一种基于标准土样的土壤中假单胞菌的定量检测方法与流程

文档序号:12097947阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种基于标准土样的土壤中假单胞菌的定量检测方法,其特征在于,具体步骤如下:

a)分别制备假单胞菌浓度依次为5×107、5×106、5×105、5×104、5×103、5×102和50 CFU/mL的系列梯度标准土样;

b)分别提取系列梯度标准土样DNA及待测土样DNA;

c)分别以步骤b)中获得系列梯度标准土样DNA及待测土样DNA为模板,以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为上下游引物,进行荧光定量PCR反应;

d)根据系列梯度标准土样假单胞菌浓度的对数值和相应的阈值循环数作图,获得标准曲线:将待测土样荧光定量PCR反应结果代入标准曲线,即可获得待测土样中假单胞菌的浓度。

2.根据权利要求1所述基于标准土样的土壤中假单胞菌的定量检测方法,其特征在于,步骤c)所述荧光定量PCR反应体系为:2×SYBR Premix Ex Taq 10μL,浓度均为10μmol/L的上下游引物各0.4μL,ROX Reference Dye II 0.4μL,浓度为40-60ng/μL的模板2μL,灭菌超纯水补足至20μL;

反应程序为:95℃预变性30s;95℃变性5s,65℃退火34s,共40个循环。

3.根据权利要求1或2所述基于标准土样的土壤中假单胞菌的定量检测方法,其特征在于,所述系列梯度标准土样是这样获得的:

a) 取耕地土壤,于126℃灭菌120min,风干后即获得土样;

b)将活化后的假单胞菌接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中,37℃、160rpm摇床培养2天后,用无菌水将菌液依次稀释为5×107、5×106、5×105、5×104、5×103、5×102和50 CFU/mL,然后按照体积质量比1:5分别加入到步骤a)获得的土样中并风干,即获得假单胞菌浓度依次为5×107、5×106、5×105、5×104、5×103、5×102和50 CFU/mL的系列梯度标准土样。

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