中华蜜蜂AccCDK5基因及AccCDK5r1基因及其应用的制作方法

本发明涉及分子生物学和生物技术领域，具体涉及中华蜜蜂AccCDK5基因及其AccCDK5r1基因的克隆、重组载体的构建，并首次在中华蜜蜂中验证了AccCDK5及其激活子AccCDK5r1的互作关系，提供了AccCDK5重组蛋白体外的抗氧化能力定性研究方法。

背景技术：

细胞周期蛋白依赖性激酶-5(cyclin-dependent kinase-5,CDK5)是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,属于细胞周期蛋白依赖性激酶家族CDKs。近年来的研究表明，在哺乳动物中，CDK5并不参与细胞周期的调控，而是主要在神经系统中发挥作用，参与神经元迁移、肌动蛋白的运动、微管运输及其稳定性、细胞粘附、轴突导向、突触结构可塑性、肌细胞生成和膜运输等多种细胞活动。CDK5的功能失调和异常分布会导致神经系统障碍，并有可能导致神经退行性疾病。

非周期蛋白素蛋白p35、p39是CDK5的两个激活子，特异地分布在中枢神经系统中，因此CDK5的激酶活性的激活主要局限于神经系统中。p35具有膜锚定信号基序,从而使CDK5/p35锚定于膜上发挥作用。p35不稳定，半衰期只有20-30min，可通过泛素化途径被降解失活。此外，p35可在神经性毒性刺激的条件下裂解为p25，p25与p35都具有激活CDK5的能力，不同的是p25缺少膜锚定信号基序，从而导致CDK5/p25复合体定位发生改变，同时由于p25的半衰期要比p35长很多，致使CDK5/p25无节制地磷酸化其下游底物，最终导致一系列病理变化。此外，有文献报道，H₂O₂诱导激活CDK5可以防止细胞在氧化胁迫中死亡。

目前对于CDK5及其激活子的研究大部分集中于哺乳动物的神经性病变、肿瘤发生等病理研究及其他基础研究中，昆虫中的相关研究少有报道，在中华蜜蜂中未见相关报道。

中华蜜蜂(Apis cerana cerana)属于东方蜜蜂的一个亚种，有7000万年进化史，是我国最具优势、分布最广的本土蜂种。长期的进化过程中，中华蜜蜂对我国的气候、蜜源分布等生态环境产生了极强的适应性，具有善于利用零星蜜源植物、采集力强、抗螨及抗病能力强等优点。

中华蜜蜂具有良好的经济效益和重要的生态作用，然而由于近年来西方蜜蜂的引入、病虫害以及毁林造田、滥施农药、环境污染等因素，使中华蜜蜂蜂群数量骤减，种群延续已经受到了极为严重的威胁。

技术实现要素：

本发明的发明人针对上述现有技术的情况，提供了中华蜜蜂AccCDK5基因基因在抗氧化过程中的作用及其应用，提供了两个中华蜜蜂基因AccCDK5与AccCDK5r1的克隆及重组载体构建方法，并提供AccCDK5蛋白与AccCDK5r1蛋白互作的证据及AccCDK5重组蛋白体外的抗氧化能力定性研究方法，为中华蜜蜂优质新品种的选育提供一定的理论基础，并为中华蜜蜂神经系统相关研究提供基础。

本发明中，我们用常规方法从中华蜜蜂(Apis cerana cerana)中克隆得到AccCDK5基因及其AccCDK5r1基因，分析了两个基因的结构域并进行了进化树分析，标出了其保守结构域；构建了酵母双杂交实验相关载体，验证了其相互作用关系；构建了AccCDK5的原核表达载体，用于诱导蛋白并进行了纸片扩散实验，发现AccCDK5重组蛋白具有一定的抗氧化功能。本发明初步中华蜜蜂中AccCDK5与其激活子AccCDK5r1的互作关系，验证了AccCDK5重组蛋白的抗氧化功能。

