脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及一种检测试剂盒，具体涉及一种脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒及其应用。
背景技术：
：脊髓性肌萎缩(SMA)是一种常染色体隐性遗传疾病，其是由基因突变导致脊髓前角细胞变性引起的神经肌肉遗传病，临床表现为进行性、对称性肢体近端和躯干肌肉无力、萎缩，患者最终死于呼吸衰竭和严重的肺部感染。SMA是发病率第二高的致死性常染色体隐性遗传病，目前尚无有效的治疗方法。SMA在活产婴儿中发病率约为1/6000～1/10000，人群中的携带率为1/35～1/80。鉴于SMA在中国人群中具有较高的携带率和发病率，通过SMA携带者筛查进行婚姻与生育指导，是阻断该病遗传最为有效的方式。SMA致病基因为运动神经元存存活基因(SMN)。SMN基因在全身组织中普遍表达，大部分细胞可以耐受低水平的SMN蛋白，但脊髓前角细胞(脊髓运动神经元)无法耐受低水平的SMN蛋白，结果神经元逐步死亡而患者肌肉日渐萎缩。SMN基因定位于5q13区，具有两个高度同源的拷贝：SMN1和SMN2。SMN1基因表达完整而稳定的SMN功能蛋白，是SMA的决定性基因，SMN1基因缺陷造成SMA表型；SMN2基是SMA的补偿基因，只能表达少量有生物活性的SMN蛋白，SMN2基因缺失不造成SMA表型，但是SMN2拷贝数与SMA表型的轻重直接相关。已有统计表明，约95％的SMA患者为SMN1基因缺失型(第7和/或第8外显子纯合缺失)。因此，基于人群的SMA致病基因携带者筛查，主要是针对SMN1基因缺失的检测。根据SMA致病基因的特点，目前的诊断策略是分析SMN1基因第7外显子是否存在缺失及缺失数目。现有的SMN基因诊断技术包括：聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)技术、等位基因特异性扩增技术、多重连接探针扩增(MLPA)、高分辨溶解曲线(HRM)、变性高效液相色谱(DHPLC)和荧光实时定量PCR。PCR-RFLP、等位基因特异性扩增和HRM技术仅适合于检测SMN1基因的纯合缺失，然而不能区分杂合缺失的SMA致病基因携带者与不存在缺失的正常人。MLPA技术是目前SMA实验室诊断的主流技术，该方法采用荷兰MRC公司的SMAMLPA检测试剂盒，其成本昂贵(>150元/样本)，并且需要毛细管电泳等贵重分析仪器，耗时长，不适合用于大规模人群的筛查工作。鉴于我国提出预防出生缺陷和减少先天残疾患儿出生等提高出生人口素质的目标，因此研发准确可靠、简单实用、标准化的SMN1基因检测方法，对于开展SMA疾病诊断、SMA致病基因携带者筛查、分子群体流行病学调查等相关工作具有重要意义。技术实现要素：本发明提供一种脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒及其应用，该试剂盒能够直观、准确、快速、简便地对SMN1基因的拷贝数进行检测，从而能够实现SMA致病基因携带者与正常人的区分。本发明提供一种脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒，包括：引物SMN-Ex7-F，其序列如SEQIDNO.1；引物SMN-Ex7-R，其序列如SEQIDNO.2；探针SMN-Ex7-P，其序列如SEQIDNO.3。本发明的试剂盒针对性地对SMA致病基因SMN1基因的Exon7关键位点进行检测，从而反映SMN1基因的拷贝数；其中，引物SMN-Ex7-F和引物SMN-Ex7-R特异性扩增SMN1和SMN2基因的Exon7，而探针SMN-Ex7-P特异性针对SMN1Exon7c.840位点，该PCR引物对和Taqman探针能够针对性地对SMN1基因进行检测，而不受SMN2基因的干扰。进一步地，本发明的脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒，还可以包括：引物SMN-In7-F，其序列如SEQIDNO.4；引物SMN-In7-R，其序列如SEQIDNO.5；探针SMN-In7-P，其序列如SEQIDNO.6。