一种诊断人类脊髓性肌萎缩症的荧光定量pcr试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种诊断人类脊髓性肌萎缩症的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒包括扩增引物和荧光探针，其特征在于，所述的扩增引物为，一对特异性扩增SMN1和SMN2基因的共用引物、一对特异性扩增NAIP基因的引物和一对特异性扩增参比序列的引物；所述的荧光探针为，特异性检测SMN1基因的荧光探针、特异性检测SMN2基因的荧光探针、特异性检测NAIP基因的荧光探针和特异性检测参比序列的荧光探针；所述的参比序列为SEQ?NO.14所示序列，该序列位于NAIP基因端粒侧78kb处的GRCh37/hg19chr5:71107506－71107618区间。本发明所述试剂盒以位于NAIP基因端粒侧的DNA序列为参比序列，显著提高了诊断的准确性和稳定性。
【专利说明】一种诊断人类脊髓性肌萎缩症的荧光定量PCR试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物化学领域，具体涉及核酸的测定或检验方法的试剂。
【背景技术】
[0002]脊髓性肌萎缩症(Spinal Muscular Atrophy, SMA)是一组常见的常染色体隐性遗传病，居致死性常染色体隐性遗传病的第二位，活产婴儿中患者发生率为1/6000~1/10000。临床上,SMA—般分为4种类型:I型(又称Werding-Hoffman病)是最严重的亚型(重型)，约占SM患者的一半,发病急、进展快，一般在出生6个月之内发病,多于2岁之内死亡；SMA II型为慢性婴儿型(中间型)，通常在7~18个月内发病，大多可以存活10~20岁；SMA III型(又称Wohlfart-Kugelberg-Welander病)为青少年型(轻型)，出生18个月后才发病，病情发展缓慢，一般可存活至成年，多因呼吸肌麻痹或全身功能衰竭死亡；SMAIV型则为成年型(极轻型)，一般于20~30岁以后发病，主要表现为缓慢逐渐发生的上下肢近端无力和肌肉萎缩，成年期都能够行走。总的来说，SMA为致死性疾病，神经肌肉疾病病情严重，目前临床上无有效治疗手段。
[0003]正常情况下，人类机体会正常表达SMN蛋白和NAIP蛋白，而维护脊髓前角细胞功能。当SMN蛋白和NAIP蛋白表达下降甚至消失后，将导致脊髓前角细胞变性，从而使个体身体躯干和四肢近端骨骼肌进行性肌无力、肌萎缩，即脊髓性肌萎缩症(SMA)。SMA的病因是由于SMA相关基因(主要包含SMN基因和NAIP基因)缺失或突变，导致SMN蛋白和NAIP蛋白表达下降甚至消失而发病，因此通过检测SMN基因和NAIP基因缺失或突变状况，是SMA的主要确诊方法。
[0004]人类SMA相关基因位于5号染色体长臂I区3带2亚带(5ql3.2)上，包括脊髓运动神经元(Spinal Motor Neurons, SMN)基因和神经元细胞凋亡抑制蛋白(NeuronalApoptosis Inhibitory Protein, NAIP)基因。其中SMN基因全长20kb,包括9个外显子和8个内含子，有两个非常相似的基因`拷贝，即位于端粒端的SMNl (或称SMNt)和位于着丝粒端的SMN2 (或称SMNc)。SMNl和SMN2为两个高度同源的倒位重复DNA序列，仅在3’端有5个碱基的差异，尤其是SMN2因第7外显子与SMNl的单个碱基差异(c.840C>T)，导致此两个基因拷贝所编码的蛋白产物不同，即SMNl编码完整而稳定的SMN功能蛋白，而SMN2主要编码功能缺陷的截短SMN蛋白，少部分(10%-50%)编码完整而稳定的SMN功能蛋白，在SMNl基因功能完全丧失时，SMN2基因的表达对SMN蛋白的功能具有一定的补充作用，被定义为SMA的修饰基因。NAIP基因全长70kb，包括16个外显子和15个内含子，编码的NAIP蛋白通过阻断细胞信号转导通路中的caspase-3和caspase_7的激活抑制神经细胞凋亡,NAIP蛋白功能缺失，使前角运动细胞凋亡过度，导致运动神经元受损，引起继发性肌肉萎缩，加重SMA病情，因此NAIP基因也被定义为SMA的修饰基因。