与现有技术相比，本发明首次查找并克隆得到AccCDK5r1，并首次证明了AccCDK5r1是p35在中华蜜蜂中的同源基因，丰富了蜜蜂神经系统的研究，为研究蜜蜂神经系统发育及神经性病变提供理论基础，同时为研发蜜蜂神经疾病相关药物提供靶点。

本发明的具体技术方案是：

发明人首先提供了中华蜜蜂AccCDK5基因和AccCDK5r1基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1与SEQ ID No.3所示，前述基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2与SEQ ID No.4所示；上述序列均来源于中华蜜蜂(Apis cerana cerana)，其中AccCDK5r1蛋白为AccCDK5蛋白的激活子。

本发明提供前述基因的选择及克隆方法。具体为：

以中华蜜蜂基因组中的CDK5序列为参考，设计特异性引物，该引物对序列如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示，利用PCR技术扩增获得AccCDK5基因。以哺乳动物CDK5激活子p35、p39的氨基酸序列作为参考序列，使用本地blast(blast-2.3.0+)软件检索中华蜜蜂基因组，查找到一个未注释的蛋白，命名为AccCDK5r1，设计特异性引物，该引物对序列如SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示，利用PCR技术扩增获得AccCDK5r1基因。

将前述基因编码的氨基酸序列在GenBank进行检索并进行了序列比对分析和进化树分析，发现AccCDK5、AccCDK5r1具有高度保守性，AccCDK5r1具有CDK5激活子所特有的结构域。

获得上述基因序列后，将AccCDK5和AccCDK5r1的CDS序列分别与pGBKT7、pGADT7 AD载体连接，用于酵母双杂交实验，实验证明两者具有互作关系。将AccCDK5的CDS序列插入pET-30a(+)，构建原核表达载体，表达AccCDK5重组蛋白，用于纸片扩散实验，结果发现AccCDK5重组蛋白在体外具有一定的抗氧化作用。

之所以采取上述方法，主要是为了初步验证AccCDK5r1是AccCDK5的激活子，这样就丰富蜜蜂神经系统的研究，为研究蜜蜂神经系统发育及神经性病变提供理论基础，同时为研发蜜蜂神经疾病相关药物提供靶点。探究AccCDK5重组蛋白的体外抗氧化功能，为今后蜜蜂的转基因育种工作提供供选基因，从分子生物学角度为中华蜜蜂优质种群的选育提供基础。

综上所述，本发明提供了中华蜜蜂AccCDK5与AccCDK5r1基因，并初步证明两者的相互作用关系，证明了AccCDK5重组蛋白的体外抗氧化功能，对研究中华蜜蜂抗逆分子生物学、蜜蜂神经系统的研究及中华蜜蜂优质蜂群选育有重要意义。

附图说明

图1为AccCDK5及AccCDK5r1CDS的PCR扩增电泳图；

图中A：AccCDK5的CDS片段；B：AccCDK5r1的CDS片段；Marker为DL 2000 DNA Maker，各条带分别为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；结果表明，扩增片段大小正确；

图2为AccCDK5及AccCDK5r1的氨基酸序列与几种其它CDK5及CDK5r1氨基酸序列的比较结果，其中相同的氨基酸用黑底表示，保守结构域用黑框标出；

图中A:AccCDK5与其它CDK5的氨基酸序列比对结果；B:AccCDK5r1与其它几种昆虫CDK5r1的氨基酸序列比对结果；结果表明，AccCDK5在物种间具有较高保守性，AccCDK5r1在昆虫中保守性很高，两个基因均具有各自的保守结构域；

图3为AccCDK5及AccCDK5r1的进化树临近法分析结果示意图；

图中AccCDK5及AccCDK5r1用方框标出，其中A:AccCDK5进化树分析结果；B：AccCDK5r1与进化树分析结果；结果表明，这两个基因与意大利蜜蜂中的对应基因进化关系最近；

图4为AccCDK5及AccCDK5r1的酵母双杂交实验结果；

图中A：AccCDK5-BD自激活检测；B:AccCDK5-BD毒性检测；C:酵母双杂交实验。结果表明，AccCDK5-BD无毒性，无自激活现象，AccCDK5与AccCDK5r1互作。

