一种瓦氏葡萄球菌及其应用的制作方法

本发明属于环境应用微生物领域，具体涉及了一种瓦氏葡萄球菌及其应用；具体涉及在铜污染土壤修复方面的应用。

背景技术：

铜矿是一种重要的金属矿产，具有悠久的开发历史，为工业发展提供了大量的资源。但是，由于以往环保措施不足，铜矿开采和冶炼过程中对周边环境产生了污染，铜成为了矿区周边土壤中主要的污染物，破坏了该区域的环境质量，也危害了生态和人体健康。因此，治理铜污染仍是世界各国环境热点研究问题之一。

迄今为止，土壤铜污染治理的方法包括物理方法、化学方法、生物方法等。物理方法包括换土、淋洗等措施，能在较短时间内减少土壤铜含量，但需要大量费用，且容易造成二次污染。化学方法有添加改良剂如矿物和有机质等，可降低土壤铜活性，但大量施用可能影响土壤孔隙度、持水量、pH等理化性状。生物方法则是利用生物本身的代谢过程，改变土壤铜的赋存形态，减少铜的毒性，阻断铜进入食物链，达到无害化处理的目的。

铜矿环境中存在着多种抗铜细菌，数量多、生长快，是近年来环境铜污染生物修复研究的主要对象。这些细菌在经过分离、培养和驯化后，能与适当的工艺相结合，构建出修复土壤铜污染的技术体系，在铜矿环境整治和生态恢复方面具有良好的应用前景。

技术实现要素：

发明目的：为了解决现有技术中存在的问题，本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种瓦氏葡萄球菌。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种瓦氏葡萄球菌的应用。

本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种应用菌剂。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种瓦氏葡萄球菌，其分类命名为瓦氏葡萄球菌KR809427(Straphylococcus warneri KR809427)，保藏编号为CCTCC NO:M 2016599，该菌株已于2016年10月31日保藏于中国典型培养物保藏中心。保藏地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心，邮编：430072。

其中，上述瓦氏葡萄球菌的筛选方法包括以下步骤：

1)土壤细菌的提取：取铜污染土壤添加到无菌水中悬浮得到细菌培养液；

2)耐铜细菌的初步筛选：配置细菌基础培养基LB培养基，其中添加硫酸铜溶液，灭菌，冷却后得到含铜的LB固体培养基，取细菌培养液涂布接种于LB固体培养基平板上；

3)耐铜细菌的进一步筛选：制备含有200mg/L和300mg/L铜浓度的LB固体培养基，根据步骤2)平板上菌落的形态和颜色性状，挑取菌落划线依次接种于200mg/L和300mg/L的含铜固体平板培养基上，从形成的菌落中得到耐铜细菌；

4)菌株的纯化：从含有300mg/L铜浓度的LB固体培养基中挑取细菌，划线接种到不含铜的LB固体培养基上，再进行多次划线，直到获得瓦氏葡萄球菌CCTCC NO:M 2016599。

上述的瓦氏葡萄球菌CCTCC NO:M 2016599在提高土壤pH值中的应用。

其中，上述土壤为酸性土壤。

上述的瓦氏葡萄球菌CCTCC NO:M 2016599在钝化土壤中铜活性方面的应用。

上述的应用，钝化土壤中铜活性的具体方法为：将瓦氏葡萄球菌CCTCC NO:M 2016599接种到LB液体培养基中，震荡培养得到细菌培养液；称取风干铜污染土壤到锥形瓶中，灭菌；取细菌培养液于锥形瓶中，对照组为不含细菌的LB液体培养基；震荡培养，之后添加氯化钙溶液提取土壤中的有效铜，震荡，离心，用滤膜过滤，制样，ICP测定，计算土壤中有效铜含量。