[0005]目前的研究已经表明，SMA的病因主要是SMN基因和NAIP基因部分序列缺失:其中SMNl为决定基因，表达完整而稳定的SMN功能蛋白，SMN2作为SMA的修饰基因，所表达的具有生物活性SMN蛋白量虽然较少，但随着其拷贝数增加会有表达量的累积效应，从而使患者的临床症状有一定程度的减轻。有关NAIP基因，研究显不其缺失(缺失范围为外显子5和6)与SMA病情严重程度相关，涉及到NAIP基因缺失的SMA病人临床表型重，仅为单独的SMN基因缺失而未涉及NAIP基因缺失的SMA病人则临床表型轻。据报道，98.7% (226/229)儿童型患者存在SMNl基因缺失，其中约90%的SMA病人显示纯合SMNl外显子7和/或8缺失。Iannaccone等报道由于基因转化，SMN2在人群中的基因拷贝数为0_4个，而不只是2个拷贝。本课题调查了 1712个中国人新生儿SMN2的拷贝数，发现中国人群中SMN2基因拷贝数不均衡是普遍的现象。据此，SMNl基因序列纯合缺失导致SMN蛋白功能丧失为SMA确诊指标，SMN2和NAIP基因功能状态影响疾病临床表型的严重程度。所以同时检测SMNl、NAIP三个基因目的片段的缺失或多拷贝的数量不仅可以准确诊断SMA，并且对分析估测SMA的临床表型十分必要。
[0006]根据SMA的分子机制，目前的诊断策略是通过分析SMNl基因目的片段是否有缺失及缺失的数目而进行常规和产前基因诊断。随着分子生物学技术的发展，先后出现不同的SMA分子诊断技术。包括一些传统方法如PCR-单链构象多态性分析法，单碱基突变PCR技术和变性高效液相色谱技术分析SMN基因7、8号外显子突变情况。这些技术普遍存在准确率低，操作复杂而且耗时，检测试剂成本高和需要昂贵的仪器设备等缺点。此后出现了应用实时荧光定量PCR技术检测SMNl基因的缺失。目前这些技术方法都是基于SMNl基因目的序列缺失状况的检测，没有将SMN2基因和NAIP基因目的序列缺失或多拷贝分析纳入检测范畴，也没有基于SMN1/2和NAIP基因的全面检测与分析。这种情况主要是由以下三个方面造成的:一是没有意识到SMN2基因和NAIP基因在SMA临床分型中的重要作用，二是由于SMN2基因与SMNl基因序列高度同源，只有5个碱基的差异，同时检测SMNl基因和SMN2基因，对技术提出了更高的要求，三是当在同一体系中增加TaqMan探针数量时，会增加体系优化和检测难度。而且，如果只针对SMNl基因序列进行检测，由于SMNl基因和SMN2基因序列高度相似，往往出现假阳性检测结果。此外，由于在荧光定量检测中参比序列选择的不合适，导致检测结果受DNA提取方法影响大，检测结果重复率和准确率较差，方法很难形成试剂盒在临床上推广。因此，选择合适的参比序列并采用技术手段对SMNl基因序列，SMN2基因序列和NAIP基因序列进行检测，无论从临床实际应用上还是检测技术要求上都是十分必要的。目前临床上对SMA进行常规检测主要是采用荷兰MRC公司的多重连接探针扩增(Multiple Ligation-dependent Probe Amplification, MLPA)检测试剂盒，该方法成本昂贵(检测单个标本仅试剂成本约100元人民币)，需要特定的分析仪器，耗时长(约24小时)，患者负担重，难以在临床上进行大规模人群筛查和技术推广。
[0007]随着以降低SMA患儿出生率为目标的预防计划与措施的相继实施，以及SMA发病分子机制及分子流行病学的深入研究，研发准确可靠、简单实用、能够实现自动化和标准化、适合大规模人群筛查和常规分子诊断的高通量同时快速检测SMN1、 SMN2和NAIP基因序列拷贝数的状态，从而确诊SMA的新型分子诊断试剂盒为当前迫切之需。
【发明内容】
