白血病的防制提出了新的挑战。由于目前没有商业化疫苗可用，只能从源头上阻断病毒的传播，因此，必须加强外源性 ALV 检测方法的研究，及时检测并淘汰感染或者疑似感染鸡，才能有效控制外源性 ALV。
我国每年需要对进口的约 120 万套种鸡中 0.5%-1% 个体进行病原学抽样检测，保证进口种鸡的洁净度 ；并对全国 10-15 个市场占有量最大的自繁自养种鸡场的核心群开展彻底的净化程序（每个鸡场每年需病原学检测 1-1.5 万只鸡，每代鸡 2-3 次），至少持续 4-5年 ；同时，特别需要对农业部国家地方鸡种基因库禽白血病的净化，每个品种核心群至少500 只，该基因库现保存有 31 个我国重要的纯地方品种鸡，承担国家的保种任务。
发掘禽白血病遗传抗性功能基因或基因位点，并应用于筛选禽白血病遗传抗性特异种质以培育禽白血病抗性鸡品种（系）是实现禽白血病遗传抗病育种的关键。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种禽白血病检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种禽白血病检测方法，包含以下步骤：（1）.提取待测鸡血液DNA，以SEQ ID NO：7～8所示P4引物扩增包含tvb 3731-3732insA突变位点的tvb受体基因片段，测序后判断待测鸡的基因型；（2）如待测鸡的基因型为tvb insA/insA，则为B亚群禽白血病抗性鸡，如待测鸡的基因型为 tvb S/insA或tvb S/S，则为B亚群禽白血病易感性鸡。
作为本发明进一步的方案：还包含以下步骤：（1）提取待测鸡血液DNA，以SEQ ID NO：7～8所示P4引物扩增包含tvb 3667-3668insAG和 tvb 3731-3732insA突变位点的tvb受体基因片段，测序后判断待测鸡的基因型；（2）如待测鸡在tvb 3667-3668insAG突变位点的基因型为tvb insAG/insAG，则对ALV-B感染产生遗 传抗性，如待测鸡在tvb 3731-3732insA突变位点的基因型为tvb insA/insA，则对ALV-B感染产生遗 传抗性，如待测鸡在tvb 3667-3668insAG和tvb 3731-3732insA突变位点的基因型分别为tvb insAG/insAG和 tvb insA/insA，则对ALV-B感染产生遗传抗性。
作为本发明进一步的方案：所述tvb 3667-3668insAG为tvb受体基因第3667与3668位的AG插入突变，tvb 3731-3732insA为tvb受体基因 第3731与3732位的A插入突变。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明在分析中国鸡种tvb受体基因的遗传变异时，除了发现tvb受体基因第3731与3732位的A插入突变之外，还发现在tvb受体基因第3667与3668核苷酸位置中存在AG插入突变，以这两个自然突变位点建立的诊断B亚群禽白血病抗性鸡的方法，可应用于筛选ALVB遗传抗性鸡品种（系）的育种素材，从而开展ALV-B遗传抗性鸡品种（系）的选育。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
一种禽白血病检测方法，包含以下步骤：（1）.提取待测鸡血液DNA，以SEQ ID NO：7～8所示P4引物扩增包含tvb 3731-3732insA突变位点的tvb受体基因片段，测序后判断待测鸡的基因型；（2）如待测鸡的基因型为tvb insA/insA，则为B亚群禽白血病抗性鸡，如待测鸡的基因型为 tvb S/insA或tvb S/S，则为B亚群禽白血病易感性鸡。
还包含以下步骤：（1）提取待测鸡血液DNA，以SEQ ID NO：7～8所示P4引物扩增包含tvb 3667-3668insAG和 tvb 3731-3732insA突变位点的tvb受体基因片段，测序后判断待测鸡的基因型；（2）如待测鸡在tvb 3667-3668insAG突变位点的基因型为tvb insAG/insAG，则对ALV-B感染产生遗 传抗性，如待测鸡在tvb 3731-3732insA突变位点的基因型为tvb insA/insA，则对ALV-B感染产生遗 传抗性，如待测鸡在tvb 3667-3668insAG和tvb 3731-3732insA突变位点的基因型分别为tvb insAG/insAG和 tvb insA/insA，则对ALV-B感染产生遗传抗性。
作为本发明进一步的方案：所述tvb 3667-3668insAG为tvb受体基因第3667与3668位的AG插入突变，tvb 3731-3732insA为tvb受体基因 第3731与3732位的A插入突变。
本发明的工作原理是：tvb 3667-3668insAG、tvb 3731-3672insA突变致宿主抗ALV-B感染的功能验证。1、体外细胞的功能验证：构建RCASBP(B)EGFP表达质粒，转染DF-I细胞7天后，收集 细胞上清液（上清液含携带EGFP荧光蛋白的RCASBP(B)病毒，即ALV-B病毒，可随后感染DF-I 和CEF细胞），测定病毒感染单位（IU）后，分装保存于-80℃。RCASBP(B)病毒分别感染tvb 3667 -3668insAG、tvb 3731-3732insA突变位点不同基因型CEF，包括野生型tvb S/S CEF（对ALV-B易感）、杂 合突变型tvb S/insAG和tvb S/insA CEF以及纯合突变型tvb insAG/insAG和tvb insA/insA CEF，感染后1、 2、4、7 天，利用流式细胞技术检测不同时间点tvb 3667-3668insAG、tvb 3731-3732insA突变不同基因 型CEF感染RCASBP(B)病毒后的阳性细胞率，确定tvb 3667-3668insAG、tvb 3731-3732insA突变不同基 因型CEF体外感染RCASBP(B)EGFP病毒的趋势。体外细胞实验结果表明：野生型tvb S/S CEF和 杂合突变型tvb S/insAG和tvb S/insA CEF对ALV-B易感，而纯合突变型tvb insAG/insAG和tvb insA/ insA CEF抗ALV-B的感染，证实tvb受体基因这2种自然突变tvb 3667-3668insAG和tvb 3731-3732insA导 致宿主抗ALV-B的感染。
建立的B亚群禽白血病遗传抗性鸡的鉴定标准为：1、假如某只鸡在tvb 3667-3668insAG 突变位点的基因型为tvb insAG/insAG，则这只鸡对ALV-B感染产生遗传抗性；2、假如某只鸡在 tvb 3731-3732insA突变位点的基因型为tvb insA/insA，则这只鸡对ALV-B感染产生遗传抗性；3、假 如某只鸡在tvb 3667-3668insAG和tvb 3731-3732insA突变位点的基因型为tvb insAG/insAG和tvb insA/insA， 则这只鸡也对ALV-B感染产生遗传抗性。
上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下做出各种变化。