上述试剂盒还能够针对性地对SMA致病基因SMN1基因的Intron7关键位点进行检测，进一步反映SMN1基因的拷贝数；其中，引物SMN-In7-F和引物SMN-In7-R特异性扩增SMN1和SMN2基因的Intron7，而探针SMN-In7-P特异性针对SMN1Intron7IVS7+87位点，该PCR引物对和Taqman探针能够针对性地对SMN1基因进行检测，而不受SMN2基因的干扰。进一步地，本发明的脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒，还可以包括：引物RPP30-Ex1-F，其序列如SEQIDNO.7；引物RPP30-Ex1-R，其序列如SEQIDNO.8；探针RPP30-Ex1-P，其序列如SEQIDNO.9。上述试剂盒还设置用于检测内参基因RPP30的引物对和探针，有利于提高检测的准确性；其中，引物RPP30-Ex1-F和引物RPP30-Ex1-R特异性扩增内参基因RPP30Exon1，而探针RPP30-Ex1-P特异性检测RPP30基因。本发明对上述各引物和探针的设置浓度不作严格限制，只要其浓度范围不影响SMA致病基因的正常检测即可，可以为本领域的常规浓度范围，例如10-20μM。进一步地，本发明的脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒还可以包括对照DNA标本，例如SMA患者、SMA携带者、正常人等的对照DNA标本，其可在对待检测者进行SMA致病基因检测时作为对照，从而便于根据检测结果对待检测者的类型进行判定。在本发明的具体方案中，脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒还包括：非脊髓性肌萎缩症正常基因型对照组gDNA标本、脊髓性肌萎缩症携带者基因型对照组gDNA标本和脊髓性肌萎缩症患者基因型对照组gDNA标本中的至少一种；特别是，本发明的试剂盒同时包括上述三种标本，从而能够对待检测者的类型进行精确地判定。具体地，非脊髓性肌萎缩症正常基因型对照组gDNA标本中SMN1基因Exon7和Exon8、SMN2基因Exon7和Exon8的拷贝数均为2；脊髓性肌萎缩症携带者基因型对照组gDNA标本中SMN1基因Exon7和Exon8的拷贝数均为1，SMN2基因Exon7和Exon8的拷贝数均为2；而脊髓性肌萎缩症患者基因型对照组gDNA标本中SMN1基因Exon7和Exon8的拷贝数均为0，SMN2基因Exon7和Exon8的拷贝数均为2。对上述各对照组gDNA标本的浓度不作严格限制，只要其浓度范围不影响SMA致病基因的正常检测即可，可以为本领域的常规浓度范围，例如10-200ng/μL。进一步地，本发明的脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒还可以包括其它必要的试剂，例如用于荧光定量PCR的相关试剂；具体可以为2×TaqPCRMastermix，其可以包括TaqDNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR反应增强剂、优化剂、稳定剂等本领域常规试剂，可根据本领域常规方式进行自行配制或通过普通市售获得。本发明还提供上述任一所述的脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒在脊髓性肌萎缩症致病基因检测试上的应用；特别是在脊髓性肌萎缩症致病基因携带者检测上的应用。具体地，可以采用上述任一所述的脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒以待检测者基因组DNA为模板进行荧光定量PCR。本发明还提供一种脊髓性肌萎缩症致病基因携带者检测方法，包括如下步骤：提取待检测者的基因组DNA；对待检测者基因组DNA进行准确定量；以待检测者基因组DNA为模板进行第一荧光定量PCR，得到第一荧光定量曲线；其中，第一荧光定量PCR体系包括：引物SMN-Ex7-F，其序列如SEQIDNO.1；引物SMN-Ex7-R，其序列如SEQIDNO.2；探针SMN-Ex7-P，其序列如SEQIDNO.3。在本发明中，可以采用本领域的常规方法提取待检测者的基因组DNA并对待检测者基因组DNA进行准确定量，例如可以采用本领域常规的试剂盒进行提取；提取的待检测者基因组DNA的浓度可以为20-150ng/μL。此外，可以采用荧光定量仪对待检测者基因组DNA进行准确定量。