一种应用菌剂，将所述的瓦氏葡萄球菌CCTCC NO:M 2016599接种于LB培养基中培养得到的菌体即为瓦氏葡萄球菌的应用菌剂。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：本发明的瓦氏葡萄球菌CCTCC NO:M 2016599生长迅速(8h之内进入对数期)，具有较强的耐铜(能在含有100mg/L铜的液体LB培养基中生长)、耐酸碱(能在pH 4～10的培养基中生长)、耐盐(可在盐度高达5％的培养基中生长)能力，并且能显著提高培养介质的pH值、降低土壤有效铜的含量，因此对于不同类型铜污染土壤具有较好的修复潜力。

附图说明

图1为瓦氏葡萄球菌CCTCC NO:M 2016599的16SrRNA鉴定结果；

图2为瓦氏葡萄球菌CCTCC NO:M 2016599的平板形态；

图3为瓦氏葡萄球菌CCTCC NO:M 2016599在显微镜下的菌落形态；

图4为瓦氏葡萄球菌CCTCC NO:M 2016599的扫描电镜照片；

图5为本发明有机碳标准曲线；

图6为瓦氏葡萄球菌CCTCC NO：M 2016599在不同铜含量的LB培养基中的生长情况；

图7为瓦氏葡萄球菌CCTCC NO：M 2016599在不同pH的LB培养基中的生长情况；

图8为瓦氏葡萄球菌CCTCC NO：M 2016599在不同NaCl含量的LB培养基中的生长情况。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明进一步说明，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。

实施例1：

1.材料准备

(1)菌源：分离自马鞍山境内铜矿

(2)LB培养基：胰蛋白胨10.0g/L；酵母粉5.0g/L；氯化钠10.0g/L；培养基均在121℃条件下灭菌20min；以上培养基制备固体平板时添加2％的琼脂。

(3)铜污染土壤样品：江西德兴铜矿排土场土样、冬瓜山土样、已种植蒲公英土壤、酸模土壤和铜草土壤，铜含量范围125～18100mg/kg。

2、细菌的筛选

1)瓦氏葡萄球菌CCTCC NO:M 2016599(耐铜细菌)的筛选

1)土壤细菌的提取：取1g采自马鞍山境内铜矿周边土壤添加到9mL无菌水中悬浮，培养条件30℃，摇床速度180r/min，培养24h。

2)耐铜细菌的初步筛选：配置细菌基础培养基(LB)，其中添加硫酸铜溶液到100mg/L，灭菌，冷却后得到LB固体培养基，取200μL细菌培养液涂布接种于LB固体培养基平板上。

3)耐铜细菌的进一步筛选：制备含有200mg/L和300mg/L铜浓度的LB固体培养基，根据之前步骤2)的LB固体培养基平板上菌落的形态(圆形、凸起等)和颜色(白色、黄色等)等性状，挑取菌落划线依次接种于200mg/L和300mg/L的含铜LB固体培养基平板上，从形成的菌落中得到耐铜细菌。

4)菌株的纯化：从含有300mg/L铜离子浓度的LB固体培养基中挑取细菌，划线接种到不含金属离子的LB固体培养基上，再进行四次划线，直到获得瓦氏葡萄球菌CCTCC NO:M 2016599。

实施例2：细菌的鉴定

1、细菌总DNA的提取

使用细菌基因组DNA提取试剂盒(南京华普生物科技有限公司)提取细菌基因组DNA，按照说明书操作步骤进行。

2、PCR扩增目的基因片段

采用16SrRNA序列分析法，PCR扩增采用细菌16SrRNA通用引物：

27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')；

1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')；PCR反应体系共50μL：

表1PCR的反应体系的配制

3、按表1的PCR反应体系加入到PCR管中，反应液离心混匀后，置于PCR反应仪中，PCR的运行程序为：①94℃预变性10min；②94℃变性45s；③55℃退火45s；④72℃延伸90s；⑤重复步骤②～④29次，共30个循环；⑥72℃彻底延伸10min。反应结束后，得到PCR反应，PCR产物测序由南京金斯瑞有限公司完成。

