一种源于晚期胃印戒细胞癌细胞株及其建立方法和应用与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种源于人晚期胃印戒细胞癌的细胞株及其建立方法和应用。

背景技术：

胃癌是严重危害人民群众健康的消化道恶性肿瘤。据文献报道，全世界范围内，胃癌新发病例989,600人，占全世界癌症新发病人数的8％；由胃癌导致的相关死亡人数738,000人，占全世界癌症死亡人数的10％。超过70％的新发病例及死亡病例发生在发展中国家。东亚地区胃癌发病率居世界第一。我国是胃癌的高发地区，每年新发胃癌患者达30～40万人，死亡人数达30万人，占恶性肿瘤死亡人数的23％。近年来，胃癌的发病年龄具有年轻化趋势，过去以40岁～60岁年龄组居多，现在则以35岁～55岁年龄组为多。

肿瘤细胞系/株的建立，为进一步研究肿瘤发生、浸润转移机制﹑抗癌药物筛选等提供了方便和相对价廉的细胞模型。目前世界范围内报道的胃癌细胞系已经不少，例如：日本的MKN-1、MKN-28、MKN-45、MKN-74等9株；韩国的SNU-1、SNU-5、SNU-16等16株；美国ATCC是比较权威的细胞库，常销售的胃癌细胞株有6株，其中4株来源日本南韩的亚裔人群。中国是胃癌高发国家，但目前只有三株胃癌细胞被广泛利用作为肿瘤发生机制的深入研究，分别是BGC823、SGC-7901和MGC803，而且它们已被传代了20-30年。因此，更多地建立新的我国特色的胃癌细胞株，并利用其进行我国胃癌发病机制的研究尤为重要。

胃印戒细胞癌是胃癌中的一种特殊类型，以细胞黏液分泌为特点，与其他组织学类型胃癌相比，印戒细胞癌多呈弥漫浸润性生长，好发于年轻女性、侵袭力强、预后差。由于胃印戒细胞癌在超微结构、病理表现、功能分化表型、等相关肿瘤分子生物学方面均有其特殊性。目前在有限的胃癌细胞株中，胃印戒细胞癌细胞株实为稀有，因此迫切需要寻找典型的胃印戒细胞癌细胞，用于进行胃癌发生、浸润转移机制的深入研究。

由于肿瘤具有异质性、复杂性、以及由不同种族和地域带来的差异性等特点，即使是用相同肿瘤原代培养建立起来的细胞系/株，因其背景来源不同，得出的相关研究也可能不能完全反映相应疾病的全部特点。而且，许多肿瘤细胞系/株会随培养时间的延长或培养环境的变化而发生特性改变，甚至完全失去其本来特性，特别是大多数胃癌细胞系/株受限于成瘤率低或均一性差等问题，难以应用于大规模异种移植瘤模型的药物筛选。因此，不断进行肿瘤细胞原代培养研究，建立更多的胃癌细胞系/株是非常必要的。

技术实现要素：

针对上述我国人胃癌细胞系/株生物多样性低，与临床胃癌的生物学性状相差较大等不足，本发明目的在于提供一种新的源于晚期胃印戒细胞癌细胞株gc-006-03。该细胞株保藏在中国典型培养物保藏中心(地址：中国湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心)，保藏编号为CCTCC NO：C2016152，保藏日期为2016年8月9日，分类命名：人胃印戒细胞癌细胞株。

本发明gc-006-03细胞株其性状稳定，可稳定传代>100代，成瘤率高，潜伏期短，均一性好，为胃癌研究提供了一种新的临床肿瘤生物学特性的实验材料。

本发明的细胞株取自一名55岁女性胃印戒细胞癌患者的腹水，采用percoll溶液分离技术，经体外细胞扩增传代培养，建立胃印戒细胞癌细胞系gc-006。在分离细胞株时，采用先低浓度细胞在大平皿中生长，培养7-10天后，细胞生长旺盛，而且成分散的单克隆状，再行挑选单克隆细胞。被挑选的克隆先在poly-L-sine包被的24孔板中培养，使细胞容易贴壁成活。进而获得高纯度的细胞株，命名为gc-006-03。

该细胞株具有以下生物学特性：

1、细胞贴壁生长，无接触抑制，呈叠加生长；

2、细胞倍增时间接近36小时；

3、细胞株具有很强的克隆形成能力，琼脂集落形成率为70％；种板效率88％；

4、细胞免疫组化结果显示：本细胞呈角蛋白(+++)、波形蛋白(-)、ck7(2+)、ck20(-)、ttf1(-)、Li-cad(+)、cdx2(2+)、CEA(3+)、Ki-67染色阳性率约45％；