本发明的脊髓性肌萎缩症致病基因携带者检测方法，通过对待检测者基因组DNA进行准确定量后，通过荧光定量PCR得到待检测者的荧光定量曲线(即第一荧光定量曲线)；通过对待检测者的荧光定量曲线与SMA患者、SMA携带者、正常人的荧光定量曲线进行比对，即可直观地判定待检测者的类型。上述方法无需对曲线Ct值进行数据处理与转换，检测速度快，操作简便，结果直观清晰，检测成本低，从而有利于作为临床患者诊断和携带者筛查，适合大规模推广应用。进一步地，本发明的脊髓性肌萎缩症致病基因携带者检测方法，还包括：以非脊髓性肌萎缩症正常基因型对照组gDNA标本、脊髓性肌萎缩症携带者基因型对照组gDNA标本和脊髓性肌萎缩症患者基因型对照组gDNA标本中的至少一种为模板进行所述第一荧光定量PCR，得到相应的第一荧光定量对照曲线；特别是，本发明可以上述三种为模板同时进行所述第一荧光定量PCR，从而分别得到正常人的荧光定量对照曲线、SMA携带者的荧光定量对照曲线以及SMA患者的荧光定量对照曲线。上述方法同时对待检测者和上述对照组进行荧光定量PCR，从而能够通过对待检测者和对照组的荧光定量曲线的比对而准确地获得待检测者的类型，有利于提高检测结果的准确性。具体地，待检测者的荧光定量曲线与正常人的荧光定量曲线相同或相似时，可判定该待检测者为正常人，即不携带SMA致病基因；待检测者的荧光定量曲线与SMA携带者的荧光定量曲线相同或相似时，可判定该待检测者为SMA携带者；待检测者的荧光定量曲线与SMA患者的荧光定量曲线相同或相似时，可判定该待检测者为SMA患者。进一步地，本发明的脊髓性肌萎缩症致病基因携带者检测方法，还包括：以待检测者基因组DNA和非脊髓性肌萎缩症正常基因型对照组gDNA标本、脊髓性肌萎缩症携带者基因型对照组gDNA标本和脊髓性肌萎缩症患者基因型对照组gDNA标本中的至少一种为模板进行第二荧光定量PCR，得到第二荧光定量曲线和第二荧光定量对照曲线；其中，第二荧光定量PCR体系包括：引物SMN-In7-F，其序列如SEQIDNO.4；引物SMN-In7-R，其序列如SEQIDNO.5；探针SMN-In7-P，其序列如SEQIDNO.6。上述方法针对一个样本结合两个位点同时检测，有利于提高检测结果的准确性。进一步地，所述第一荧光定量PCR体系和第二荧光定量PCR体系还包括：引物RPP30-Ex1-F，其序列如SEQIDNO.7；引物RPP30-Ex1-R,其序列如SEQIDNO.8；探针RPP30-Ex1-P，其序列如SEQIDNO.9。上述方法以内参基因RPP30作为参照，有利于确保检测结果的一致性。本发明对第一荧光定量PCR和第二荧光定量PCR的体系和程序不作严格限制，不影响SMA致病基因的正常检测即可，可以采用本领域常规的体系和程度。优选地，第一荧光定量PCR和第二荧光定量PCR程序为：变性：95℃预变性2分钟；PCR循环扩增：95℃变性15秒，61℃退火和延伸33秒，共45个循环。在该条件下，SMN1基因和RPP30基因的PCR扩增效率接近100％。本发明的脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒和检测方法，在对待检测者基因组DNA进行准确定量的基础上，针对一个样本两个位点同时检测，其通过与荧光变化曲线结合，实现了SMN1基因拷贝数的直观、准确、快速检测，进而能够实现SMA致病基因携带者与正常人的区分；该方法无需对曲线Ct值进行数据处理与转换，检测速度快，操作简便，结果直观清晰，检测成本低，有利于作为临床患者诊断和携带者筛查，适合大规模推广应用，可以作为SMA分子流行病学调查、孕前和产前筛查。附图说明图1为8个样本的第一荧光定量PCR曲线；其中：1为RPP30基因；2为SMN1基因Exon7纯合缺失型SMA患者；3为SMN1基因Exon7只有1个拷贝的SMA携带者；4为SMN1基因Exon7为2个拷贝的正常人；图2为8个样本的第二荧光定量PCR曲线；其中：5为RPP30基因；6为SMN1基因Intron7只有1个拷贝的SMA携带者；7为SMN1基因Intron7为2个拷贝的正常人；8为SMN1基因Intron7纯合缺失型SMA患者；图3为96个样本的第一荧光定量PCR曲线；其中：1为RPP30基因；2为SMN1基因Exon7纯合缺失型SMA患者；3为SMN1基因Exon7只有1个拷贝的SMA携带者；4为SMN1基因Exon7为2个拷贝的正常人；图4为96个样本的第二荧光定量PCR曲线；其中：5为RPP30基因；6为SMN1基因Intron7只有1个拷贝的SMA携带者；7为SMN1基因Intron7为2个拷贝的正常人；8为SMN1基因Intron7纯合缺失型SMA患者。