4、序列分析与数据处理

将所测16SrDNA序列用BLAST软件与GenBank中已登录的16S rDNA基因序列进行同源性比较(GenBank:KX898578.1)，发现菌株与瓦氏葡萄球菌(Straphylococcus warneri)的相似性为100％，鉴定其为瓦氏葡萄球菌KR809427(Straphylococcus warneri KR809427，图1)。该菌株的16SrDNA序列如SEQ ID No.1所示。

5、瓦氏葡萄球菌形态，生理和生化特征。

(1)瓦氏葡萄球菌菌落形态特征：平板照片(图2)、革兰氏染色后显微镜观察(图3)、扫描电镜照片(图4)。

(2)瓦氏葡萄球菌菌落生理生化特征(表1)

表1

注：+表示阳性，-表示阴性。

实施例3：本发明的瓦氏葡萄球菌CCTCC NO:M 2016599对土壤pH和土壤有效铜的影响

1、供试土壤的部分理化性状的测定

1)土壤pH测定：10g土样(江西德兴铜矿排土场土样、冬瓜山土样、已种植蒲公英土壤、酸模土壤和铜草土壤)加25mL纯水，震荡2h，静置半小时，用pH计测量。

2)、土壤有机质测定

试剂：2A、重铬酸钾溶液(K2Cr2O7)＝0.8000mol/L：39.2245g加400mL水，加热溶解，冷却后定容至1L。

2B、浓硫酸(分析纯，浓度98％，密度1.84g/cm³)

2C、有机碳标准溶液：葡萄糖1.375g定容至100mL。

测量方法：分别称取通过100目筛的风干土样(江西德兴铜矿排土场土样(A)、江西德兴铜矿排土场土样(C)、冬瓜山土样、已种植蒲公英土壤、酸模土壤和铜草土壤)各1g，于6个50mL烧杯中，加3.0mL水充分摇散，加入10mL0.8000mol/L的重铬酸钾溶液，然后加入10mL浓硫酸，并不断震荡，停放20min，加10mL水摇匀，静置或过夜，取上清液15mL于50mL容量瓶(或吸取3mL于10mL容量管中)，加水至刻度，充分摇匀，用1cm比色杯在590nm下测吸光度。

标准曲线：

吸取有机碳标准溶液(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL)分别放入50mL高型烧杯中，有机碳分别为(2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0mg)，补加水至3.0mL，然后按上述土壤有机碳测定步骤同样操作，制作标准曲线，参见图5。

3)土壤有效态铜测定

试剂：3A、0.1moL/L的氯化钙溶液：称取11.11g无水氯化钙，加水稀释到1L。

3B、LB液体培养基：胰蛋白胨10.0g/L；酵母粉5.0g/L；氯化钠10.0g/L。

测定方法：瓦氏葡萄球菌CCTCC NO:M 2016599接种到LB液体培养基中，震荡培养24h得到细菌培养液；分别称取5g供试的风干土壤(江西德兴铜矿排土场土样(A)、江西德兴铜矿排土场土样(C)、冬瓜山土样、已种植蒲公英土壤、酸模土壤和铜草土壤)到6个50mL的锥形瓶中，灭菌；分别取5mL的细菌培养液于锥形瓶中，同时，分别设置对照组为不含细菌的LB液体培养基；震荡培养24h，培养条件为30℃，180r/min，之后添加25mL的氯化钙溶液，震荡2h，离心5min，用0.22μm的滤膜过滤，制样，用ICP测定，计算土壤有效铜含量。

有效铜含量的计算公式为：

Cu有效态为有效态铜含量(mg/kg)；

C为ICP测出的样品铜浓度(mg/L)；

V为土壤样品提取液体积(mL)；

m为称取的土壤样品质量(g)；

4)土壤总铜测定

消解及测定方法：

仪器：重金属消解仪(济南海能仪器有限公司)；ICP-AES(美国Perkin-Elmer)

试剂：

4A.盐酸(HCl)：ρ＝1.19g/mL，优级纯

4B.硝酸(HNO3)：ρ＝1.42g/mL，优级纯

4C.氢氟酸(HF)：ρ＝1.49g/mL

4D.高氯酸(HClO4)：ρ＝1.68g/mL，优级纯

步骤：

4-1、分别称取土壤样品(江西德兴铜矿排土场土样(A)、江西德兴铜矿排土场土样(C)、冬瓜山土样、已种植蒲公英土壤、酸模土壤和铜草土壤)0.5g于聚四氟乙烯消解管中，加入10mL盐酸HCl，插入消解孔中。