[0008]本发明要解决的技术问题是提供一种诊断人类脊髓性肌萎缩症的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒具有诊断结果准确且稳定的优点。
[0009]本发明解决上述技术问题的方案如下:[0010]一种诊断人类脊髓性肌萎缩症的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒包括扩增引物和荧光探针，其特征在于，所述的扩增引物为，一对特异性扩增SMNl和SMN2基因的共用引物、一对特异性扩增NAIP基因的引物和一对特异性扩增参比序列的引物；所述的荧光探针为，特异性检测SMNl基因的荧光探针、特异性检测SMN2基因的荧光探针、特异性检测NAIP基因的荧光探针和特异性检测参比序列的荧光探针；其中，
[0011](I)所述的一对特异性扩增SMNl和SMN2基因的共用引物中，
[0012]上游引物序列为:5’-CATCCATATAAAGCTATCTATATATAG-3’ (SEQ N0.1),
[0013]下游引物序列为:5’-CTTAATTTAAGGAATGTGAGCACCT-3’ (SEQ N0.2)；
[0014](2)所述的一对特异性扩增NAIP基因的引物中，
[0015]上游引 物序列为:5’-TTGTGACTTATGAGCCGTACAGC-3’ (SEQ N0.3),
[0016]下游引物序列为:5’-AGGCTACAGCAGAAGCACTGAAT-3’ (SEQ N0.4)；
[0017](3)所述的一对特异性扩增参比序列的引物中，
[0018]上游引物序列为:5’-GAACACACATGTCAGAAGTCTAAG-3’ (SEQ N0.5),
[0019]下游引物序列为:5’-ACCTCCAGTTAGATCTTCACTTCT-3’ (SEQ N0.6)；
[0020](4)所述的特异性检测SMNl基因的荧光探针为:
[0021]5’-TTTGATTTTGTCTGAAACCCTGTAAGG-3’ (SEQ N0.7)，该探针的荧光素及其淬灭基团为 5’ -HEX, 3’ -BHQl ；
[0022](5)所述的特异性检测SMN2基因的荧光探针为:
[0023]5’-TTTTGATTTTGTCTAAAACCCTGTAAGGA-3’ (SEQ N0.8)，该探针的荧光素及其淬灭基团为 5’ -FAM, 3’ -BHQl ；
[0024](6)所述的特异性检测NAIP基因的荧光探针为:
[0025]5’-ATGGATACCACAGGAGATGGCG-3’ (SEQ N0.9)，该探针的荧光素及其淬灭基团为5， -CY5,3， -BHQ2 ；
[0026](7)所述的特异性检测参比序列的荧光探针为:
[0027]5’-CAAATGCATCAGATTCCACAAGCT-3’ (SEQ N0.10)，该探针的荧光素及其淬灭基团为 5’ -R0X, 3’ -BHQ2。
[0028](8)所述的参比序列为 acctccagtt agatcttcac ttctaaagct aagtgagacctgagacccat gtagacaccc aagaagcttg tggaatctga tgcatttggc ttagacttct gacatgtgtgttc (SEQ N0.14)，该序列位于 NAIP 基因端粒侧 78kb 处的 GRCh37/hgl9chr5:71107506 —71107618 区间。
[0029]本发明所述的扩增引物和荧光探针可以由本领域常用的方法合成。
[0030]本发明所述的荧光探针中，HEX指六氯一 6 —甲基荧光素，FAM指羧基荧光素，CY5是指花青染料分子5，ROX指羧基-X-罗丹明，BHQl和BHQ2是指荧光淬灭基团。
[0031]本发明所述的荧光定量PCR试剂盒还包括多重PCR常用试剂，如，DNA聚合酶、50~200ng/ul正常基因型对照gDNA标本、二氯化镁和dNTPs，其中DNA聚合酶为Ex Taq0DNA聚合酶、二氯化镁和dNTPs购于宝生物(TaKaRa)大连有限公司。