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的附图和实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒本发明的脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒，包括：引物SMN-Ex7-F，其序列为：5'-CCGCTATCTATATATAGCTATCTATG-3'(SEQIDNO.1)；引物SMN-Ex7-R，其序列为：5'-CCTACATTAACCTTTCAACTTTT-3'(SEQIDNO.2)；探针SMN-Ex7-P，其序列为：5'-FAM-CTTACAGGGTTTCAGACAAAAT-MGB-3'(SEQIDNO.3)。进一步地，本发明的脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒还包括：引物SMN-In7-F，其序列为：5'–CCTATTTTCCTTACAGGGTTTC-3'(SEQIDNO.4)；引物SMN-In7-R，其序列为：5'–TTGTGAAAGTATGTTTCTTCCACAT-3'(SEQIDNO.5)；探针SMN-In7-P，其序列为：5'-FAM-CCTTTCAACTTTTTAACATCT-MGB-3'(SEQIDNO.6)。进一步地，本发明的脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒还包括：引物RPP30-Ex1-F，其序列为：5'-TTTGGACCTGCGAGCG-3'(SEQIDNO.7)；引物RPP30-Ex1-R，其序列为：5'-GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3'(SEQIDNO.8)；探针RPP30-Ex1-P，其序列为：5'-JOE-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ1-3'(SEQIDNO.9)。其中，上述各引物和探针的浓度均为10μM。进一步地，本发明的脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒还包括：非脊髓性肌萎缩症正常基因型对照组gDNA标本(正常人标本)、脊髓性肌萎缩症携带者基因型对照组gDNA标本(SMA携带者标本)和脊髓性肌萎缩症患者基因型对照组gDNA标本(SMA患者标本)；其中，非脊髓性肌萎缩症正常基因型对照组gDNA标本中SMN1基因Exon7和Exon8、SMN2基因Exon7和Exon8的拷贝数均为2；脊髓性肌萎缩症携带者基因型对照组gDNA标本中SMN1基因Exon7和Exon8的拷贝数均为1，SMN2基因Exon7和Exon8的拷贝数均为2；而脊髓性肌萎缩症患者基因型对照组gDNA标本中SMN1基因Exon7和Exon8的拷贝数均为0，SMN2基因Exon7和Exon8的拷贝数均为2；此外，各对照组gDNA标本的浓度均为50ng/μL。进一步地，本发明的脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒还包括：2×TaqPCRMastermix，其购自北京天根生化科技有限公司。实施例2脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒的应用一、获取待检测者的基因组DNA从本遗传中心样本资源库中所保存的基因组DNA中，选取均已经过MLPA方法检验的样本1050份(其中包括50例纯合缺失型SMA患者、500例杂合缺失型SMA携带者和500例正常人)。盲法分析：采用NanoDropND-2000测定上述基因组DNA浓度，取浓度在20-150ng/μL，A260/A280在1.8-1.9之间的样本作为待检测者的基因组DNA进行盲法编号，备用；对于不符合上述要求的标本，不纳入本次分析检测。二、对待检测者基因组DNA进行准确定量1、配制工作液(Qubitworkingsolution)DNA结合染料HS试剂(HSReagent)用HS缓冲液(HSBuffer)按照1：200稀释，即得到1×工作液(1×Qubitworkingsolution)。