5﹑流式检测CD326⁺>98％：该结果显示gc-006-03是上皮源细胞，及其它的高度均一性。

6、染色体分析提示：本株细胞为稳定的亚三倍体细胞株，染色体分布在38-54，亚三倍体占82.9％，其中50、51、52、53条染色体的细胞占58.5％，具有双着丝点，异位及衍生现象；

7、成瘤率高：裸鼠接种本细胞5只后全部成瘤；

8﹑短串联重复序列(short tandem repeat，STR)结果：

该结果在与ATCC﹑DSMZ﹑JCRB和国家实验资源细胞共享平台中进行细胞STR比对，均未发现gc-006-03的同源细胞。说明该细胞是唯一的。

本发明另一目的在于提供一种分离贴壁生长的单细胞株的方法，所述方法包括如下步骤：1.胰酶消化：新细胞系胰酶消化需摸索试验条件，如胰酶浓度和消化时间。因为,过度消化则影响细胞活性，消化不够则细胞成团；2.终止消化：待细胞变圆，轻拍培养瓶，使细胞脱落。迅速加入10-20倍的含血清培养基或HBSS液(含钙镁的Hank’s液)终止消化；3.接种细胞：根据预测的克隆形成率，将候选细胞做系列稀释，以100-2000个/皿的范围分别接种在几个10cm中，轻轻吹打分散；4.培养：细胞置2-10％CO2，95湿度，37℃培养7-15天，一般不需要换液，此时细胞呈分散的单克隆状，并且生长富有活力；5.挑选单克隆：集落形成过程中定期用显微镜观察，确定其克隆起源，选择克隆比较分散的区域，做好记号，去除部分培养液，用1ml枪头直接挑取克隆，无需加胰酶,以减少对细胞的损伤；6.扩增培养：挑取目的克隆先接种于poly-L-sine包被的24孔板中进行培养，这样细胞易贴壁成活。每隔3-5天进行半量换液，细胞长满瓶底的80-90％及时传代，然后逐渐扩增培养，形成足够量的单克隆细胞株。

常规分离细胞株均采用微量滴定培养板进行克隆，然而微量滴定培养板操作繁杂，而且细胞在单一个体时不易成活。本发明的方法采取先将gc-006细胞系的细胞做系列稀释，以100-2000个/皿的范围分别接种在5个10cm中，以10％胎牛血清的1640培养基进行培养，置37℃，5％CO2培养箱中培养7-10天。此时细胞呈分散的单克隆状，并且生长旺盛。这时再进行精准单克隆细胞挑选，挑取克隆时无需加胰酶，尽可能减少细胞损伤。挑出的克隆细胞先在poly-L-sine包被的24孔板中培养，使细胞易贴壁成活。然后逐渐扩增培养。通过上述方法，成功地建立了本发明的能够连续传代的高纯度的胃印戒细胞癌细胞株gc-006-03。

本发明还有一个目的在于提供gc-006-03胃印戒细胞癌细胞株的应用。所述应用包括但不限于：体外或体内(动物)筛选防治胃癌药物；研究胃癌的发生机理；建立胃癌发生、发展或转移的细胞模型；建立胃癌动物模型；研究胃癌分化机制、细胞形态及功能异常、肿瘤浸润转移机制和指导临床综合诊治的细胞模型。模型的建立方法和具体应用都是本领域已知的，可根据具体情形设计使用。

本发明的有益效果如下：通过提供一种新型稳定传代的胃印戒细胞癌细胞株gc-006-03，为今后研究胃印戒细胞癌的发生、发展转移，进而揭示胃印戒细胞癌的发病机制提供一定的研究线索和实验模型。同时，建立gc-006-03细胞株不仅为胃癌分子生物学、免疫学及临床综合诊治等研究提供了有利条件，而且为筛选防治胃癌药物提供了方便的平台。此外，本发明所采用的分离贴壁生长细胞株的方法成活率高，对形成克隆较弱的贴壁生长细胞分离会有较明显的帮助。