4-2、设定消解仪温度为100℃，加热至样品剩余少量后取下冷却。

4-3、加入5mL硝酸HNO3、5mL氢氟酸HF、3mL高氯酸HClO4，加盖。

4-4、设定消解仪温度为170℃，升温加热约1h，冷却后开盖。

4-5、继续加热挥硅，升温到200℃，待冒浓白烟蒸至少量后，取下冷却，液体呈透明。

4-6、将管内液体移至50ml容量瓶，用去离子水冲洗3-4遍后定容。

4-7、定容后溶液用0.22μm滤器过滤，ICP测定。

总铜的计算公式：

Cu总量总铜含量(mg/kg)

C为ICP测出的铜浓度(mg/kg)

V为消解之后定容的体积(mL)

m为称取的土壤样品质量(g)

通过测试得到表2中的相关理化性质的数据：

表2供试土壤部分理化性状

2、瓦氏葡萄球菌CCTCC NO:M 2016599对土壤pH值和有效铜含量的影响

2-1、添加瓦氏葡萄球菌CCTCC NO:M 2016599后土壤pH测定

添加瓦氏葡萄球菌CCTCC NO:M 2016599于LB液体培养基中，震荡培养24h得到细菌培养液。分别称取10g灭菌后的供试的土壤样品(江西德兴铜矿排土场土样(A)、江西德兴铜矿排土场土样(C)、冬瓜山土样、已种植蒲公英土壤、酸模土壤和铜草土壤)置于6个50mL锥形瓶中，添加25mL细菌培养液(约2×10⁹cfu/mL)；设置的对照组为不含细菌的LB液体培养基，震荡36h，静置半小时，用pH计测量。

表3显示，添加瓦氏葡萄球菌CCTCC NO:M 2016599对供试的6种土壤的pH值均有增加作用。

表3添加瓦氏葡萄球菌CCTCC NO:M 2016599对土壤pH的影响

2-2、瓦氏葡萄球菌CCTCC NO:M 2016599对土壤有效铜含量的影响

瓦氏葡萄球菌CCTCC NO:M 2016599对土壤有效态铜影响的测定方法

试剂：1、0.1moL/L的氯化钙溶液：称取11.11g无水氯化钙，加水稀释到1L；

2、LB液体培养基：胰蛋白胨10.0g/L；酵母粉5.0g/L；氯化钠10.0g/L；

测定方法：

瓦氏葡萄球菌CCTCC NO:M 2016599接种到LB肉汤培养基中，震荡培养24h得到细菌培养液；分别称取5g供试的土壤样品(江西德兴铜矿排土场土样(A)、江西德兴铜矿排土场土样(C)、冬瓜山土样、已种植蒲公英土壤、酸模土壤和铜草土壤)到6个50mL的锥形瓶中，灭菌；分别取5mL的细菌培养液于锥形瓶中(约10⁸cfu/mL)，设置的对照组为不含细菌的LB液体培养基；震荡培养24h，培养条件为30℃，180r/min，之后添加25mL的氯化钙溶液，震荡2h，离心5min，用0.22μm的滤膜过滤，制样，用ICP测定。

表4显示，添加瓦氏葡萄球菌CCTCC NO:M 2016599对供试的6种土壤的有效铜含量均有降低作用。

表4添加瓦氏葡萄球菌CCTCC NO：M 2016599对土壤有效铜的影响

实施例4：瓦氏葡萄球菌CCTCC NO:M 2016599在不同铜含量的LB培养基中的生长情况。

2mL瓦氏葡萄球菌CCTCC NO:M 2016599接种到含有0、100、200mg/L铜的LB液体培养基中，接种量为1.8×10⁹cfu/mL，以不加细菌为对照。之后在2、4、6、20、24h测定OD600值(图6)，结果显示，当LB培养基中铜的浓度达到100mg/L时，瓦氏葡萄球菌CCTCC NO:M 2016599仍然可以在2h后开始生长，说明菌株具有较强的抗铜毒害的能力。