2、标准品的制备分别取标准品1(Quantstandard1，0ng/μL)和标准品2(standard2，10ng/μL)各10μL，与190μL上述1×工作液(1×Qubitworkingsolution)转入Qubit专用的测量管，作为标准品。3、制备标准曲线利用Qubit@2.0荧光计制备标准曲线；具体地，打开Qubit@2.0荧光计电源后，依次点击“DNA”，“dsDNA”，“highsensitivity”，“Read”，“Standard”，制备标准曲线。4、准确定量取2μL各待检测者基因组DNA与198μL1×工作液(1×Qubitworkingsolution)转入Qubit专用的测量管中混合；随后室温避光孵育2min，使DNA与染料充分结合，然后置于Qubit@2.0荧光计中进行荧光检测；具体地，选择程序：“dsDNA”，“highsensitivity”，“Read”，“CalculateStolkConc”，选择加入的DNA体积，自动得到各检测者基因组DNA的浓度。5、稀释采用LowTE缓冲液稀释各待检测者基因组DNA至5ng/μL，备用。三、第一荧光定量PCR(SMN1基因Exon7检测)以上述5ng/μL的各检测者基因组DNA为模板，采用实施例1的脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒，按照表1的荧光定量PCR反应体系制备反应体系；同时，以非脊髓性肌萎缩症正常基因型对照组gDNA标本、脊髓性肌萎缩症携带者基因型对照组gDNA标本和脊髓性肌萎缩症患者基因型对照组gDNA标本作为对照。表1第一荧光定量PCR体系组份体积DNA(5ng/μL)6.02×TaqPCRMastermix10引物SMN-Ex7-F(10μM)0.2引物SMN-Ex7-R(10μM)0.4探针SMN-Ex7-P(10μM)0.4引物RPP30-Ex1-F(10uM)1引物RPP30-Ex1-R(10μM)1探针RPP30-Ex1-P(10μM)0.4H2O0.2ROX(50×)0.4总体积20采用定量PCR仪(ABIHT7900，lifetechnologies公司)进行第一荧光定量PCR；其中，第一荧光定量PCR程序为：预变性：95℃2分钟；PCR循环扩增：95℃变性15秒，61℃退火和延伸33秒，共45个循环；在61℃延伸时采集FAM和JOE通道荧光信号，分别得到各待检测者的第一荧光定量曲线、正常人的第一荧光定量对照曲线、SMA携带者的第一荧光定量对照曲线以及SMA患者的第一荧光定量对照曲线；其中，SMN1基因和RPP30基因的PCR扩增效率接近100％。将各待检测者的第一荧光定量曲线分别与正常人的第一荧光定量对照曲线、SMA携带者的第一荧光定量对照曲线以及SMA患者的第一荧光定量对照曲线进行比对，从而获知各待检测者类型，即SMA患者、SMA携带者或正常人。图1和图4分别为8个样本和96个样本的第一荧光定量PCR曲线；其中：1为RPP30基因；2为SMN1基因Exon7纯合缺失型SMA患者；3为SMN1基因Exon7只有1个拷贝的SMA携带者；4为SMN1基因Exon7为2个拷贝的正常人。四、第二荧光定量PCR(SMN1基因Intron7检测)以上述5ng/μL的各检测者基因组DNA为模板，采用实施例1的脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒，按照表2的荧光定量PCR反应体系制备反应体系；同时，以非脊髓性肌萎缩症正常基因型对照组gDNA标本、脊髓性肌萎缩症携带者基因型对照组gDNA标本和脊髓性肌萎缩症患者基因型对照组gDNA标本作为对照；其中，SMN1基因和RPP30基因的PCR扩增效率接近100％。表2第二荧光定量PCR体系采用定量PCR仪(ABIHT7900，lifetechnologies公司)进行第二荧光定量PCR；其中，第二荧光定量PCR程序为：预变性：95℃2分钟；PCR循环扩增：95℃变性15秒，61℃退火和延伸33秒，共45个循环；在61℃延伸时采集FAM和JOE通道荧光信号，分别得到各待检测者的第二荧光定量曲线、正常人的第二荧光定量对照曲线、SMA携带者的第二荧光定量对照曲线以及SMA患者的第二荧光定量对照曲线。