图5为纸片扩散实验：过氧化氢异丙苯处理条件下的纸片扩散实验结果示意图；

图中序号1为灭菌ddH₂O对照，序号2-5浓度依次增大；结果表明，AccCDK5重组蛋白具有抗氧化功能。

具体实施方式

以下实施例中进一步定义本发明，根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。除特殊注明外，本发明所采用的均为本领域现有技术。

实施例1：华蜜蜂AccCDK5及AccCDK5r1基因的克隆

以中华蜜蜂cDNA为模板，用正向引物(其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示)和反向引物(其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示)扩增AccCDK5片段，反应程序如下:94℃预变性10min→(94℃40s，52℃40s)×35cycles→72℃1min→72℃10min。

以哺乳动物CDK5激活子p35、p39的氨基酸序列作为参考序列，设计AccCDK5r1特异性引物以中华蜜蜂cDNA为模板，用上述设计获得的正向引物(其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.7所示)和反向引物(其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.8所示)扩增AccCDK5r1片段，反应程序如下:

94℃预变性10min→(94℃40s，55℃40s)×35cycles→72℃1min→72℃10min。

上述PCR反应结束后，1.0％琼脂糖凝胶电泳电泳检测PCR产物并回收正确片段(如图1所示)，与载体pEASY-T1 simple连接后测序验证。

得到的中华蜜蜂AccCDK5基因和AccCDK5r1基因其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1与SEQ ID No.3所示，前述基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2与SEQ ID No.4所示，将前述基因编码的氨基酸序列在GenBank进行检索并使用DNAman软件进行了序列比对分析(如图2所示)，利用MEGA软件了进化树分析(如图3所示)，结果表明AccCDK5、AccCDK5r1具有较高的保守性，并与意大利蜜蜂的CDK5、CDK5r1进化关系最近。

实施例2：重组载体构建

得到AccCDK5及AccCDK5r1基因的核苷酸序列后，首先构建了酵母双杂交实验所需重组载体和AccCDK5原核表达载体：

首先构建了AccCDK5-BD重组载体：以上述测序正确的质粒为模板，用正向引物，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.9所示(5′-CATATGATGCAAAAATATGAGAAACTCGAG-3′，划线部分为Nde I酶切位点)和反向引物，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.10所示(5′-GGATCCCTGACAACGATCGTTTTTAATGG-3′，划线部分为BamH I酶切位点)扩增AccCDK5片段。

反应结束后，对PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化目的片段，与载体pEASY-T1 simple连接后测序验证。将测序正确的质粒用Nde I和BamH I进行酶切，与经相同酶切的载体pGBKT7连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，选取阳性克隆提取质粒酶切验证，至此AccCDK5-BD重组载体构建完成。

按照上述方法，用正向引物，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.11所示(5′-GGATCCATGCAAAAATATGAGAAACTCGAG-3′，划线部分为BamH I酶切位点)和反向引物，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.12所示(5′-GTCGACCTGACAACGATCGTTTTTAATGG-3′，划线部分为Sal I酶切位点)扩增片段，pET-30a(+)连接与构建了AccCDK5原核表达载体；

用正向引物，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.13所示(5′-CATATGATGGGTACCGTGTTGTCGTTC-3′，划线部分为Nde I酶切位点)和反向引物，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.14所示(5′-GAGCTCAGCCGCCTTGGTGGGTAC-3′，划线部分为Sac I酶切位点)扩增AccCDK5r1片段，与pGADT7 AD载体连接，构建了AccCDK5r1-AD重组载体。

实施例3：酵双杂交实验

本发明酵母双杂交采用Matchmaker GoldYeast Two-Hybrid System，本实验共分为三个部分。

首先进行了AccCDK5-BD重组载体自激活检测。分别将转入pGBKT7空载体，AccCDK5-BD重组载体的酵母菌共同涂布于SD/-Trp/-His固体培养基与SD/-Trp/-Ade固体培养基，结果表明都不生长，证明AccCDK5-BD重组载体无自激活现象(如图4A所示)。