实施例5：瓦氏葡萄球菌CCTCC NO:M 2016599在不同pH的LB培养基中的生长情况。

1mL瓦氏葡萄球菌CCTCC NO:M 2016599分别接种到pH为4、6、8、10的LB液体培养基中，接种量为8×10⁸cfu/mL。之后在2、4、8、12、24、48h测定OD600值(图7)，结果显示，当LB培养基pH为6、8时，瓦氏葡萄球菌CCTCC NO:M 2016599生长最快且差异不大；pH为4、10时，瓦氏葡萄球菌CCTCC NO:M 2016599生物量下降，但仍能生长。说明瓦氏葡萄球菌CCTCC NO:M 2016599能在较宽的酸碱度范围内生长。

实施例6：瓦氏葡萄球菌CCTCC NO：M 2016599在不同NaCl含量的LB培养基中的生长情况。

1mL瓦氏葡萄球菌CCTCC NO：M 2016599接种到NaCl含量为1％、2％、3％、4％、5％的LB液体培养基中，接种量为8×10⁸cfu/mL。之后在2、4、8、12、24、48h测定OD600值(图8)，结果显示，随着LB液体培养基中NaCl含量的升高，瓦氏葡萄球菌CCTCC NO:M 2016599生长量有所下降，但差异不大；当LB培养基NaCl含量为1％、2％时，瓦氏葡萄球菌CCTCC NO:M 2016599生长最好；当NaCl含量增加到4％、5％时，瓦氏葡萄球菌CCTCC NO:M 2016599仍能生长，说明瓦氏葡萄球菌CCTCC NO:M 2016599能耐受较高的盐胁迫。

上述仅为本发明优选的实施例，并不限制于本发明。对于所属领域的技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施例来举例说明。而由此方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110>中钢集团马鞍山矿山研究院有限公司、南京农业大学

<120> 一种瓦氏葡萄球菌及其应用

<130> SG20161121001

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1418

<212> DNA

<213> 瓦氏葡萄球菌（Straphylococcus warneri）

<400> 1

gcaagtcgag cgaacagata aggagcttgc tcctttgacg ttagcggcgg acgggtgagt 60

aacacgtgga taacctacct ataagactgg gataacttcg ggaaaccgga gctaataccg 120

gataacatat tgaaccgcat ggttcaatag tgaaaggcgg ctttgctgtc acttatagat 180

ggatccgcgc cgtattagct agttggtaag gtaacggctt accaaggcaa cgatacgtag 240

ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg aactgagaca cggtccagac tcctacggga 300

ggcagcagta gggaatcttc cgcaatgggc gaaagcctga cggagcaacg ccgcgtgagt 360

gatgaaggtc ttcggatcgt aaaactctgt tatcagggaa gaacaaatgt gtaagtaact 420

gtgcacatct tgacggtacc tgatcagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg 480

gtaatacgta ggtggcaagc gttatccgga attattgggc gtaaagcgcg cgtaggcggt 540

tttttaagtc tgatgtgaaa gcccacggct caaccgtgga gggtcattgg aaactggaaa 600

acttgagtgc agaagaggaa agtggaattc catgtgtagc ggtgaaatgc gcagagatat 660

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gtgttagggg gtttccgccc cttagtgctg cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg 840

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atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccaaa tcttgacatc ctttgaccgc 960

tctagagata gagtcttccc cttcggggga caaagtgaca ggtggtgcat ggttgtcgtc 1020

agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt aagcttagtt 1080

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atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgat ttgggctaca cacgtgctac aatggacaat 1200

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tgtagtctgc aactcgacta catgaagctg gaatcgctag taatcgtaga tcagcatgct 1320

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acccgaagcc ggtggagtaa ccatttatgg agctagcc 1418

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

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