将各待检测者的第二荧光定量曲线分别与正常人的第二荧光定量对照曲线、SMA携带者的第二荧光定量对照曲线以及SMA患者的第二荧光定量对照曲线进行比对，从而获知各待检测者类型。图2和图4分别为8个样本和96个样本的第二荧光定量PCR曲线；其中：5为RPP30基因；6为SMN1基因Intron7只有1个拷贝的SMA携带者；7为SMN1基因Intron7为2个拷贝的正常人；8为SMN1基因Intron7纯合缺失型SMA患者。上述1050份样本经本发明上述方法检测后，检测结果见表3。对比例采用现有权威的SMA临床检测试剂盒作为比较例。对比试剂盒为：SALSAMLPAP060probemixSMA，荷兰MRC公司，Cat：P060-100R。采用MLPA(多重连接依赖探针扩增)方法进行检测，具体为：1、DNA变性取5μL实施例2的各待检测者基因组DNA(50ng)，98℃加热5分钟。2、杂交加入1.5μLMLPABuffer和1.5μLSALSA探针的混合物，95℃加热1分钟，然后于60℃杂交16-18个小时。3、连接加入3μLbufferA、3μLbufferB、25μL水和1μL连接酶于54℃孵育20分钟，然后于98℃加热5分钟使连接酶失活。4、PCR扩增加入7.5μL水、2μLSALSA引物混合物，0.5μLDNA聚合酶，然后开始PCR扩增；程度为：95℃，30秒；60℃，30秒共35个循环；之后72℃延伸20分钟。5.毛细管电泳加入甲酰胺变性，经ABI3130XL分析仪检测，再经软件Coffalyser分析结果，检测结果见表3。表3两种检测方法的检测结果由表3结果可知：采用本发明的脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒进行检测，与MLPA检测方法相比，其准确性达到100％，假阳性率为0％，特异性达到100％，检测结果与MLPA检测方法所获得的结果完全一致。本发明的脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒及检测方法，能够快速、简便地检测SMN1基因的拷贝数，从而实现SMA患者、携带者及正常人的快速分子诊断，其重复性好、准确性高、稳定性好，能够满足当前大规模人群的SMA携带者筛查和常规分子诊断要求。最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。序列表<110>郑州大学第一附属医院<120>脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒及其应用<160>9<170>PatentInversion3.5<210>1<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>1ccgctatctatatatagctatctatg26<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>2cctacattaacctttcaactttt23<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>3cttacagggtttcagacaaaat22<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>4cctattttccttacagggtttc22<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>5ttgtgaaagtatgtttcttccacat25<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>6cctttcaactttttaacatct21<210>7<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>7tttggacctgcgagcg16<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>8gagcggctgtctccacaagt20<210>9<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>9ttctgacctgaaggctctgcgcg23当前第1页1 2 3