然后进行了AccCDK5-BD重组载体毒性检测。将分别将转入pGBKT7空载体，AccCDK5-BD重组载体的酵母感受态细胞共同涂布于SD/-Trp固体培养基，结果表明两者长势相同，证明AccCDK5-BD重组载体无毒性(如图4B所示)。

在确定AccCDK5-BD重组载体无毒性和自激活后，进行了AccCDK5与AccCDK5r1蛋白相互作用的检测。结果表明转化AccCDK5-BD与AccCDK5r1-AD重组载体的酵母感受态在SD/Leu/-Trp与SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp固体培养基上均可生长，将阳性菌落在含有X-α-gal的SD/Ade/-His/-Leu/-Trp固体培养基，进行第二次筛选，进一步确认了AccCDK5与AccCDK5r1互作(如图4C所示)。

此过程中的阳性对照组合为pGBKT7-53+pGADT7-T，阴性对照为pGBKT7-lam+pGADT7-T。

实施例4：AcCDK5重组蛋白的原核表达

将实施例2中构建好的AccCDK5-pET-30a(+)原核表达载体转化Trans BL21(DE3)化学感受态细胞，鉴定出阳性克隆后在IPTG终浓度为75μg/mL、28℃条件下诱导蛋白，取未加IPTG的菌液作为对照。诱导完成后离心，将上清去除干净后加入蛋白上样缓冲液，混匀后煮沸10min，蛋白变性后用12％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行检测。结果表明，在此诱导条件下，AccCDK5重组蛋白诱导成功，可以进行纸片扩散实验。

实施例5：AccCDK5重组蛋白抗氧化能力分析

本研究利用纸片扩散实验在大肠杆菌中表达AccCDK5重组蛋白来检测AccCDK5蛋白在体外的功能，以转化pET-30a(+)空载的大肠杆菌作为对照。

分别转化有AccCDK5-pET-30a(+)重组载体与pET-30a(+)空载体的Trans BL21(DE3)细胞涂布于含卡那霉素(50mg/L)的LB固体培养基上培养(细胞数约为5×10⁸)，37℃静置1h后将滤纸片(直径7mm)贴于培养基上，在滤纸片上分别滴加3μl不同浓度的过氧化氢异丙苯，以灭菌ddH₂O作为对照。37℃倒置培养24h，观察抑菌圈大小。

纸片扩散实验实验结果表明(如图5所示)，AccCDK5重组蛋白提高了大肠杆菌抗氧化的能力。

<110>山东农业大学

<120>中华蜜蜂AccCDK5基因及AccCDK5r1基因及其应用

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<212>DNA

<213>中华蜜蜂

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<213>中华蜜蜂

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Ile Glu Asp Ser Lys Asp Lys Phe Trp Asp Arg Cys Leu Leu Ile Val

290 295 300

Asn Arg Leu Ser Ser Glu Met Leu Arg Ile Asn Ser Glu Pro Gly Phe

305 310 315 320

Phe Thr Glu Val Phe Thr Glu Leu Lys Ala Cys Gly Ala Gly Asp Arg

325 330 335

Gly Ser Leu Pro Gly Thr Gly Leu Glu Arg Ser Leu Val Val Ser Gly

340 345 350

Val Ala Val Pro Thr Lys Ala Ala

355 360

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

cgctaaccac ttttcattat tccgc 25

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

ggtcgttgca ctactcgcg 19

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

gccaccacca ccgcctcaac 20

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

cgaggtcgat gcggaggggt c 21

<210>9

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

catatgatgc aaaaatatga gaaactcgag 30

<210>10

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

ggatccctga caacgatcgt ttttaatgg 29

<210>11

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

ggatccatgc aaaaatatga gaaactcgag 30

<210>12

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

gtcgacctga caacgatcgt ttttaatgg 29

<210>13

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

catatgatgg gtaccgtgtt gtcgttc 27

<210>14

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

gagctcagcc gccttggtgg gtac 24