[0032]本发明所述的荧光定量PCR试剂盒中，目的基因SMNl、SMN2和NAIP和参比序列同位于5号染色体长臂I区3带2亚带(5ql3.2)上，扩增子DNA序列长度均为80 — 150bp、GC含量20% - 60%、无连续的5个G或C (参见图3)。[0033]本发明所述的荧光定量PCR试剂盒中DNA序列(SEQ N0.1~10)的位置信息见下表:
【权利要求】
1.一种诊断人类脊髓性肌萎缩症的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒包括扩增引物和荧光探针，其特征在于，所述的扩增引物为，一对特异性扩增SMNl和SMN2基因的共用引物、一对特异性扩增NAIP基因的引物和一对特异性扩增参比序列的引物；所述的荧光探针为，特异性检测SMNl基因的荧光探针、特异性检测SMN2基因的荧光探针、特异性检测NAIP基因的荧光探针和特异性检测参比序列的荧光探针；其中， (1)所述的一对特异性扩增SMNl和SMN2基因的共用引物中， 上游引物序列为:5’ -CATCCATATAAAGCTATCTATATATAG-3’ (SEQ N0.1), 下游引物序列为:5’ -CTTAATTTAAGGAATGTGAGCACCT-3’ (SEQ N0.2)； (2)所述的一对特异性扩增NAIP基因的引物中， 上游引物序列为:5’ -TTGTGACTTATGAGCCGTACAGC-3’ (SEQ N0.3), 下游引物 序列为:5’ -AGGCTACAGCAGAAGCACTGAAT-3’ (SEQ N0.4)； (3)所述的一对特异性扩增参比序列的引物中， 上游引物序列为:5’ -GAACACACATGTCAGAAGTCTAAG-3’ (SEQ N0.5), 下游引物序列为:5’ -ACCTCCAGTTAGATCTTCACTTCT-3’ (SEQ N0.6)； (4)所述的特异性检测SMNl基因的荧光探针为: 5’-TTTGATTTTGTCTGAAACCCTGTAAGG-3’ (SEQ N0.7)，该探针的荧光素及其淬灭基团为5，-HEX, 3，-BHQl ； (5)所述的特异性检测SMN2基因的荧光探针为: 5’-TTTTGATTTTGTCTAAAACCCTGTAAGGA-3’ (SEQ N0.8)，该探针的荧光素及其淬灭基团为 5’ -FAM, 3’ -BHQl ； (6)所述的特异性检测NAIP基因的荧光探针为: 5 ’ -ATGGATACCACAGGAGATGGCG-3 ’ (SEQ N0.9 )，该探针的荧光素及其淬灭基团为5，-CY5, 3，-BHQ2 ； (7)所述的特异性检测参比序列的荧光探针为: 5’ -CAAATGCATCAGATTCCACAAGCT-3’ (SEQ N0.10)，该探针的荧光素及其淬灭基团为5，-ROX, 3，-BHQ2。 (8)所述的参I:匕序列为acctccagtt agatcttcac ttctaaagct aagtgagacc tgagacccatgtagacaccc aagaagcttg tggaatctga tgcatttggc ttagacttct gacatgtgtg ttc (SEQN0.14)，该序列位于 NAIP 基因端粒侧 78kb 处的 GRCh37/hgl9chr5:71107506 — 71107618区间。
2.根据权利要求1所述的一种诊断人类脊髓性肌萎缩症的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括DNA聚合酶、正常基因型对照gDNA标本、二氯化镁和dNTPs。
【文档编号】C12Q1/68GK103614477SQ201310616780
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月27日 优先权日:2013年11月27日
【发明者】徐湘民, 周万军, 李亮 申请人:南方医科大学