附图说明

为让本发明的上述和其他目的、特征、优点与实施例子能更明显易懂，对所附图的说明如下：

图1为gc-006-03生长状态在相差显微镜下的形态学观察图(×40)。

图2为gc-006-03的HE染色形态图(X100)。

图3为gc-006-03透射电镜形态图(X10000)。

图4为gc-006-03角蛋白免疫组化阳性(X20)。

图5为gc-006-03波形蛋白免疫组化阴性(X20)。

图6为gc-006-03的ck7免疫组化阳性(X20)。

图7为gc-006-03的ck20免疫组化阴性(X20)。

图8为gc-006-03的ttf1免疫组化阴性(X20)。

图9为gc-006-03的Li-cad免疫组化阳性(X20)。

图10为gc-006-03的cdx2免疫组化阳性(X20)。

图11为gc-006-03的CEA免疫组化呈强阳性(X20)。

图12为gc-006-03的ki-67免疫组化阳性率约45％(X20)。

图13为gc-006-03的细胞生长曲线：横坐标为时间(小时)，纵坐标为融合度(％)。

图14为gc-06-03的种板效率结晶紫染色图。

图15a和15b为gc-006-03染色体核型分析图。

图16为gc-006-03的免疫缺陷小鼠体内成瘤性实验结果。

图17为gc-006-03的裸鼠体内成瘤标本切片HE染色图(X100)。

图18为本患者胃肿瘤组织活检切片HE染色图片(X40)。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚，以下结合附图及具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1胃印戒细胞癌细胞株的gc-006-03建立

抽取胃印戒细胞癌患者腹水，采用1.077g密度的percoll溶液分离细胞。经1640培养基(含10％胎牛血清，10mM HEPES,100U/ml青霉素G、100μg/ml硫酸链霉素和0.25μg/ml两性霉素B)，置37℃，5％CO2培养箱中进行体外细胞传代培养，建立了胃印戒细胞癌细胞系gc-006。

建立细胞株：我们采取先将gc-006细胞系的细胞进行系列稀释，以100-2000个/皿分别接种在5个10cm培养皿中，用1640培养基(同上)，置37℃，5％CO2培养箱中培养7-10天。此时细胞呈分散而富有活力的单克隆状。然后精准挑选单克隆细胞，挑克隆无需加胰酶，直接用枪头挑选出单克隆细胞。先在poly-L-sine包被的24孔板中培养，使细胞易贴壁成活。然后根据培养液pH变化,每隔2-3天进行半量换液。细胞长满瓶底的80-90％，及时传代，传代比例1：4～1：2。传代细胞时用0.05％胰酶消化5分钟，细胞变圆，轻拍培养瓶2次，使细胞脱壁，迅速加入10-20倍HBSS液(含钙镁的Hank’s液)终止消化，离心1000g,3min,弃除上清液，重悬细胞，转入新培养基。逐渐扩增培养至10⁸-10⁹细胞量，采用10％DMSO冷冻保护剂，液氮保存。以上方法成功地建立了一株能够连续传代的高纯度的胃印戒细胞癌细胞株，命名为gc-006-03。经实验证实，gc-006-03细胞株可传代达>100代，细胞性状仍保持稳定。

实施例2胃印戒细胞癌细胞株gc-006-03的生物学特性检测

1、细胞形态学：

(1)活细胞观察：细胞传代生长稳定后，在相差显微镜下观察。细胞呈贴壁重叠生长，无接触抑制现象(图1)。

(2)HE染色：细胞传至31代，细胞数达10⁶-10⁷时，进行石蜡包埋切片，HE染色镜下观察。见细胞呈恶性类上皮样形态，核质比例大，核仁多个，细胞有大小不等的核，易见核分裂相，仍可见一定数量的印戒细胞(图2)。

(3)透射电镜观察：细胞内核糖体少,粗面内质网丰富，高尔基复合体囊状扩张,形态多变，胞浆内突出的特征为粘液颗粒较丰富；常染色质丰富，核仁明显。表面有微绒毛，排列凌乱，长短不一(图3)。

2﹑细胞免疫组化：

该细胞角蛋白表达阳性(图4)，胞浆角蛋白染成棕褐色，胞膜胞核未着褐色；波形蛋白表达阴性，胞浆无棕褐色染色(图5),符合上皮来源特性。

由于gc-006-03取材于有肺和淋巴结转移的胃印戒细胞癌患者的腹水中，ck7、ck20和ttf1联合检测是区别肺源还是胃源细胞的重要方法之一，本细胞呈现ck7(2+)(图6)、ck20(-)(图7)和ttf1(-)(图8)，结果符合胃源性的肿瘤细胞。另外还观察了Li-cad(+)(图9)、cdx2(2+)(图10)、CEA(3+)(图11)、Ki-67阳性率约45％(图12)，进一步展示该细胞的相关肿瘤生物特性。

3、细胞生长曲线测定：取处于对数生长期的第7代细胞制成1×10³/ml的单细胞悬液，然后按照1000ul/孔接种于24孔板，做了5个复孔。置于JuLi Stage实时细胞计数仪上进行细胞计数，每小时记录一次，共记录8天。以细胞融合度和时间绘制生长曲线(图13)。按公式(PDT)＝(t-t0)〔lg2/(lgNt-lgN0)〕计算倍增时间，gc-006-03细胞平均倍增时间约为36h。

4、软琼脂集落形成实验：用0.6％低熔点琼脂糖－1640培养基覆盖6cm培养皿制备底层琼脂，加入0.5ml含1000个细胞的0.3％的低熔点琼脂－1640为培养基上层琼脂。置37℃、5％CO2培养箱中培养14天，计数含50个以上细胞的集落，计算细胞集落形成率。集落形成率＝克隆数/接种细胞数×100％。结果显示为70％。

5、种板效率：接种分散均匀的第4代细胞，每100个细胞/6cm平皿中，设置3个平行对照，培养9天。培养结束后先用甲醇固定，再加适量结晶紫染色，计数含50个以上细胞的克隆数。种板效率＝形成集落数目/接种细胞数×100％。结果显示：种板效率约等于88％(图14)。

6、染色体分析：分别取对数生长期的第5、10、25代细胞作核型分析。细胞经秋水仙素作用2h，经0.075mol/L KCl低渗，甲醇－冰醋酸固定处理，冰湿片滴片，室温老化后用胰酶处理，Giemsa染色显带分析。结果显示：本细胞系染色体众数介于38～57条之间。二倍体及亚二倍体细胞(23<染色体数≤46)占17％，三倍体及亚三倍体细胞(46<染色体数≤69)占86％，为稳定的亚三倍体细胞系，多为50～53条染色体(占58.5％)。54条染色体核型分析：xxx,+6,+7+7,+11,+18,+20，可见细胞染色体异位、衍生染色体、双着丝点和不明来源染色体等现象(图15a和15b)。其他核型分析还有+8，+9，+9，+10。可见本细胞株具有恶性肿瘤细胞的特征。

7﹑短串联重复序列(short tandem repeat，STR)又称为微卫星DNA，是指染色体上，由数个碱基对作为核心单位(2-6个碱基对)，串联重复形成的一类DNA序列(重复次数为10～60多次，基因片段在400碱基对以下)；每个核心单位重复的次数会出现个体差异，从而形成片段长度不同的等位基因。因此，一组STR序列的重复次数在不同个体中几乎是唯一的，是个体的基因身份特征，也是细胞生物学对细胞身份和来源进行鉴定的主要方法。本细胞株的STR细胞鉴定是采用Goldeneye20A试剂盒，使用ABI3730xd仪进行毛细管电泳，GeneMapper4.0软件进行分析而得。

8、免疫缺陷小鼠体内成瘤实验：取4周龄雄性BALB/C小鼠5只，在鼠背皮下分别注射一侧肩部和对侧臀部，每个位点5×10⁷个/ml细胞注射100ul，裸鼠皮下接种细胞后1周，即可见移植瘤长出。5只裸鼠全部成瘤，移植瘤呈结节状，与皮肤有粘连(图16)。颈椎脱臼法处死裸鼠，取出移植瘤，福尔马林固定，石蜡包埋切片，HE染色。裸鼠体内成瘤标本镜下观察细胞生长旺盛，细胞核增大，深染，异型性明显，可见少量的印戒状细胞(图17)。

9、肿瘤的病理切片：取患者胃肿瘤组织进行活检，福尔马林常规固定、石蜡包埋后切片及HE染色。结果显示：没有明显的癌巢，呈弥漫浸润性生长。癌细胞分泌粘液但多不排出到细胞外，由于胞浆内粘液增多，细胞核多被挤压到细胞的一侧周边，使癌细胞呈印戒状。这种印戒细胞>50％，符合WHO的胃印戒细胞癌诊断标准(图18)。

以上所述仅为本发明的优选实施方式，并不用以限制本发明，本发明的范围由权利要求书以及其等同替换方式所限定，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。